Name: Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę FRET do badania translokacji efektorów przez Coxiella burnetii przy użyciu wyciszania siRNA. Technika łączy wyciszanie genów z testem reporterowym, umożliwiając analizę interakcji patogen-gospodarz w mikrobiologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Health and Medical Research Council (NHMRC) (Grant ID 1062383 i 1063646) przyznane HJN. EAL jest wspierany przez Australian Postgraduate Award.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Systemy wydzielania i bakteryjne białka efektorowe, które te systemy transportują do cytoplazmy komórek gospodarza, są ważnym składnikiem wirulencji, który wiele bakterii chorobotwórczych wykorzystuje do ustanowienia infekcji w unikalnych niszach replikacyjnych. Wiele grup badawczych skupiło się na zbadaniu wzajemnych oddziaływań między efektorami bakteryjnymi a białkami gospodarza oraz wpływu tych efektorów na szlaki komórkowe gospodarza. Bardzo ograniczone badania, jeśli w ogóle, dotyczyły potencjału białek gospodarza ...

Coxiella burnetii to unikalny wewnątrzkomórkowy patogen, który powoduje odzwierzęcą infekcję człowieka gorączką Q. Choroba ta wiąże się z szerokim spektrum objawów klinicznych, począwszy od bezobjawowej serokonwersji do zagrażającej życiu przewlekłej infekcji, która często objawia się zapaleniem wsierdzia wiele lat po ekspozycji1. Do zakażenia człowieka dochodzi głównie poprzez wdychanie skażonych aerozoli z przeżuwaczami, które są głównym rezerwuarem infekcji, w szczególności krów mlecznych, owiec i kóz. Chociaż zakażenie Coxiella u tych zwierząt jest zazwyczaj subkliniczne, zakażenie może wywołać poronienie, a znaczne obciążenie bakteryjne w płynie porodowym i łożysku może zanieczyścić lokalne środowisko1. Przykładem ogromnego obciążenia, jakie takie zanieczyszczenie może stanowić zarówno dla zdrowia publicznego, jak i dla przemysłu rolnego, była niedawna epidemia gorączki Q, która miała miejsce w Holandii2. W latach 2007-2010 zdiagnozowano ponad 4000 przypadków gorączki Q u ludzi, a wybuch epidemii był związany ze znacznym zanieczyszczeniem ferm kóz3. Ponadto Coxiella jest potencjalną bronią biologiczną, zgodnie z klasyfikacją amerykańskich Centrów Kontroli i Prewencji Chorób, ze względu na stabilność środowiskową bakterii i niską dawkę zakaźną niezbędną do spowodowania ciężkiej zachorowalności i śmiertelności4.
Coxiella istnieje w dwóch fazach: organizmy fazy I, wyizolowane z naturalnych źródeł, są niezwykle zjadliwe, a organizmy fazy II są bardzo osłabione in vivo. Na przykład, po kilku pasażach in vitro organizmów Coxiella burnetii Nine Mile Phase I, wyprodukowano bakterie fazy II, które zawierają nieodwracalną delecję chromosomalną skutkującą skróceniem lipopolisacharydu (LPS)5. Szczep ten, C. burnetii NMII, jest fenotypowo podobny do fazy I w modelach hodowli tkankowych i stanowi bezpieczniejszy model dla naukowców do badania patogenezy Coxiella w laboratoriach5. W ostatnich latach kilka przełomowych odkryć przyczyniło się do szybkiego postępu w dziedzinie genetyki Coxiella. Przede wszystkim rozwój pożywki aksenowej (zakwaszonej pożywki cysteinowej cytrynianowej - ACCM-2) umożliwił bezkomórkowy wzrost Coxiella zarówno w cieczy, jak i na pożywkach stałych6,7. Zaowocowało to bezpośrednim ulepszeniem narzędzi genetycznych dostępnych dla Coxiella, w tym indukowalnego systemu ekspresji genów, wektorów wahadłowych i losowych systemów transpozonów8-11. Ostatnio opracowano również dwie metody celowanej inaktywacji genów, torując drogę do badania określonych kandydatów na geny wirulencji12.
