Name: Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę wlewu oligomerów beta-amyloidu do hipokampu szczura z wykorzystaniem pomp osmotycznych do testowania immunoterapii przeciwko neurodegeneracji w modelu choroby Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Caroline Bouchard z ośrodka dla zwierząt za pracę na szczurach. A.S. posiada stypendium mistrzowskie J.A. De Sève, a B.P. stypendium COPSE na Université de Montréal Ta praca została sfinansowana z grantów przyznanych J.B. z FRQS-Pfizer i funduszy start-up z Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.

Oświadczenie etyczne: Protokół dla zwierząt dla tego projektu uzyskał aprobatę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowanie cewnika przed operacją stereotaktyczną
<ol>
	<li>Wytnij cewniki PE50 (o długości 6 cm), które będą używane do łączenia kaniuli z pompami osmotycznymi (patrz rysunek 1A). Napełnij cewniki PE50 sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) i uszczelnij oba końce cewników. Cewnik należy utrzymywać w temperaturze 4°C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Implantacja kaniuli metodą stereotaksji
<ol>
	<li>Operację należy wykonać w sterylnych warunkach. Wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne przez autoklawowanie. Dokładnie wyczyść aparat stereotaktyczny i obszar roboczy i zdezynfekuj 70% roztworem etanolu. Noś maskę chirurgiczną, czepek do włosów i sterylne rękawiczki.</li>
	<li>Znieczulenie szczurów należy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) roztworu ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg i 10 mg/kg). Potwierdź znieczulenie, sprawdzając ruch po delikatnym uszczypnięciu palca</li>.
	<li>Niesteroidowy lek przeciwzapalny (meloksykam; 1 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie (s.c.) znieczulonemu zwierzęciu co najmniej 30 minut przed zabiegiem.</li>
	<li>Ogolić głowę zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia i trzykrotnie zdezynfekować skórę roztworem glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Umieść zwierzę na ramie stereotaktycznej z nausznikami. Zamocuj jedną kaniulę na ramieniu uchwytu ramy stereotaktycznej. Wstrzyknąć (s.c.) środek znieczulający miejscowo (bupiwakaina (1,5 mg/kg) i lidokaina (1,5 mg/kg) w czubek głowy. Znieczulenie utrzymuje się podczas całego zabiegu poprzez umieszczenie stożka nosowego dostarczającego 3% izofluranu. Całe pole operacyjne powinno być zasłonięte, ale nie zrobiono tego tutaj, aby lepiej zademonstrować technikę.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o długości 3 cm na czubku głowy za pomocą skalpela. Zamontuj 4 zaciski wokół nacięcia, aby czaszka była czysta. Za pomocą nożyczek z okrągłą końcówką zrób kieszeń (2 x 2 cm2) pod skórą między łopatkami zwierzęcia.</li>
	<li>Zeskrob okostną czaszki ostrzem. Nałóż gazik na czaszkę w przypadku krwawienia.</li>
	<li>Sprawdź, czy czaszka jest płaska i dobrze wyrównana na ramie stereotaktycznej. Aby upewnić się, że czaszka jest płaska, sprawdź współrzędne wysokości na bregmie i na lambdzie. Weź współrzędne bregmy, które będą używane jako punkt odniesienia.</li>
	<li>Zaczynając od bregmy, oblicz współrzędne dwóch kaniul prowadzących, które zostaną wszczepione obustronnie w hipokampie (przednio-tylna: - 0,42 cm; przyśrodkowo-boczna: ± 0,30 cm; grzbietowo-brzuszna: - 0,28 cm zgodnie z atlasem mózgu szczura Paxinosa i Watsona)29. Wskaż położenie kaniuli za pomocą markera.</li>
	<li>Wywierć otwór (0,5 mm) w czaszce w miejscu implantacji obu kaniuli. Wywierć dwa inne otwory około 5 mm powyżej i poniżej tych punktów, aby wkręcić, które zestalą kaniulę podczas nakładania cementu dentystycznego.</li>
	<li>Odetnij skalpelem jeden koniec cewnika wypełnionego wcześniej płynem mózgowo-rdzeniowym i włóż go do ramienia kątowego kaniuli. Zamocuj pierwszą kaniulę za pomocą cementu dentystycznego. Unikaj umieszczania cementu dentystycznego wokół pozycji na drugiej kaniuli.</li>
	<li>Pozostaw cement dentystyczny do wyschnięcia na 2-3 minuty, a następnie zdejmij ramię uchwytu z pierwszej kaniuli i zamocuj w niej drugą kaniulę. Powtórz kroki 2.11 i 2.12. Umieść atrapę kaniuli na obu kaniulach prowadzących. Upewnij się, że manekin i kaniula prowadząca są tej samej długości, aby zapobiec infiltracji tkanek i zablokowaniu kaniuli.</li>
	<li>Włożyć wolny koniec obu cewników do kieszeni utworzonej wcześniej między łopatkami zwierzęcia. Zdejmij zaciski i zszyj skórę nicią do szwów 4-0, 
