Name: Pomiary przestrzenne perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę pomiaru przestrzennego perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych. Technika umożliwia mapowanie mikrośrodowiska nowotworowego i dystrybucji nanocząstek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Javedowi Mahmoodowi za pomoc w hodowli komórek MDA-MB-231 i wszczepieniu ksenoprzeszczepów MDA-MB-231, Linyu Fan za przygotowanie liposomów CT. Shawn Stapleton jest wdzięczny za finansowanie z Programu Stypendiów Podyplomowych w Dziedzinie Nauk Przyrodniczych i Inżynierii oraz Strategicznej Inicjatywy Fundacji Terry'ego Foxa na rzecz Doskonałości w Badaniach nad Promieniowaniem w XXI wieku (EIRR21) w CIHR. Badanie to było wspierane przez granty z Terry Fox New Frontiers Program (020005) i Canadian Institutes of Health Research (102569).

Wszystkie eksperymenty in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Uniwersytecką Sieć Zdrowia Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Model zwierzęcy
<ol>
	<li>Hodowla między 5 do 7 x 106 komórek nowotworowych gruczolakoraka piersi MDA-MB-231 w DMEM wraz z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100-krotnym rozcieńczeniem penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Zbieraj komórki, gdy są w 80% zlewne, używając 0,05% roztworu trypsyny-EDTA. Po 3-5 minutach zneutralizuj trypsynę-EDTA 3x objętością DMEM. Pobrać 15 μl podwielokrotności komórek i policzyć za pomocą hemocytometru. Odwirować komórki w postaci osadu przez 5 minut przy 200 x g i ponownie zawiesić w HBS w stężeniu 10 x 106 komórek na ml.</li>
	<li>Implantacja guzów podskórnych (SC) poprzez wstrzyknięcie 1 do 2 x 106 komórek w tylną kończynę każdej 8 do 12 tygodniowej samicy myszy SCID (n = 5). Do wstrzykiwań należy użyć standardowej igły o sile 25 G.</li>
	<li>Monitoruj wzrost guza za pomocą suwmiarki (objętość = 0,5 x długość x szerokość2) i rozpocznij pomiary, gdy guzy SC osiągną objętość >200 mm3 (około 7 do 9 dni).</li>
</ol>
2. Przygotowanie i charakterystyka liposomów CT
<ol>
	<li>Przygotowanie liposomów
	<ol>
		<li>Rozpuścić składniki lipidowe (200 mmol/l) dla liposomów CT, w tym 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC), cholesterol (CH) i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę-N-poli(glikol etylenowy) 2000 (DSPE-PEG2000) w bezwodnym etanolu w temperaturze 70 °C w stosunku molowym 55:40:5 DPPC:CH:DSPE-PEG2000.</li>
		<li>Odparować etanol, utrzymując ciepło w temperaturze 70 °C, a następnie dodać do roztworu środek kontrastowy CT ioheksol (300 mg/ml jodu) tak, aby końcowe stężenie lipidów wynosiło 100 mM.</li>
		<li>Utrzymywać roztwór w temperaturze 70 °C przez 4 godziny z częstym wirowaniem.</li>
		<li>Aby uzyskać pęcherzyki jednowarstwowe, należy wytłaczać próbkę 5 razy przez dwie ułożone w stos membrany o wielkości porów 200 nm pod ciśnieniem 250 psi i ponownie wytłaczać przez 5 cykli przez dwie ułożone w stos membrany o wielkości porów 80 nm przy ciśnieniu 400 psi za pomocą wytłaczarki lipidowej o pojemności 10 ml. Odpipetować objętość 10 ml liposomów do wytłaczarki na początku każdego cyklu wytłaczania i zebrać do sterylnej stożkowej probówki lub szklanej fiolki po każdym cyklu wytłaczania.</li>