Po internalizacji przez makrofagi pęcherzykowe, Coxiella replikuje się do dużej liczby w obrębie błony komórkowej komory zwanej wakuolą zawierającą Coxiellę (CCV). CCV wymaga transportu endocytarnego gospodarza przez wczesne i późne endosomy, aż dojrzeje do organelli pochodzącej z lizosomów13. W trakcie tego procesu CCV nabywa czynniki gospodarza, które albo pojawiają się przejściowo, albo pozostają związane z wakuolą, w tym między innymi Rab5, Rab7, CD63 i LAMP-113-15. Replikacja Coxiella w komórkach gospodarza jest całkowicie zależna od w pełni funkcjonalnego systemu wydzielania IVB typu Dot / Icm (T4SS)8,16,17. Ten system wydzielania jest strukturą wielobiałkową, spokrewnioną przodkowo z systemami koniugacyjnymi i obejmuje zarówno błony bakteryjne, jak i wakuolarne, aby dostarczyć białka bakteryjne, zwane efektorami, do cytoplazmy gospodarza18. Coxiella T4SS jest funkcjonalnie bardzo podobna do dobrze scharakteryzowanego systemu wydzielania typu IVB Dot/Icm Legionella pneumophila19,20. Co ciekawe, aktywacja T4SS i późniejsza translokacja efektorowa nie zachodzi, dopóki Coxiella nie dotrze do organelli pochodzących z kwaśnych lizosomów, około 8 godzin po zakażeniu17,21. Do tej pory zidentyfikowano ponad 130 efektorów Dot/Icm9,17,22-24. Wiele z tych efektorów prawdopodobnie odgrywa ważną rolę podczas replikacji Coxiella w komórkach gospodarza; Jednak tylko kilka efektorów zostało funkcjonalnie scharakteryzowanych25-29.
W tym badaniu wykorzystujemy test translokacji oparty na fluorescencji, który opiera się na rozszczepieniu substratu CCF2-AM FRET (zwanego dalej substratem BlaM) poprzez aktywność β-laktamazy w cytoplazmie komórki gospodarza (Rysunek 1). Interesujący gen jest połączony z TEM-1 β-laktamazą (BlaM) na plazmidzie reporterowym, który zapewnia konstytutywną ekspresję. Substrat BlaM składa się z dwóch fluoroforów (kumaryny i fluoresceiny), które tworzą parę FRET. Wzbudzenie kumaryny powoduje FRET emisji fluoresceiny i zielonej fluorescencji przy braku translokacji efektorowej; jednakże, jeśli białko fuzyjne efektora BlaM jest translokowane do cytoplazmy gospodarza, wynikowa aktywność β-laktamazy rozszczepia pierścień β-laktamowy substratu BlaM, oddzielając parę FRET, wytwarzając emisję niebieskiej fluorescencji po wzbudzeniu. Ten test translokacji został dobrze sprawdzony jako podejście do identyfikacji białek efektorowych z szeregu różnych bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, w tym C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogennej E. coli, Salmonelli i Brucella17,30-35.
Aby określić rolę określonych czynników gospodarza w translokacji efektorowej Coxiella, używamy dobrze znanej metody wyciszania genów znanej jako interferencja RNA, w szczególności małego interferującego RNA (siRNA). Pierwotnie zidentyfikowana u Caenorhabditis elegans, interferencja RNA jest konserwatywnym endogennym procesem komórkowym wykorzystywanym do wrodzonej obrony przed wirusami, a także do regulacji genów36,37. Po związaniu specyficznego dla sekwencji siRNA, degradacja mRNA zachodzi przez RISC (kompleks wyciszający indukowany RNA), co skutkuje specyficznym wyciszeniem genu lub knockdownem38. W tym badaniu siRNA wykorzystano do celowania w dwa białka gospodarza, Rab5A i Rab7A, które są ważnymi regulatorami szlaku endocytarnego. Wpływ wyciszenia Rab5A i Rab7A na translokację efektorową ustalono za pomocą C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 został wybrany, ponieważ wcześniej wykazano, że jest translokowany przez system wydzielania Dot/Icm Coxiella17.
Wykorzystując zarówno wyciszanie genów siRNA, jak i opisany tutaj test translokacji oparty na fluorescencji, zaczynamy ustalać rolę czynników gospodarza w translokacji białek efektorowych przez Coxiella. Podejście to można zastosować do szerokiej gamy bakterii zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych, które posiadają podobne systemy wydzielania odpowiedzialne za translokację białek efektorowych.