	UWAGA: Górna kaniula prowadząca musi być dostępna dla nadchodzących infuzji Aβo.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je z powrotem w klatce. Podczas rekonwalescencji pooperacyjnej umieść klatkę na podgrzewającym kocu wodnym, aż zwierzę się obudzi. Klatka powinna być częściowo na podkładce, aby szczur mógł w razie potrzeby odsunąć się od ciepła. Stale monitoruj zwierzę, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
	<li>Szczury należy zwrócić do obiektu dla zwierząt w celu rekonwalescencji po operacji przez 10 dni pod ścisłym nadzorem. 
	UWAGA: Nie zwracaj zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Meloksykam (1 mg/kg mc.) podaje się raz na dobę przez dwa dni po zabiegu chirurgicznym w celu leczenia bólu.</li>
</ol>
3. Instalacja pompy osmotycznej
<ol>
	<li>Na dzień przed montażem napełnić pompy osmotyczne przeciwciałem 6E10 (1 mg/ml; 100 μl) i przeciwciałem kontrolnym IgG1 (1 mg/ml; 100 μl) zgodnie z instrukcjami producenta w sterylnych warunkach. Pompki należy przechowywać przez noc w sterylnej wodzie destylowanej o temperaturze 37 °C, aby aktywować pompy.</li>
	<li>Znieczulij szczury izofluranem 3% w celu zainstalowania pomp osmotycznych (0,5 μl/h przez 7 dni). Ogol się między łopatkami i zdezynfekuj skórę roztworem glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%. Wykonaj nacięcie o długości 2 cm skalpelem między łopatkami, aby zlokalizować cewniki PE50 połączone z kaniulą prowadzącą.</li>
	<li>Odetnij koniec cewników PE50 zawierających cement dentystyczny za pomocą skalpela. Podłącz pompy osmotyczne do cewników PE50 i dodaj trochę cementu dentystycznego na złączu pompy i cewnika, aby zabezpieczyć połączenie.</li>
	<li>Zszyj szczelnie skórę nicią do szwów 4-0. Umieść zwierzę z powrotem w klatce na podgrzewanej poduszce wodnej. Obserwuj, jak zwierzę szybko budzi się po znieczuleniu izofluranem (około 5 min). 
	UWAGA: Zabieg trwa około 5 do 10 minut.</li>
</ol>
4. Napary Aβo u obudzonych i swobodnie poruszających się szczurów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Aβo (0,2 μg/μl) zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. 28,30 Pozostawić Aβo do dynamicznej i spontanicznej agregacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed infuzją.</li>
	<li>Zainstalować dwie strzykawki o pojemności 10 μl na pompie infuzyjnej. Napełnić strzykawki 5 μl sterylnej wody destylowanej. Przyciąć skalpelem dwa cewniki PE50 do długości około 60 cm. Napełnij oba cewniki sterylną wodą destylowaną za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml i igieł 21G.</li>
	<li>Strzykawki o pojemności 1 ml należy trzymać na jednym końcu cewnika, a drugi koniec podłączyć do strzykawek Hamiltona. Wyjąć strzykawki o pojemności 1 ml i sprawdzić, czy w cewnikach nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wprowadzić kaniulę wewnętrzną na końcu cewników PE50. Używając sterylnej wody destylowanej, napełnij wewnętrzną kaniulę podłączoną do cewników PE50 do 1 μl na strzykawkach Hamiltona. Utworzyć pęcherzyk powietrza, odciągając tłoki do tyłu do 2 μl.</li>
	<li>Wymieszać roztwór Aβo, pipetując w górę i w dół, używając końcówki o minimalnej przyczepności. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania. Napełnij obie kaniule wewnętrzne 1,5 μl roztworu Aβo, odciągając tłoki do 3,5 μl.</li>
	<li>Wykonaj linie markerem przed i po pęcherzyku powietrza wykonanym w obu cewnikach. Służy to jako punkt kontrolny trwającej infuzji. Do infuzji należy zbliżyć klatkę do pompy infuzyjnej i zdjąć jej pokrywę.</li>
	<li>Umieść szczura w przytulnym miejscu i mocno zeskrob ramię przytuliska wokół jego szyi, aby unieruchomić głowę szczura. Wyjmij atrapę kaniuli z dwóch kaniul prowadzących. Wprowadzić przygotowaną wcześniej kaniulę wewnętrzną do kaniuli prowadzącej. Sprawdź, czy są całkowicie włożone i dobrze przymocowane do podstawy kaniuli prowadzącej.</li>
	<li>Uwolnij szczura z przytulanki i umieść go z powrotem w klatce, aby ograniczyć stres związany z rywalizacją. Należy uważnie monitorować, aby upewnić się, że cewniki nie skręcają się ze sobą, a infuzja jest wykonywana prawidłowo.</li>
	<li>Włączyć pompę infuzyjną. Wstrzyknąć 1 μl roztworu Aβo z szybkością 0,1 μl/min (10 min). Podczas infuzji należy sprawdzić, czy tłok strzykawki porusza się z 3,5 μl do 2,5 μl i czy pęcherzyki powietrza w obu cewnikach PE50 poruszają się w sposób ciągły.</li>
	<li>Pozostaw wewnętrzną kaniulę na miejscu na kolejne 5 minut po infuzji, aby umożliwić skuteczną dyfuzję roztworu Aβo. Przyłóż szczura z powrotem do przytuliska, aby usunąć kaniulę wewnętrzną i zaślepioną kaniulę prowadzącą, aby zapobiec refluksowi wstrzykniętego roztworu. Użyj atrapy kaniuli, która zatrzymuje się tuż przed ramieniem kątowym kaniuli. Włóż zwierzę do klatki.</li>
	<li>Powtarzaj infuzję Aβo raz dziennie przez 6 kolejnych dni. Poddaj zwierzę eutanazji przez ścięcie.</li>
</ol>

