Pomiary przestrzenne perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest powiązanie wewnątrznowotworowej akumulacji nanoleków z właściwościami mikrośrodowiska guza, w tym z mikrokrążeniem nowotworowym oraz podwyższonym ciśnieniem płynu śródmiąższowego, czyli IFP. Metoda ta pozwala nam odpowiedzieć na istotne pytania dotyczące nanoleków, takie jak: co determinuje heterogeniczne pobieranie nanocząsteczek wewnątrz guza?

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona współlokalizacyjne mapowanie przestrzenne właściwości mikrośrodowiska guza oraz wewnątrznowotworowego rozkładu nanocząstek. Po potwierdzeniu odpowiedniego stopnia znieczulenia za pomocą topenge, należy nałożyć maść do oczu myszy i przymocować kończyny zwierzęcia taśmą w pozycji brzusznej na cienkiej plastikowej płytce. Następnie należy wprowadzić specjalistyczny kaniulę 27-gauge, połączoną z 20-centymetrowym odcinkiem rurki PE10, do bocznej żyły ogonowej i zabezpieczyć rurkę kilkoma kawałkami taśmy.

Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml co najmniej 200 µL liposomów do tomografii komputerowej (CT) oraz strzykawkę o pojemności 1 ml co najmniej 150 µL mieszaniny wolnego ioheksolu z solą fizjologiczną w stosunku objętościowym 9:1. Umieść strzykawkę z liposomami CT w pompie strzykawkowej i podłącz do niej cewnik, ustawiając szybkość pompowania na 600 µL/min, co odpowiada 10 µL/s. Następnie umieść mysz na stole skanera mikro-CT i za pomocą laserowego systemu pozycjonowania ustaw guz tak, aby zachować zbliżoną orientację podczas każdego skanowania.

Korzystając z oprogramowania konsoli skanera CT dla każdego wybranego protokołu obrazowania, wybierz opcję „bright dark” z menu rozwijanego i kliknij przycisk skanowania, aby uruchomić kalibrację oraz zainicjować system. Aby uzyskać wolumetryczną mikro-tomografię komputerową (micro CT) anatomiczną guza przed wstrzyknięciem jakiegokolwiek środka kontrastowego, najpierw sprawdź wskaźnik w oprogramowaniu konsoli skanera CT, aby potwierdzić, że blokady bezpieczeństwa skanera CT zostały zwolnione. Następnie wybierz skanowanie przy energii promieni Rentgena 80 kilovolts, prądzie lampy 70 milliamps i liczbie 1 000 projekcji obrazu.

Następnie rozpocznij skanowanie. Po zakończeniu skanowania ustaw pompę tak, aby wstrzyknęła około 150 µL roztworu liposomów, a następnie naciśnij przycisk start, aby podać bolus liposomów CT o stężeniu 55 mg jodu na mL roztworu. Ręcznie przepłucz cewnik 50 µL soli fizjologicznej, aby upewnić się, że wstrzyknięto całą ilość preparatu liposomowego i że cewnik został oczyszczony.

Po 10 minutach wykonaj drugi skan anatomiczny guza, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Aby przeprowadzić badanie DCE-CT, umieść strzykawkę z roztworem wolnego ioheksolu w pompie strzykawkowej i ustaw pompę tak, aby wstrzyknęła 100 µl ioheksolu z taką samą prędkością wstrzykiwania. Objętości wstrzyknięć te są wyższe od standardowych 200 µl, jednak zwierzęta są monitorowane podczas rekonwalescencji i nie zaobserwowano żadnych zdarzeń niepożądanych.

Następnie na konsoli skanera CT wybierz pięciominutowe skanowanie dynamiczne, stosując energię promieni rentgenowskich 80 kV i prąd lampy 90 mA, zgodnie z wcześniejszą prezentacją, które rejestruje 416 projekcji obrazu co 1 s przez pierwsze 30 s, a następnie 416 projekcji obrazu co 10 s. zarejestruj pięć sekund danych DCE-CT, a następnie uruchom pompę do wstrzykiwania. Po zakończeniu skanowania wykonaj trzecie wolumetryczne anatomiczne skanowanie mikro-CT.