<table><tbody><tr><td><silny>Odczynniki</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 medium składnik</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Siarczan żelaza</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Bacto-neopepton</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium składnik</td></tr><tr><td>Casamino acidy</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Beta-cyklodekstryna metylowa</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Do hodowli bakteryjnych</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Kontrola nieukierunkowana Pula (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>Kontrola nieukierunkowana</td></tr><tr><td>siGENOME Ludzki PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Powoduje śmierć komórki; miara skuteczności transfekcji</td></tr><tr><td>siGENOME Ludzki RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Ludzki RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Użyj sterylnej wody wolnej od RNaz do rozcieńczenia 5x bufor siRNA do 1x buforu siRNA</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Pożywka o zredukowanej surowicy używana do transfekcji</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Do hodowli komórkowych i infekcji</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Można użyć alternatywnego równoważnego produktu</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Do przechowywania szczepu Coxiella</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Do rozcieńczania próbek i wzorców do qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>Może używać alternatywnego równoważnego produktu do ekstrakcji gDNA</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>Może używać alternatywnego odpowiednika produktu qPCR master mix do reakcji qPCR</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Zestaw ładujący z CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>Do pomiaru translokacji za pomocą fluorescencji i wytwarzania roztworu ładującego 6X (zawiera roztwór A, B, C i DMSO)</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>Składnik roztworu probenicydu</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Składnik roztworu probenicydu</td></tr><tr><td>di-Wodorortofosforan sodu</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Roztwór probenicydu składnik</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Składnik roztworu probenicydu</td></tr><tr><td>DRAQ5 Roztwór sondy fluorescencyjnej (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Barwienie jąder w celu określenia żywotności komórek. Stosować 1:4000 rozcieńczony w PBS.&nbsp;</td></tr><tr><td>4% roztwór PFA (paraformaldehydu) w PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Roztwór utrwalający do komórek HeLa 229</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych 25 cm2 z wentylowaną nasadką</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Do wzrostu szczepu bakteryjnego</td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear Czarne mikropłytki z polistyrenu poddanego działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba do hodowli tkankowych z wentylowaną nasadką</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Do wzrostu komórek HeLa 229</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych 175 cm2 z wentylowaną nasadką</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>Do wzrostu komórek HeLa 229</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td>Do oznaczania ilościowego komórek HeLa 229</td></tr><tr><td>Płytki Tear-A-Way 96 Well PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>Do qPCR Łańcuch reakcyjny</td></tr><tr><td>8-wieczkowy, płaski</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>Do reakcji qPCR</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny><</td><td>silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge</td><td></td><td></td><td></td> stołowy</tr><tr><td>Wir</td><td></td><td></td><td></td>stołowy</tr><tr><td>Mieszalnik</td><td></td><td></td><td></td>orbitalny</tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Do granulowania kultur bakteryjnych</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>Do kwantyfikacji gDNA</td></tr><tr><td>Maszyna Mx3005P QPCR</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>Do oznaczania ilościowego genomów Coxiella w 7-dniowej hodowli</td></tr><tr><td>Mikropłytka ClarioSTAR czytnik</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>Do pomiaru fluorescencji</td></tr></tbody></table>

zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (fret) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez coxiella burnetii podczas wyciszania sirna