<ol><li>Hardy, J. A., Higgins, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis.</a> Science. 256, 184-185 (1992).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+theory+for+Alzheimer%27s+disease.+Hypothesis%3A+Alzheimer%27s+disease+is+caused+by+the+cerebral+accumulation+and+cytotoxicity+of+amyloid+beta-protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive theory for Alzheimer's disease. Hypothesis: Alzheimer's disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).</li>
<li>Terry, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+cognitive+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%3A+synapse+loss+is+the+major+correlate+of+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment.</a> Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).</li>
<li>Giannakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangle+and+neuron+numbers%2C+but+not+amyloid+load%2C+predict+cognitive+status+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer's disease.</a> Neurology. 60, 1495-1500 (2003).</li>
<li>Price, J. L., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangles+and+plaques+in+nondemented+aging+and+%22preclinical%22+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease.</a> Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).</li>
<li>Reiman, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid-beta+burden+in+cognitively+normal+people+at+3+levels+of+genetic+risk+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).</li>
<li>Aizenstein, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+amyloid+deposition+without+significant+cognitive+impairment+among+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly.</a> Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Mc Donald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+sodium+dodecyl+sulphate-stable+Abeta+dimers+is+strongly+associated+with+Alzheimer-type+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia.</a> Brain. 133, 1328-1341 (2010).</li>
<li>Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+fibrillar+oligomer+levels+are+elevated+in+Alzheimer%27s+disease+brain+and+correlate+with+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer's disease brain and correlate with cognitive dysfunction.</a> Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).</li>
<li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+elevated+levels+of+amyloid+beta-peptide+in+the+brain+and+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline.</a> JAMA. 283, 1571-1577 (2000).</li>
<li>Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+double+trouble%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Amyloid double trouble.</a> Nat. Genet. 38, 11-12 (2006).</li>
<li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>McLean, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+pool+of+Abeta+amyloid+as+a+determinant+of+severity+of+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease.</a> Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).</li>
<li>Hepler, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+beta-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry. 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Martins, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+revert+inert+Abeta+amyloid+fibrils+to+neurotoxic+protofibrils+that+affect+learning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice.</a> EMBO J. 27, 224-233 (2008).</li>
<li>Lesne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+amyloid-beta+protein+assembly+in+the+brain+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory.</a> Nature. 440, 352-357 (2006).</li>
<li>Hung, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+peptide+%28Abeta%29+neurotoxicity+is+modulated+by+the+rate+of+peptide+aggregation%3A+Abeta+dimers+and+trimers+correlate+with+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity.</a> J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).</li>
<li>Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-neurotoxicity+relationships+of+amyloid+beta-protein+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 14745-14750 (2009).</li>
<li>Lambert, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible%2C+nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).</li>
<li>Shankar, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+protein+dimers+isolated+directly+from+Alzheimer%27s+brains+impair+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory.</a> Nat. Med. 14, 837-842 (2008).</li>
<li>Shankar, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+oligomers+of+the+Alzheimer+amyloid-beta+protein+induce+reversible+synapse+loss+by+modulating+an+NMDA-type+glutamate+receptor-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway.</a> J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).</li>
<li>Cleary, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+oligomers+of+the+amyloid-beta+protein+specifically+disrupt+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function.</a> Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).</li>
<li>Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+secreted+oligomers+of+amyloid+beta-protein+on+hippocampal+synaptic+plasticity%3A+a+potent+role+for+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers.</a> J. Physiol. 572, 477-492 (2006).</li>
<li>Gomez-Isla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+loss+of+layer+II+entorhinal+cortex+neurons+occurs+in+very+mild+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).</li>
<li>DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+correlates+of+cognition+in+dementia%3A+quantification+and+assessment+of+synapse+change%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change.</a> Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).</li>
<li>Brouillette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Soluble+Abeta+Oligomers+on+Neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer's Disease.</a> Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).</li>
<li>Brouillette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicity+and+memory+deficits+induced+by+soluble+low-molecular-weight+amyloid-beta1-42+oligomers+are+revealed+in+vivo+by+using+a+novel+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model.</a> J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. New York. Fourth edition (1998).</li>
<li>Broersen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+and+biocompatible+preparation+of+aggregate-free+amyloid+beta+peptide+for+biophysical+and+biological+studies+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer's disease.</a> PEDS. 24, 743-750 (2011).</li>
<li>Thakker, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+amyloid-beta+antibodies+reduce+cerebral+amyloid+angiopathy+and+associated+micro-hemorrhages+in+aged+Tg2576+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).</li>
<li>Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and anesthesia.</a> Front. Neurosci. 4, 272(2011).</li>
<li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia%3A+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li>
</ol>