		<li>Usunąć niekapsułkowany joheksol przez 16 godzin dializy za pomocą worka dializacyjnego o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWC) przeciwko 250-krotnemu przekroczeniu objętości 0,02 mM buforowanego roztworu soli fizjologicznej HEPES (HBS, pH 7,4). Na przykład umieścić 1 ml roztworu liposomu w worku do dializy, a 250 ml HBS na zewnątrz worka w zlewce.</li>
		<li>Zagęść liposomy CT za pomocą komercyjnego systemu przepływu stycznego MWC o pojemności 750 000 zgodnie z instrukcjami producenta. Skoncentrować do końcowego stężenia jodu około 55 mg ml-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka liposomów
	<ol>
		<li>Zmierzyć skuteczność kapsułkowania, rozrywając liposomy CT przy użyciu 10-krotnego nadmiaru objętościowego etanolu w celu uwolnienia joksenolu, a następnie rozcieńczyć przy użyciu 100-krotnego nadmiaru objętościowego wody dejonizowanej (tj. 10 μl liposomów rozerwanych przy użyciu 100 μl etanolu, a następnie rozcieńczonych do końcowej objętości 10 ml).</li>
		<li>Oznaczyć stężenie joheksolu za pomocą spektrometru UV z detekcją przy długości fali 245 nm. Obliczyć skuteczność kapsułkowania, biorąc pod uwagę stosunek ilości uwolnionego środka ioheksolu do ilości środka dodanego podczas przygotowania.</li>
		<li>Zmierz średnicę hydrodynamiczną i potencjał zeta za pomocą systemu analizatora wielkości cząstek z dynamicznym rozpraszaniem światła zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć roztwór liposomu CT 200x (tj. 5 μl liposomu w 1 ml końcowej objętości) w wodzie dejonizowanej, aby ułatwić pomiary.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie CT mikrokrążenia guza i dystrybucji liposomów CT
UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykonywania skanowania wolumetrycznego, jeśli używana jest inna wersja oprogramowania lub sprzętu.
<ol>
	<li>Znieczulij każdą mysz za pomocą 2% izofluranu zmieszanego z powietrzem medycznym lub tlenem i potwierdź, szczypiąc palec u nogi i obserwując brak reakcji. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Unieruchom zwierzę w pozycji leżącej, przyklejając łapy do cienkiej plastikowej deski.</li>
	<li>Umieść niestandardowy cewnik 27 G, podłączony do 20 cm rurki PE10, w bocznej żyle ogonowej i zabezpiecz na miejscu kilkoma kawałkami taśmy.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą co najmniej 200 μl liposomów CT. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z solą fizjologiczną do przepłukania cewnika. Na koniec należy przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z co najmniej 150 μl wolnego joheksolu zmieszanego z solą fizjologiczną (w stosunku 9:1 objętościowo).</li>
	<li>Umieść mysz na brzuchu na łożu skanera mikro-CT. Użyj laserowego systemu pozycjonowania, aby umieścić guz w mniej więcej tej samej orientacji dla każdego skanu.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę z liposomem CT w pompie strzykawkowej i przymocować cewnik do strzykawki. Ustawić wydajność pompy na 10 μl na sekundę.</li>
	<li>Zainicjuj system, wykonując skan kalibracyjny jasny-ciemny za pomocą oprogramowania konsoli tomografu komputerowego. Wybierz opcję skanowania od jasnego do ciemnego dla każdego protokołu obrazowania, wybierz jasny-ciemny z menu rozwijanego i naciśnij przycisk skanowania, aby rozpocząć kalibrację.</li>
	<li>Wykonaj wolumetryczną anatomiczną mikrotomografię komputerową guza przed wstrzyknięciem środka kontrastowego. Spójrz na wskaźnik oprogramowania konsoli tomografu komputerowego, aby upewnić się, że blokady bezpieczeństwa tomografu komputerowego zostały usunięte. Na konsoli tomografu komputerowego wybierz skanowanie, wybierz energię promieniowania rentgenowskiego 80 kV, prąd lampy 70 mA i rejestruje 1,000 projekcji obrazu w czasie 16 sekund. Naciśnij przycisk skanowania, aby rozpocząć skanowanie.</li>