Po 48–70 godzinach należy wykonać anatomiczne obrazy CT liposomów, korzystając z tych samych ustawień wolumetrycznych, które zostały właśnie zaprezentowane. Aby zmierzyć IFP, należy przymocować zwierzę taśmą do platformy robota CT IFP w taki sposób, aby guz był unieruchomiony i dostępny dla systemu robota CT IFP. Należy wykonać anatomiczny skan mikro CT, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.

Następnie wprowadź dane z badania przed wprowadzeniem igły do oprogramowania do wyrównania robota CT IFP i dostosuj okno oraz poziom w celu wizualizacji guza. Kliknij krawędź guza na dowolnym obrazie, a następnie wybierz drugą lokalizację krawędzi po przeciwnej stronie guza. Oprogramowanie obliczy serię pozycji wzdłuż linii prostej między tymi dwoma punktami.

Następnie z listy wybierz współrzędne X, Y i Z dla serii od pięciu do ośmiu równomiernie rozmieszczonych pozycji. Następnie przepłucz igłę systemu IFP roztworem soli fizjologicznej z heparyną i wprowadź pierwsze wcześniej określone pozycje igły do okien współrzędnych X, Y, Z w oprogramowaniu sterującym robotem CT IFP. Naciśnij przycisk go, aby przenieść robota do pożądanego miejsca.

Następnie, dla każdej pozycji igły po kolei, kliknij przycisk wprowadzania igły, aby wprowadzić ją w tkankę. Ściśnij i zwolnij rurkę PE20, aby potwierdzić prawidłową komunikację płynową między igłą IFP a tkanką i zaobserwuj, że pomiar IFP wzrasta, a następnie powraca do wartości sprzed ściśnięcia w oprogramowaniu do akwizycji IFP. Na koniec wykonaj anatomiczny skan CT z wprowadzoną igłą, klikając przycisk wycofania igły po zakończeniu skanowania, aby usunąć igłę z tkanki.

Wybór obszaru zainteresowania w obrębie guza pozwala na uzyskanie krzywej czas/intensywność, która może służyć do ilościowej oceny wybranych parametrów hemodynamicznych w guzie. Podział objętości guza na kilka równowielkich obszarów zainteresowania umożliwia kwantyfikację rozkładu przestrzennego tych parametrów w obrębie objętości guza. Można również zaobserwować biodystrybucję liposomów CT 48 godzin po wstrzyknięciu.

Jak wskazano, środek wciąż krąży w układzie naczyniowym, przy czym zaobserwowano znaczny wychwyt w śledzionie i wątrobie. Gromadzenie się tych liposomów CT wewnątrz guza jest niejednorodne, z przewagą akumulacji obwodowej w porównaniu z centrum tkanki nowotworowej. Igłę można wyraźnie zidentyfikować za pomocą mikro-CT o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na lokalizację przestrzenną pomiarów IFP w obrębie objętości guza.

Przestrzennie współlokalizowany pomiar perfuzji oraz frakcji objętości plazmy wykazuje istotną korelację z wewnątrznowotworowym gromadzeniem się liposomów CT w guzach podskórnych. Ponadto radialna dystrybucja IFP koreluje z innymi pomiarami hemodynamicznymi, co sugeruje złożoną relację przestrzenną i czasową między mikrokrążeniem guza, IFP a wewnątrznowotworowym gromadzeniem się liposomów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stabilne unieruchomienie zwierzęcia na stole skanera, aby zapewnić minimalny ruch guza pomiędzy pomiarami IFP.

Wnioski z niniejszej pracy mają zastosowanie w opracowywaniu nowych terapii. Transport nanocząsteczek jest kluczowym pierwszym krokiem w tworzeniu skutecznych preparatów terapeutycznych opartych na nanomedycynie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak mapować przestrzennie ciśnienie płynu śródmiąższowego w guzie, mikrokrążenie nowotworowe oraz rozkład nanocząsteczek.