Publikacja tego artykułu wideo jest sponsorowana przez ALZET Osmotic Pumps.

W tym protokole istnieją krytyczne kroki, które wymagały szczególnej uwagi. Podczas wszczepiania kaniuli należy unikać wkładania cementu dentystycznego, gdy jest on zbyt płynny, aby zapobiec zablokowaniu otworu drugiej kaniuli. Ważne jest, aby umieścić cement dentystyczny na wolnym końcu cewnika P50 podłączonego do pompy, aby zapobiec podrażnieniu i możliwej reakcji zapalnej. W dniu operacji stereotaktycznej użyj atrapy kaniuli o tej samej długości co kaniula prowadząca, aby uniknąć zablokowania kaniuli. Jednak po zainstalowaniu pomp należy użyć krótszej atrapy kaniuli, która zatrzymuje się przed ramieniem kątowym kaniuli, aby umożliwić prawidłowe wlanie roztworu z pompy do hipokampa. Należy uważnie monitorować infuzje Aβo i sprawdzić, czy pęcherzyki powietrza wykonane w cewnikach poruszają się w sposób ciągły podczas infuzji. Zawsze upewnij się, że kaniula iniekcyjna jest całkowicie włożona do kaniuli prowadzącej podczas infuzji.
Jeśli podczas infuzji Aβ wystąpi problem, sprawdź, czy kaniula wewnętrzna nie jest zablokowana. W takim przypadku przepłucz sterylną wodę destylowaną przez wewnętrzną kaniulę. Jeśli kaniula prowadząca jest zatkana, zamień kaniulę wewnętrzną w kaniulę prowadzącą. W przeciwnym razie poruszaj wewnętrzną kaniulą w górę iw dół. Kłótnia w przytulaniu może być stresująca dla szczurów, zwłaszcza pierwszego dnia. Aby zmniejszyć stres zwierzęcia, zalecamy manipulowanie i przyzwyczajanie szczurów do przytulania się przed operacją stereotaktyczną.
To nowatorskie i elastyczne podejście in vivo ma wiele zalet. Rzeczywiście, charakter wstrzykniętego Aβo można dokładnie kontrolować przed infuzją, a różne rodzaje preparatów Aβ (na przykład roztwory syntetyczne i roztwory Aβ pochodzące z mózgu) mogą być wstrzykiwane w celu oceny ich neurotoksyczności in vivo. Model ten może być również wykorzystany do zbadania mechanizmów, za pomocą których różne gatunki Aβ (np. monomery, oligomery o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej, protofibryle) mogą indukować efekty neurotoksyczne in vivo oraz w jaki sposób terapie, takie jak immunoterapia, mogą przeciwdziałać ich szkodliwemu wpływowi na mózg. Ponieważ napary są wykonywane u obudzonych, swobodnie poruszających się zwierząt, nie ma zakłócającego wpływu między środkami znieczulającymi a roztworem Aβo na szlaki sygnałowe, jak wykazano w poprzednich badaniach. 32,33 Napary u swobodnie poruszających się zwierząt są również zgodne z testami behawioralnymi w dowolnym momencie przed i po infuzjach.
Napary Aβo i instalację pompy można wykonać u zwierząt w różnym wieku, aby określić efekty Aβo i zabiegów podczas starzenia. Ponieważ neurodegeneracja zachodzi w pobliżu miejsca infuzji, utrata synaps i neuronów może być indukowana w różnych i zlokalizowanych obszarach mózgu. Uboczny wlew Aβo i kontroli (nośnik lub mieszanie Aβ) pozwala na kontrolowanie wszelkich zmian w obrębie tego samego zwierzęcia. I odwrotnie, roztwory Aβo lub kontrolne mogą być wstrzykiwane obustronnie w prawy i lewy hipokamp, na przykład podczas testowania zwierząt w zadaniach behawioralnych. Wlew Aβo i leczenie można wykonać jednocześnie lub alternatywnie można zainstalować pompy po infuzji Aβo, aby ocenić, czy leczenie jest skuteczne po osadzaniu Aβ. Ten sam opisany tutaj protokół może być również stosowany podczas wykonywania wlewów Aβo do komór mózgowych. Wpływ Aβo na wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe można ocenić przed i po utracie neuronów w rozsądnie krótkim czasie. Dawkę i liczbę wlewów Aβ można również dostosować, aby uzyskać mniej lub bardziej nasiloną patogenność Aβ.
Chociaż jest bardzo wszechstronna, ta technika ma pewne ograniczenia. Implantacja kaniuli powoduje mechaniczne uszkodzenie tkanki i zapalenie nerwów w ciągu pierwszych kilku dni po operacji. W związku z tym konieczne jest odczekanie co najmniej tygodnia po zabiegu przed rozpoczęciem infuzji Aβo i dodanie odpowiednich kontroli (wstrzyknięcie nośnika lub nieaktywne mieszanie Aβ) w celu uwzględnienia tych zdarzeń. Ponadto tylko niewielka objętość Aβo może być podawana w infuzji, aby ograniczyć dyfuzję roztworu.
Pompy osmotyczne stanowią wygodną i unikalną metodę dostarczania do przedklinicznej walidacji środków zaprojektowanych w celu zapobiegania neurodegeneracji indukowanej przez Aβ. Ponieważ wykazano wcześniej, że immunoterapia przeciwciałem 6E10 zmniejsza akumulację Aβ w mózgu,31 użyliśmy przeciwciała 6E10 jako dowodu słuszności koncepcji, aby potwierdzić nasze nowe podejście in vivo . Zastosowanie pomp osmotycznych w tym modelu może być teraz wykorzystane do opracowania nowych terapii modyfikujących przebieg choroby, które mogłyby zapobiec odkładaniu się i neurotoksyczności Aβo u przedklinicznych pacjentów z AD.

Początkowo proponowano, że nagromadzenie nierozpuszczalnych gatunków Aβ w mózgu jest kluczowe dla patogenezy AD. 1,2 Jednak blaszki amyloidowe są również wykrywane u niektórych zdrowych poznawczo osób w podeszłym wieku. 3-7 Aby przezwyciężyć słabą korelację istniejącą między odkładaniem się blaszki miażdżycowej a deficytami poznawczymi w chorobie Alzheimera, najnowsze doniesienia wykazały obecność toksycznego rozpuszczalnego Aβo na początku choroby, które znacznie lepiej korelują ze stanem klinicznym pacjentów. 8-14 Ponieważ proces oligomeryzacji Aβ jest bardzo dynamiczny, zasugerowano, że neurotoksyczność jest indukowana przez różne Aβo, a nie tylko przez jeden konkretny typ oligomeru. 14-16 Ponieważ wiele badań wykazało, że Aβo może inicjować dysfunkcje synaps przed utratą synaps i neuronów,17-24 obecne teorie wskazują, że leczenie związane z Aβ może być skuteczne we wczesnej chorobie Alzheimera, a nie w późniejszych stadiach, jak testowano do tej pory w badaniach klinicznych.
Jedną z charakterystycznych cech patogenezy AD jest masowa i powszechna śmierć komórek obserwowana w późnych stadiach choroby, oraz znaczna utrata synaps i neuronów obserwowana w zlokalizowanych obszarach mózgu, gdy deficyty pamięci stają się wykrywalne na poziomie klinicznym. Szlak perforacyjny, który wystaje z kory śródwęchowej (EC) do zakrętu zębatego (DG), jest wyraźnie zaburzony na wczesnym początku AD.25,26 W stanie prodromalnym AD, gdy łagodne upośledzenie funkcji poznawczych (MCI) staje się widoczne, wykrywa się znaczną śmierć komórek w EC, a także utratę synaps w DG. Pytania z dnia 25,26
Chociaż duża ilość dowodów wskazuje na toksyczne działanie rozpuszczalnego Aβo we wczesnym okresie naszej ery,8-14 neurodegeneracja wywołana przez Aβo, obserwowana w hodowli neuronalnej lub organotypowej hodowli wycinków mózgu, była trudniejsza do odtworzenia w modelach zwierzęcych. 27 Większość transgenicznych modeli AD z nadekspresją Aβ ma blaszki amyloidowe, hiperfosforylację tau, niedobór synaps i deficyty pamięci. 27 Modele te okazały się jednak znacznie mniej skuteczne w modelowaniu śmierci komórek obserwowanej w hipokampie pacjentów z chorobą Alzheimera. Aby przezwyciężyć te problemy techniczne, opracowaliśmy model oparty na domózgowych wlewach rozpuszczalnego Aβo. Informowaliśmy wcześniej, że powtarzające się wlewy rozpuszczalnego Aβo do hipokampa indukują stopniową utratę neuronów i hiperfosforylację tau, dwie patologiczne cechy charakterystyczne związane ze spadkiem pamięci w AD.28 Tutaj pokazujemy nową metodę testowania terapii AD przy użyciu kaniuli specjalnie zaprojektowanej do jednoczesnych infuzji Aβo i ciągłego wlewu przeciwciała Aβo (6E10) za pomocą pomp osmotycznych.
Pompy osmotyczne to unikalny sposób na testowanie in vivo skuteczności dowolnego przeciwciała (lub innych związków) przeciwko neurodegeneracji wywołanej przez Aβo bezpośrednio w miejscu infuzji Aβo. W związku z tym pompy te stanowią wygodne narzędzie do ustanowienia solidnego dowodu słuszności koncepcji dotyczącej mechanizmów działania potencjalnych środków terapeutycznych w chorobie Alzheimera. Ponieważ ostatnie doniesienia wskazują na krytyczny wpływ rozpuszczalnego Aβo we wczesnych stadiach choroby Alzheimera, wiele terapii ukierunkowanych na Aβo jest w rzeczywistości testowanych przez laboratoria akademickie i farmaceutyczne. Ten nowatorski model zwierzęcy pozwala naśladować utratę synaps i neuronów obserwowaną we wczesnej chorobie Alzheimera, a pompy osmotyczne są używane do ciągłego podawania środków leczniczych, szczególnie w miejscu infuzji Aβo. Powtarzające się niepowodzenia terapii AD testowanych w ciągu ostatnich kilku lat u pacjentów z łagodnym lub umiarkowanym nasileniem skłoniły naukowców do rozpoczęcia badań u pacjentów ze stanem przeddemencyjnym, zanim Aβo zacznie się obficie gromadzić i powodować nieodwracalne uszkodzenia mózgu. W tym kontekście testowanie nowych związków, które zapobiegają odkładaniu się, a w konsekwencji neurotoksyczności Aβo, może być interesujące dla pacjentów przedklinicznych.