	<li>Za pomocą pompy strzykawkowej wstrzyknąć bolus liposomów CT o stężeniu 400 mg jodu kg-1. Ustaw pompę tak, aby wstrzykiwała objętość około 150 μl (zakładając, że mysz o wadze 25 g). Naciśnij przycisk "start" na pompie, aby wstrzyknąć. Ręcznie przepłukać cewnik 50 μl soli fizjologicznej (dwukrotność objętości cewnika), aby upewnić się, że cała ilość środka została wstrzyknięta, a cewnik jest czysty.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu liposomów CT należy odczekać 10 minut, a następnie wykonać drugi skan anatomiczny przy użyciu tej samej metody i ustawień, które opisano w ppkt 3.5.</li>
	<li>Wykonać skan DCE-CT, ustawiając pompę strzykawkową tak, aby wstrzykiwała objętość 100 μl wolnego joheksolu zmieszanego z solą fizjologiczną (stosunek objętościowy 9:1) przy tym samym ustawieniu szybkości wstrzykiwania opisanym w ppkt 3.3.
	<ol>
		<li>Na konsoli tomografu komputerowego wybierz 5-minutowy skan dynamiczny, który wykorzystuje ustawienie energii promieniowania rentgenowskiego 80 kV, energię lampy 90 mA i rejestruje 416 projekcji obrazu co sekundę przez pierwsze 30 sekund, a następnie akwizycję co 10 sekund. Przechwyć 5 sekund danych DCE-CT, a następnie naciśnij przycisk start na pompie wtryskowej.</li>
		<li>Po badaniu DCE-CT należy wykonać wolumetryczną anatomiczną mikrotomografię komputerową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj anatomiczne obrazy TK między 48 a 72 godziną po wstrzyknięciu liposomów CT, używając tych samych wolumetrycznych ustawień CT, jak opisano w krokach 3.5.</li>
	<li>Zrekonstruuj dane anatomiczne CT i DCE-CT za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji GPU.
	<ol>
		<li>Załaduj obraz do oprogramowania do rekonstrukcji. Wybierz obszar zainteresowania, który chcesz zrekonstruować, rysując ROI na obrazie za pomocą myszy. Ustaw miejsce zapisu i nazwę pliku dla zrekonstruowanego obrazu i wybierz typ pliku wyjściowego jako ".mat". 
		UWAGA: Oprogramowanie automatycznie ustawi zrekonstruowany rozmiar woksela na 0,153 x 0,153 x 0,153 mm3 dla skanów anatomicznych i 0,153 x 0,153 x 0,462 mm3 dla skanów DCE-CT. Kliknij przycisk "rozpocznij odbudowę".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj skanów liposomu CT przed wstrzyknięciem i 10 minut po wstrzyknięciu, aby obliczyć frakcję objętościową osocza, jak opisano wcześniej3. Ponadto należy użyć skanów joheksolu przed wstrzyknięciem i 5 minut po wstrzyknięciu, aby obliczyć frakcję objętości śródmiąższowej, jak opisano wcześniej7.</li>
	<li>Uzyskaj krzywe intensywności czasu (TIC), importując dane DCE-CT do oprogramowania, które zapewnia możliwość identyfikacji obszaru zainteresowania (ROI) w objętości guza. Następnie oblicz średnie wzmocnienie CT w ROI w funkcji czasu. W tym eksperymencie opracowano niestandardowe oprogramowanie do identyfikacji zwrotu z inwestycji i obliczenia TIC.</li>
	<li>Uzyskaj ilościowe szacunki perfuzji i przepuszczalności naczyń krwionośnych, dopasowując zmierzone TIC przy użyciu dwukompartmentowego modelu kinetycznego znacznika. Dopasowanie można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do analizy DCE-CT i wykorzystać aprioryczne oszacowania frakcji objętościowej osocza i frakcji objętości śródmiąższowej jako stałych parametrów w dwukomorowym modelu kinetycznym znacznika. Wykorzystanie wcześniej opisanych metod w celu uzyskania apriorycznych oszacowań frakcji objętości osocza i śródmiąższowej14.</li>