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, czynnik wywołujący gorączkę Q, jest wewnątrzkomórkowym patogenem, który opiera się na systemie wydzielania Dot/Icm typu IV, aby stworzyć niszę replikacyjną. Kohorta efektorów jest translokowana przez ten system do komórki gospodarza w celu manipulowania procesami gospodarza i umożliwienia ustanowienia unikalnej wakuoli pochodzącej z lizosomów do replikacji. Przedstawiona tutaj metoda polega na połączeniu dwóch dobrze znanych technik: specyficznego wyciszania genów za pomocą siRNA i pomiaru translokacji efektorowej za pomocą substratu opartego na FRET, który opiera się na aktywności β-laktamazy. Stosując te dwa podejścia, możemy zacząć rozumieć rolę czynników gospodarza w funkcjonowaniu bakteryjnego systemu wydzielania i translokacji efektorowej. W tym badaniu zbadaliśmy rolę Rab5A i Rab7A, obu ważnych regulatorów szlaku transportu endocytarnego. Wykazaliśmy, że wyciszenie ekspresji któregokolwiek z białek powoduje spadek wydajności translokacji efektorowej. Metody te można łatwo modyfikować w celu zbadania innych patogenów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, które również wykorzystują systemy wydzielnicze. W ten sposób można uzyskać globalny obraz czynników gospodarza zaangażowanych w translokację efektorową bakterii.

W niniejszym badaniu wybrano szczep C. burnetii pBlaM-CBU0077, ponieważ wcześniej wykazano, że CBU0077 jest translokowanym efektorem systemu sekrecji Dot/Icm bakterii Coxiella17. Przed infekcją określono całkowitą liczbę genomów/ml w siedmiodniowej hodowli C. burnetii pBlaM-CBU0077 za pomocą qPCR. Rysunek 4 przedstawia przykład wartości progu cyklu (Ct) oczekiwanych dla standardów oraz próbek po przeprowadzeniu qPCR. Wartości Ct (prze...

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest zbadanie wpływu specyficznych procesów gospodarza na zdolność patogenów bakteryjnych do translokacji białek efektorowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii komórkowej, a konkretnie w kwestii tego, w jaki sposób gospodarz uczestniczy w blokowaniu lub promowaniu dostarczania bakteryjnych efektorów wirulencji do komórki gospodarza.Główną zaletą tej techniki jest połączenie dwóch uznanych metod: wyciszania genów za pomocą siRNA oraz testu reporterowego do pomiaru translokacji białek bakteryjnych, w celu zbadania oddziaływań między patogenami a komórką eukariotyczną.Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie patogenezy coxielli i może być również zastosowana do badania interakcji między gospodarzem a patogenem w przypadku innych bakterii, które zależą od wydajnej translokacji białek. Przykładem są chlamydia, salmonella oraz przywierająca i wnikająca E.coli. Po wyhodowaniu C.burnetii wykazującej ekspresję CBU0077, należy przeprowadzić fuzję beta-laktamazy zgodnie z protokołem tekstowym w kolbie hodowlanej o powierzchni 25 cm² z odpowietrzaną zakrętką.Zaszczep 10 mililitrów uprz

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji mRNA związanych z retikulum endoplazmatycznym w komórkach hodowli tkanek ssaków. Technika ta polega na selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej digitoniną w celu usunięcia zawartości cytoplazmatycznej, a następnie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia masowych mRNA poli(A) lub specyficznych transkryptów.

Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Ten artykuł opisuje dwukolorowe znakowanie długich RNA na końcach i ich unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację w pęcherzykach fosfolipidowych dla zastosowań mikroskopii pojedynczej cząsteczki FRET TIRF. Połączenie tych technik umożliwia precyzyjną wizualizację i analizę dynamiki RNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

Poznaj metodę FRET do badania translokacji efektorów przez Coxiella burnetii przy użyciu wyciszania siRNA. Technika łączy wyciszanie genów z testem reporterowym, umożliwiając analizę interakcji patogen-gospodarz w mikrobiologii komórkowej.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Przeglądaj więcej filmów