<table><tbody><tr><td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)</td><td>Aparat Harvard</td><td>59-7316</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 Cewnik cienkościenny</td><td>Tworzywa sztuczne jeden</td><td>C232CT</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy (100 mg / ml)</td><td>Bioniche</td><td>1989529</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny (100 mg / ml)</td><td>Bimeda</td><td>8XYL004C</td><td></td></tr><tr><td>Meloksykam (5 mg / ml)</td><td>Norbrook</td><td>215670I01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%</td><td>Carefusion</td><td>260100C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek lidokainy</td><td>Alveda Pharma</td><td>0122AG01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek bupiwakainy</td><td>Hospira</td><td>1559</td><td></td></tr><tr><td>maść oftalmiczna</td><td>Baussh and Lomb inc.</td><td></td><td></td>2125706</tr><tr><td>rama stereotaktyczna</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>stereotaktyczne ramię uchwytu kaniuli</td><td>Aparat Harvarda</td><td>72-4837</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula prowadząca</td><td>Tworzywa sztuczne jedna</td> kaniula iniekcyjna <td>326OPG/spc</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tworzywa sztuczne jedna</td> kaniula <td>atrapa C315I/spc</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tworzywa sztuczne one</td><td>C315DC/spc</td><td></td></tr><tr><td>Nici powlekane nicią vicryl rapide 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VR2297</td><td></td></tr><tr><td>Dentystyczny cement akrylowy</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-6906</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JI Morris Company</td><td>P0090CE125</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>6E10 (izotyp myszy IgG1)&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803003</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Przeciwciało kontrolujące izotyp IgG1</td> Pompy osmotyczne <td>Abcam</td><td>AB18447</td><td></td></tr><tr><td>Alzet model 1007D</td><td>Durect corporation</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>CA2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid-beta 1-42&nbsp;</td><td>rPeptide</td><td>A-1163-1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton (10 &mikro; l)</td> <td>Fisher Scientique</td><td>14815279</td><td></td></tr><tr><td>Infuzyjna pompa strzykawkowa CMA 402</td><td>Harvard Aparat</td><td>CMA8003110</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>igła 21 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2125R</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical</td><td>RTS04</td><td></td></tr></tbody></table>

neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Spadek pamięci jawnej zależnej od hipokampa (pamięci faktów i wydarzeń) jest jednym z najwcześniejszych objawów klinicznych choroby Alzheimera (AD). Powszechnie wiadomo, że utrata synaps i wynikająca z niej neurodegeneracja są najlepszymi predyktorami zaburzeń pamięci w chorobie Alzheimera. Najnowsze badania podkreśliły neurotoksyczną rolę rozpuszczalnych oligomerów beta amyloidu (Aβo), które zaczynają gromadzić się w ludzkim mózgu około 10 do 15 lat przed pojawieniem się objawów klinicznych. Wiele doniesień wskazuje, że rozpuszczalny Aβo koreluje z deficytami pamięci w modelach AD i u ludzi. Neurodegeneracja wywołana przez Aβo obserwowana w kulturach neuronów i wycinków mózgu była trudniejsza do rozmnażania w wielu modelach zwierzęcych. Przedstawiony tutaj model powtarzających się wlewów Aβo rozwiązuje ten problem i pozwala zająć się dwiema kluczowymi obszarami dla opracowania nowych terapii modyfikujących przebieg choroby: zidentyfikować markery biologiczne do diagnozowania wczesnej choroby Alzheimera oraz określić mechanizmy molekularne leżące u podstaw deficytów pamięci wywołanych przez Aβo na początku choroby Alzheimera. Ponieważ rozpuszczalne Aβo agreguje się stosunkowo szybko w nierozpuszczalne włókienka Aβ, które słabo korelują ze stanem klinicznym pacjentów, rozpuszczalne Aβo są przygotowywane świeżo i wstrzykiwane raz dziennie przez sześć dni w celu wywołania znacznej śmierci komórek w hipokampie. Zastosowaliśmy kaniulę specjalnie zaprojektowaną do jednoczesnych infuzji Aβo i ciągłego wlewu przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych. Ta innowacyjna metoda in vivo może być obecnie stosowana w badaniach przedklinicznych w celu potwierdzenia skuteczności nowych terapii AD, które mogą zapobiegać odkładaniu się i neurotoksyczności Aβo u pacjentów ze stanem przedotępiennym.