</ol>
4. Przestrzenne pomiary ciśnienia płynu śródmiąższowego guza
<ol>
	<li>Aby zmierzyć interaktywność, podłącz igłę rdzeniową 25 G do przetwornika ciśnienia i do systemu akwizycji IFP przez 50 cm rurkę z polietylenu PE20. Przepłukać cały system roztworem siarczanu heparyny/soli fizjologicznej (1:10). Przed użyciem wysterylizować igłę 70% izopropylem.</li>
	<li>Włącz system akwizycji i uruchom oprogramowanie do akwizycji IFP i załaduj pliki ustawień, aby skalibrować system w celu uzyskania pomiarów IFP w mmHg. Kliknij przycisk pobierania, aby w sposób ciągły zbierać dane IFP.</li>
	<li>Wykonać pomiary IFP między 48 a 72 godzinami po wstrzyknięciu liposomów CT (odpowiada to przybliżonemu czasowi szczytowej akumulacji liposomów CT w guzie), stosując metody opisane w ppkt 4.8. Podłącz igłę IFP do robota CT-IFP.</li>
	<li>Wykonaj skany kalibracyjne, aby wyrównać układy współrzędnych robota CT-IFP i tomografu komputerowego. Dodaj nasadkę do markera referencyjnego do robota CT-IFP i wykonaj cztery wolumetryczne badania TK ze znacznikiem odniesienia w czterech różnych pozycjach.
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie sterownika robota CT-IFP, zainicjuj robota i przesuń robota do trzech pozycji, wprowadzając pozycje celowania x,y,z i klikając przycisk "start".</li>
		<li>Wykonać tomografię komputerową na następujących współrzędnych x,y,z: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; oraz (4) 0,0,10. Wybierz skanowanie 90 kV, 10 mA, 16 sekund za pomocą oprogramowania tomografu komputerowego i naciśnij "Start", aby rozpocząć skanowanie. Zrekonstruuj skan zgodnie z opisem w punkcie 3.10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do osiowania robota CT-IFP. Kliknij przycisk "dodaj" załadowany w regionie "Dane rejestracyjne" i wybierz cztery zrekonstruowane skany rejestracyjne uzyskane w wersji 4.3, a następnie kliknij "otwórz". 
	UWAGA: Lokalizacja znacznika odniesienia w pikselach zostanie automatycznie wprowadzona do oprogramowania.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk "Oblicz transformację", a następnie kliknij przycisk "Zastosuj transformację". W ten sposób generowane są dane osiowania, które zostaną wykorzystane do konwersji układu współrzędnych robota CT-IFP na układ współrzędnych tomografu komputerowego. Po zakończeniu kalibracji przymocuj platformę dla zwierząt do robota CT-IFP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulij każdą mysz za pomocą 2% izofluranu zmieszanego z powietrzem medycznym lub tlenem i potwierdź, szczypiąc palec u nogi i obserwując brak reakcji. Unieruchomić zwierzę na platformie robota CT-IFP i ustawić mysz tak, aby guz był dostępny dla systemu robota CT-IFP. Unieruchomić guz za pomocą taśmy tak, aby nie poruszał się podczas wprowadzania igły IFP.</li>
	<li>Wykonaj anatomiczną mikrotomografię komputerową przed wprowadzeniem igły IFP. Zrekonstruuj dane CT, wykonując czynności opisane w pkt 3.10.</li>
	<li>Załaduj dane CT przed wkłuciem igły do oprogramowania do osiowania robota CT-IFP. Dostosuj okno i poziom, aby uwidocznić guza. Kliknij krawędź guza na dowolnym obrazie, a następnie kliknij lokalizację drugiego brzegu. 
	UWAGA: Oprogramowanie obliczy serię pozycji wzdłuż linii liniowej między dwoma pozycjami. Zanotuj współrzędne x, y i z dla serii od 5 do 8 równomiernie rozmieszczonych pozycji z listy.</li>
	<li>Przygotować system IFP, przepłukując igłę roztworem soli fizjologicznej heparyny przed włożeniem.</li>
	<li>Wprowadź pierwsze z góry określone pozycje igły w x,y,z, do oprogramowania sterującego robotem CT-IFP i naciśnij przycisk "go", aby przesunąć robota do żądanej pozycji. Kliknij przycisk "Włóż igłę", aby wprowadzić igłę do tkanki.
	<ol>
		<li>Po włożeniu igły należy zapewnić dobrą komunikację płynu między igłą IFP a tkanką, ściskając i zwalniając rurkę PE20, zauważając, że pomiar IFP wzrasta i powraca do wartości sprzed zaciskania w oprogramowaniu do akwizycji IFP. Odrzuć pomiary, które nie powracają do linii bazowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj anatomiczny skan CT z włożoną igłą, a następnie kliknij przycisk "Wycofaj igłę" w oprogramowaniu sterującym robotem CT-IFP, aby wycofać igłę z tkanki. Odrzuć wszystkie pomiary IFP, w których wartość IFP nie powraca do wartości sprzed wkłucia igły po wyjęciu igły. Oznacza to, że igła mogła zostać zatkana podczas pomiaru. Powtórzyć kroki od 4.8 do 4.10 dla każdej pozycji igły.</li>
	<li>Określ położenie igły w objętości guza, obliczając pozycje x, y i z portu igły względem środka masy objętości guza, jak określono w wolumetrycznym skanowaniu CT igły po wprowadzeniu wkłucia.</li>
	<li>Wróć zwierzęta do klatki po zakończeniu wszystkich pomiarów. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki i obserwuj je, dopóki nie odzyskają przytomności i nie będą w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka.</li>
</ol>

<ol><li>Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+label+preformed+liposomes+with+64Cu+for+positron+emission+tomography+%28PET%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).</li>
<li>Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Computed+Tomography-+and+Optical+Image-Based+Assessment+of+Liposome+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution.</a> Molecular Imaging. 12 (3), 148-160 (2013).</li>
<li>Stapleton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+the+enhanced+permeability+and+retention+effect+for+liposome+transport+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors.</a> PloS one. 8 (12), e81157(2013).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+nano+agent+for+image-guided+cancer+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery.</a> Biomaterials. 67, 160-168 (2015).</li>
<li>Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+a+liposomal+vascular+contrast+agent+for+CT+and+MR-based+image+guidance+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications.</a> Pharmaceutical research. 24 (6), 1193-1201 (2007).</li>
<li>Harrington, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+solid+tumors+in+patients+with+locally+advanced+cancers+by+radiolabeled+pegylated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes.</a> Clinical Cancer Research. 7 (2), 243-254 (2001).</li>
<li>Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+perfusion+imaging+predicts+the+intra-tumoral+accumulation+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes.</a> J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).</li>
<li>Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotheranostics+and+image-guided+drug+delivery%3A+current+concepts+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions.</a> Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).</li>
<li>Stapleton, S., Milosevic, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStapleton%2C+S+%22Cancer+Targeted+Drug+Delivery%22">Cancer Targeted Drug Delivery</a>. , Springer. 241-272 (2013).</li>
<li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li>
<li>Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li>