Neurotoksyczny efekt Aβo badano u szczurów Long-Evans poprzez implantację kaniuli w zakręt zębaty (DG) hipokampa. Rozpuszczalne oligomery Aβo wstrzykiwano codziennie przez sześć kolejnych dni. Użyliśmy kaniuli zaprojektowanej specjalnie do jednoczesnych infuzji Aβo oraz ciągłej infuzji przeciwciała 6E10 lub kontrolnego przeciwciała IgG1 do hipokampa przy użyciu pomp osmotycznych (Rysunek 1A). Do badań immunohistochemicznych szczury zanieczulono, poddano perfuzji przezsercowej 0,9% NaCl, a następnie mózgowia zanurzono w 4% roztworze paraformaldehydu na 48 h i w 15% roztworze sacharozy na 24 h. Swobodne koronalne skrawki (40 µm) poddano działaniu 0,3% H2O2 przez 30 min, blokowano w 1% surowicy koziej przez 1 h, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C przy użyciu przeciwciała anty-pan-Aβ. Przed naniesieniem przeciwciała skrawki poddano działaniu 70% kwasu mrówkowego przez 3 min. Detekcję przeprowadzono z użyciem kompleksu ABC oraz 0,05% roztworu 3,3-diaminobenzydyny. Skrawki zamocowano na szkiełkach przedmiotowych powlekanych żelatyną, suszono na powietrzu przez 2 h, odwodniono (alkohole 30%, 70%, 95% i 100%), inkubowano w toluenie przez 5 min, a następnie przykryto szkiełkami podstawkowymi. W celu barwienia fioletem krezylowym skrawki inkubowano przez 10 min w 0,5% roztworze fioletu krezylowego, przez 1 min w 0,5% roztworze kwasu octowego, odbarwiono (alkohole 70%, 95% i 100%), zanurzono w toluenie na 5 min i przykryto szkiełkami podstawkowymi.
Przedstawione tutaj wyniki pokazują depozycję Aβo w zakręcie zębatym (DG) w pobliżu miejsca infuzji oraz śmierć komórek związaną z tą akumulacją. Stwierdzono, że poziom Aβo uległ znacznemu obniżeniu po zastosowaniu przeciwciała 6E10 (Ryc. 1B). W pobliżu miejsca wstrzyknięcia Aβo zaobserwowano wyraźną neurodegenerację, która została złagodzona dzięki leczeniu przeciwciałem 6E10 (Ryc. 1B). Wyniki te są zgodne z akumulacją Aβo, którą zaobserwowano w DG po wielokrotnych infuzjach Aβo u myszy.28 Wykazane tutaj usuwanie złogów amyloidu poprzez immunoterapię przeciwciałem 6E10 jest zgodne z innym raportem wykonanym w transgenicznym modelu mysim choroby Alzheimera (AD).31
<img alt="Szczur z cewnikiem PE50 i kaniulami, układ do badania neuronaukowego, eksperyment z zakresu badań biomedycznych." src="/files/ftp_upload/54215/54215fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zdjęcie zwierzęcia z obustronnymi kaniulami podczas infuzji Aβo. Roztwór Aβo (0,2 µg/µl; 1 µl) wstrzykiwano budzącym się i swobodnie poruszającym się szczurom (raz dziennie przez 6 dni) za pomocą cewników PE50 połączonych z kaniulami wewnętrznymi wprowadzonymi do kaniuli prowadzącej. Leczenie kontrolnymi (Ctl) przeciwciałami IgG1 lub 6E10 podawano bezpośrednio w miejscu infuzji Aβo przy użyciu pomp osmotycznych umieszczonych podskórnie między łopatkami zwierzęcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat pompy Alzet z podawaniem Aβ; wyniki barwienia przeciwciałem 6E10 w analizie mikroskopowej." src="/files/ftp_upload/54215/54215fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Utrata neuronów indukowana depozycją Aβo jest łagodzona przez leczenie przeciwciałem 6E10. A, Aβo (0.2 µg/µl; 1 µl) wstrzykiwano raz dziennie przez 6 kolejnych dni, a w miejscu infuzji stosowano pompy osmotyczne z Ctl (IgG1) lub przeciwciałem 6E10. B, Reprezentatywne nagromadzenie Aβo w DG na przekroju bezpośrednio obok miejsca wprowadzenia kaniuli oraz reprezentatywne barwienie fioletem krezylowym wykazujące utratę komórek. Paski skali: 50 µm (n = 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest zbadanie wpływu terapii na toksyczność oligomerów beta-amyloidu in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Alzheimera, takie jak poszukiwanie nowych terapii ukierunkowanych na neurotoksyczny efekt oligomerów beta-amyloidu w modelu zwierzęcym. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zbadania mechanizmu, poprzez który oligomery beta-amyloidu indukują efekty neurotoksyczne in vivo.A nasza terapia, podobnie jak immunoterapia, może przeciwdziałać szkodliwemu wpływowi na mózg. Procedurę zaprezentuje Chloe Provost, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć proces implantacji kaniuli, najpierw należy przyciąć cewniki PE50 do długości sześciu centymetrów.Następnie wypełnij cewniki sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Uszczelnij oba końce cewek za pomocą zgrzewarki termicznej. Na obu końcach nałóż cement stomatologiczny.Po znieczuleniu szczurów zgodnie z zatwierdzoną metodą, należy potwierdzić głębokość znieczulenia, sprawdzając reakcję ruchową po delikatnym ściśnięciu palca u nogi. Następnie podaje się znieczulonemu zwierzęciu niesteroidowy lek przeciwzapalny. Po zgoleniu głowy zwierzęcia trymerem należy zdezynfekować skórę roztworem 2% gluconianu chlorheksydyny i 2% alkoholu izopropylowego.Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu podczas anestezji. Następnie umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej, korzystając z prętów usznych. Zamocuj jedną kaniulę na ramieniu trzymającym ramy stereotaktycznej.Po wstrzyknięciu miejscowego środka znieczulającego i wykonaniu trzystopniowego nacięcia skalpelem na szczycie głowy, zamocuj cztery klamry wokół nacięcia, aby odsłonić czaszkę. Następnie za pomocą nożyczek z zaokrąglonymi końcami wykonaj kieszeń o wymiarach dwa na dwa centymetry pod skórą między łopatkami zwierzęcia. Wracając do głowy, zeskrob okostną czaszki za pomocą ostrza.W przypadku wystąpienia krwawienia przyłóż gazik do czaszki. Następnie, aby upewnić się, że czaszka jest płaska i odpowiednio ustawiona w aparacie stereotaksycznym, sprawdź współrzędne wysokości w punktach lambda i bregma. Zapisz współrzędne punktu bregma, który będzie służył jako punkt odniesienia.Po obliczeniu współrzędnych dla prawidłowego obustronnego umieszczenia dwóch kaniul prowadzących, wywierć otwór o średnicy 0,5 milimetra w czaszce w punkcie implantacji obu kaniul. Wywierć trzy kolejne otwory około pięciu milimetrów powyżej i poniżej tych punktów, aby wkręcić śruby, które ustabilizują kaniule podczas