<li>Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+molecular+and+nanoscale+medicine+to+tumors%3A+transport+barriers+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+chemical+and+biomolecular+engineering%22%5BJournal%5D)">Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies.</a> Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).</li>
<li>Bax, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+image-guided+robotic+needle+positioning+system+for+small+animal+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+physics%22%5BJournal%5D)">3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions.</a> Medical physics. 40 (1), 011909(2013).</li>
<li>Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intra-tumoral+relationship+between+microcirculation%2C+interstitial+fluid+pressure+and+liposome+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation.</a> Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).</li>
<li>Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+perfusion+imaging+predicts+the+intra-tumoral+accumulation+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes.</a> J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).</li>
<li>Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+analysis+of+tissue+microcirculation+using+nested+models%3A+multimodel+inference+and+parameter+identifiability%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+physics%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability.</a> Medical physics. 36 (7), 2923-2933 (2009).</li>
<li>Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracer+kinetic+modelling+of+tumour+angiogenesis+based+on+dynamic+contrast-enhanced+CT+and+MRI+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+nuclear+medicine+and+molecular+imaging%22%5BJournal%5D)">Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements.</a> European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37 (1), 30-51 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Przedstawione w artykule metody pomiaru obrazowego umożliwiają określenie przestrzennego rozkładu właściwości mikrokrążenia guza, IFP oraz akumulacji liposomów CT. Wcześniejsze próby powiązania tych właściwości opierały się na wykonywaniu masowych pomiarów na wielu zwierzętach z nowotworem, a zatem brakuje czułości na wyjaśnienie mechanizmów odpowiedzialnych za heterogeniczność akumulacji wewnątrz guza, która była powszechnie obserwowana w przypadku nanosystemów dostarczania leków15. DCE-CT zapewnia narzędzie ...

Pomiar wewnątrznowotworowej akumulacji nanocząsteczek systemów dostarczania leków może dostarczyć ważnego narzędzia do określenia, czy osiągnięto odpowiednie stężenie leku cytotoksycznego w obrębie guza. Opracowanie "obrazowalnych" systemów liposomalnych pozwala na nieinwazyjne i ilościowe wykrywanie in vivo nośnika dostarczającego lek za pomocą metod obrazowania, takich jak pozytonowa tomografia emisyjna (PET)1, fluorescencjaoptyczna2 oraz tomografia komputerowa (CT)3,4 i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)5. Obrazowanie wykorzystano do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji systemów dostarczania liposomów oraz do ujawnienia zakresu heterogeniczności międzyobiektowej i wewnątrznowotworowej w akumulacji nanocząstek6,7. Jednak samo obrazowanie nanocząstek nie pozwala zidentyfikować barier biologicznych, które przyczyniły się do ich słabej akumulacji i dystrybucji. Wiedza ta ma zasadnicze znaczenie dla racjonalnego rozwoju bardziej skutecznych preparatów i strategii poprawy akumulacji wewnątrz guza8. Wykazano, że strategie terapeutyczne mogą być stosowane do modulowania określonych barier biologicznych, co skutkujelepszym transportem nanocząstek9. Ponadto opracowano preparaty nanocząstek, aby specjalnie pokonać specyficzną barierę transportu biologicznego10. W obu scenariuszach pomiary barier biologicznych mogą być wykorzystane do ukierunkowania stosowania odpowiedniej strategii dostarczania leków w postaci nanocząstek.