nakładania cementu dentystycznego. Następnie odetnij nożyczkami jeden koniec cewnika, uprzednio wypełnionego płynem aCSF, i wprowadź go do ramienia kątowego kaniuli.Przymocuj pierwszą kaniulę za pomocą cementu dentystycznego. Kluczowe jest, aby nie nakładać cementu dentystycznego wokół miejsca przeznaczonego dla drugiej kaniuli. Po odczekaniu dwóch do trzech minut do wyschnięcia cementu dentystycznego, zdejmij ramię uchwytu z pierwszej kaniuli i umieść w nim przyciętą drugą kaniulę.Drugą kaniulę unieruchom za pomocą cementu stomatologicznego. Następnie na obie kaniule prowadzące nałóż kaniule pozorowane. Wprowadź wolne końce obu cewników do kieszonki wykonanej wcześniej między łopatkami zwierzęcia.Zdejmij zaciski, a następnie zszyj skórę szwem 4-0. Nałóż więcej cementu wokół kaniuli. Wyjmij zwierzę z zestawu stereotaksycznego i umieść je na podgrzewaczu w czystej klatce. stale monitoruj zwierzę, aż odzyska ono wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję grzbietową. Następnie przenieś je do pomieszczenia z klatkami, aby mogło dojść do siebie po operacji przez 10 dni pod ścisłym nadzorem. Na jeden dzień przed implantacją napełnij pompy osmotyczne przeciwciałem 6E10 lub kontrolnym przeciwciałem IgG1, zgodnie z instrukcjami producenta.Umieść pompy w sterylnej wodzie destylowanej i pozostaw w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w celu ich aktywacji. Po znieczuleniu szczura 3% isofluranem i ogoleniu obszaru między łopatkami, zdezynfekuj skórę roztworem 2% glukonianu chlorheksydyny i 2% alkoholu izopropylowego. Po wykonaniu skalpelem nacięcia o długości dwóch centymetrów między łopatkami, zlokalizuj cewniki PE50 podłączone do kaniuli prowadzącej.Następnie za pomocą skalpela odetnij końce cewników PE50 zawierających cement stomatologiczny. Połącz pompy osmotyczne z cewnikami PE50 i nałóż niewielką ilość cementu stomatologicznego na połączeniu pompy z cewnikiem, aby zabezpieczyć połączenie. Na koniec dokładnie zszyj skórę szwami 4-0.Umieść zwierzę z powrotem w klatce na ciepłej podkładce grzewczej i monitoruj je podczas wybudzania z anestezji izofluranem. Po przygotowaniu roztworu oligomerów beta-amyloidu zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, pozwól roztworowi agregować dynamicznie i spontanicznie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przed infuzją. Następnie napełnij każdą strzykawkę pięcioma mikrolitrami 5 µL sterylnej wody destylowanej.Następnie przytnij skalpelem dwa cewniki PE50 do długości około 60 centymetrów. Użyj dwóch strzykawek o pojemności 1 ml z igłami 21G, aby wypełnić oba cewniki sterylną wodą destylowaną. Pozostawiając strzykawki 1 ml w jednym końcu każdego cewnika, podłącz wolne końce do strzykawek Hamiltona.Wyjmij strzykawki o pojemności jednego mililitra i sprawdź, czy w kaniulach nie ma pęcherzyków powietrza. Wprowadź wewnętrzną kaniulę do końców kaniul PE50. Użyj strzykawek Hamiltona, aby napełnić każdą wewnętrzną kaniulę do objętości jednego mikrolitra, a następnie wytwórz pęcherzyk powietrza, cofając tłok do oznaczenia dwóch mikrolitrów.Następnie wymieszaj roztwór oligomerów beta-amyloidu, pipetując go w górę i w dół za pomocą końcówki o niskim stopniu przylegania. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza podczas mieszania. Następnie napełnij obie wewnętrzne kaniule 1,5 µl roztworu oligomerów beta-amyloidu, cofając tłoki do poziomu 3,5 µl.Następnie zaznacz linie przed i za pęcherzykiem powietrza w obu cewnikach. Służy to jako punkt kontrolny ciągłości infuzji. Umieść budzącego się szczura w uścisku stabilizującym (snuggle hold) i unieruchom jego głowę.Usuń kanulę pomocniczą z dwóch kanul prowadzących, a następnie wprowadź wcześniej przygotowaną kanulę wewnętrzną do kanuli prowadzącej. Upewnij się, że są one w pełni wprowadzone i stabilnie zamocowane do podstawy kanuli prowadzącej. Teraz zwolnij szczura z uchwytu stabilizującego i umieść go z powrotem w klatce, aby ograniczyć stres związany z manipulacją.Włącz pompę infuzyjną i wstrzyknij jeden mikrolitr roztworu oligomerów beta-amyloidu z prędkością 0,1 mikrolitra na minutę. Podczas infuzji sprawdź, czy tłok strzykawki przesuwa się z 3,5 mikrolitra do 2,5 mikrolitra oraz czy pęcherzyki powietrza w obu cewnikach PE50 poruszają się w sposób ciągły. Sprawdź szczura, aby upewnić się, że cewniki nie skręciły się wokół siebie.Pozostaw kaniulę wewnętrzną na miejscu przez kolejne pięć minut po infuzji, aby umożliwić efektywną dyfuzję roztworu oligomerów amyloidu beta. Po infuzji przenieś szczura z powrotem do uchwytu stabilizującego i usuń kaniulę wewnętrzną oraz zamkniętą kaniulę prowadzącą, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętego roztworu. Wprowadź kaniulę ślepą, tak aby zatrzymała się tuż przed zgięciem kaniuli prowadzącej.Na koniec należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce. Przedstawione tutaj wyniki obrazują odkładanie się oligomerów beta-amyloidu w zakręcie zębatym w pobliżu miejsca infuzji oraz śmierć komórek z tym powiązaną. Poziom oligomerów beta-amyloidu został znacznie obniżony dzięki zastosowaniu przeciwciała 6E10, co wykazano w badaniu immuno-barwienia z użyciem przeciwciała anty-A-beta.Wyraźna neurodegeneracja została zaobserwowana w pobliżu miejsca wstrzyknięcia A-beta-O i została złagodzona poprzez zastosowanie przeciwciała 6E10, co wykazano w barwieniu fioletem krezylu. Po opanowaniu techniki, implantacja kaniuli może zostać wykonana w 30 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Instalacja pompy osmotycznej zajmuje około 10 minut, a wstrzyknięcie amyloidu beta około 15 minut.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o unikaniu nakładania cementu dentystycznego wokół miejsca drugiej kaniuli podczas wprowadzania pierwszej kaniuli. Należy również poczekać, aż zwierzę się uspokoi, przed wprowadzeniem kaniuli wewnętrznej do kaniuli prowadzącej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat sposobu implantacji kaniul i pomp osmotycznych w celu infuzji oligomerów beta-amyloidu oraz testowania metod leczenia choroby Alzheimera, takich jak immunoterapia.

neurodegeneration-an-animal-model-chronic-amyloid-beta-oligomer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje technikę ciągłego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu beta-amyloidu (Aβ) do hipokampa szczura. W badaniu zastosowano implantację obustronnego systemu kaniuli w celu kontrolowanego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu Aβ w połączeniu z infuzją rozpuszczalnych oligomerów Aβ (Aβo) do hipokampa szczura w celu zbadania interakcji między oligomerami a przeciwciałami.

Kontrolowany wlew przeciwciał swoistych dla peptydu Aβ i oligomerów Aβ do hipokampa szczura

Ten film demonstruje precyzyjną stereotaktyczną infuzję beta amyloidu do zakrętu zębatego w celu stworzenia mysiego modelu choroby Alzheimera. Dokładne określenie współrzędnych i kontrolowane dostarczanie białek beta amyloidu powoduje degradację neuronów, zakłócając przetwarzanie pamięci i przyczyniając się do rozwoju choroby Alzheimera.

Bezpośrednia stereotaktyczna infuzja białek beta amyloidu w mózgu dla modelu choroby Alzheimera

Źródło: Maiti, P. et. al.,. Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej. J. Vis. exp. (2019)Ten film przedstawia procedurę obrazowania blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą. Znakowanie immunologiczne zapewnia swoistość dla beta-amyloidu, podczas gdy kurkumina selektywnie wiąże włókienka bogate w β arkusze, poprawiając wizualizację. Kolokalizacja...

Obrazowanie blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą

Opisujemy metodę kierowania leków do ośrodkowego układu nerwowego poprzez wszczepienie cewnika lub wykonanie wstrzyknięcia bolusa do prawej bocznej komory u myszy. Skupiamy się w szczególności na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych. Technika ta można łatwo dostosować do innych leków i szczurów.

Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Opracowaliśmy metodologię ilościowego modelowania 3D in silico (q3DISM) amyloid-β (Aβ) fagocytoza przez jednojądrzaste fagocyty w modelach gryzoni choroby Alzheimera. Metodę tę można uogólnić w celu ilościowego określenia praktycznie każdego zdarzenia fagocytarnego in vivo.

Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Ten protokół ilustruje metodę enkapsulacji komórek poprzez szybkie fizyczne żelowanie alginianu w celu unieruchomienia komórek. Uzyskane mikrogranulki umożliwiają kontrolowane i trwałe wydzielanie β amyloidu w czasie i mogą być wykorzystywane do badania skutków wydzielania β amyloidu w modelach in vitro i in vivo.

Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera

Poznaj metodę wlewu oligomerów beta-amyloidu do hipokampu szczura z wykorzystaniem pomp osmotycznych do testowania immunoterapii przeciwko neurodegeneracji w modelu choroby Alzheimera.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi (Wideo) | JoVE Journal

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Przeglądaj więcej filmów