Mikrokrążenie guza i podwyższony IFP są uważane za dwa kluczowe czynniki determinujące wewnątrznowotworową akumulację nanocząstek, takich jak liposomy, w guzach litych9,11. Jednak inne bariery, które przyczyniają się do słabej akumulacji liposomów, to gęsta macierz zewnątrzkomórkowa, nieprzepuszczalne naczynia krwionośne i ciśnienie w tkance stałej12. Bariery te są powiązane w sposób przestrzenno-czasowy, przy czym nieprawidłowy przepływ krwi i podwyższone ciśnienie płynu śródmiąższowego to dwa ważne czynniki napędzające początkowe dostarczanie i wynaczynienie nanocząstek. Jak omówiono wcześniej, ustalenie związku między mikrokrążeniem guza, podwyższonym IFP i wewnątrznowotworową akumulacją liposomów jest niezbędne do prawidłowej interpretacji danych obrazowania liposomów. W niniejszym artykule przedstawiono ilościowe metody pomiaru związku między mikrokrążeniem guza, podwyższonym IFP i akumulacją nanocząstek w guzie litym. Osiąga się to poprzez wykonywanie kolokalizowanych pomiarów rozmieszczenia wewnątrz guza liposomowego środka kontrastowego CT za pomocą wolumetrycznego obrazowania CT, mikrokrążenia guza za pomocą obrazowania tomografii komputerowej wzmocnionej kontrastem oraz IFP guza za pomocą sterowanego obrazem robotycznego systemu pozycjonowania igły, zwanego robotem CT-IFP13.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 komórki nowotworowe gruczolakoraka piersi z przerzutami&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicylina-Streptomycyna 100x Roztwór</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)</td><td>Avanti Lipids Inc., Stany Zjednoczone</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (CH)</td><td>Avanti Lipids Inc., USA</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-poli(glikol etylenowy) 2000 (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Lipids Inc., USA</td><td>880128P</td><td></td></tr><tr><td>Omnipaque (Iohexol) 300 mg jodu/ml&nbsp;</td><td>GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wielkość porów 80 nm Membrany poliwęglanowe Track-Etch</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wielkość porów 200 nm Membrany poliwęglanowe Track-Etch</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytłaczarka Lipex 10 m&nbsp;</td><td>Nothern Lipids Inc, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worek do dializy Odcięcie masy cząsteczkowej (MWCO) 8 kDa</td><td>Spectrum Labs, USA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 000 Nominalna masa cząsteczkowa odcięta (NMWC) Kolumna o przepływie stycznym&nbsp;</td><td>Wkład ultrafiltracyjny MidGee, GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna&nbsp;</td><td>Watson Marlow Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr UV</td><td>Helios &gamma;, Spectronic Unicam,&nbsp; Analizator</td> wielkości cząstek USA <td></td><td></td></tr><tr><td>90Plus&nbsp;</td><td>Brookhaven, Holtsville, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System eXplore Locus Ultra micro-CT&nbsp;</td><td>GE Healthcare, Kalifornia</td><td></td><td>Manipulowane za pomocą oprogramowania CT-Console</td></tr><tr><td>Rekonstrukcja oparta na procesorze graficznym AxRecon</td><td>&nbsp; Acceleware Corp. CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G Cewnik SURFLO Winged Zestaw infuzyjny</td><td>Terumo Medical Products, USA</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa PE20</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka pióra 25 G i razy; 3,5 i prime; &prime; Igła rdzeniowa Whitacre&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Stany Zjednoczone</td><td>405140</td><td>Igła IFP</td></tr><tr><td>P23XL&nbsp; przetwornik ciśnienia&nbsp;</td><td>Aparatura Harvarda, CA</td><td>P23XL</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/35, wzmacniacz mostkowy, z LabChart Pro 7.0</td><td>ADInstruments Pty Ltd., USA</td><td>PL3504, FE221</td><td>System akwizycji IFP i oprogramowanie do akwizycji</td></tr><tr><td>CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot)</td><td>Parallax Innovations, CA</td><td></td><td>Manipulowany za pomocą oprogramowania sterującego robotem CT-IFP</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td> do<td>osiowania robotów CT-IFP</td><td>Niestandardowe Oprogramowanie Matlab</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>do analizy DCE-CT</td><td>Niestandardowe oprogramowanie Matlab</td></tr><tr><td>Matlab 2013b</td><td>Mathworks, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary przestrzenne perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

Heterogeniczne nagromadzenie liposomów wewnątrz guza jest krytycznym wyznacznikiem ich skuteczności. Zarówno chaotyczne mikrokrążenie guza, jak i podwyższony IFP są związane z niejednorodną dystrybucją wewnątrz guza w systemach dostarczania leków opartych na nanotechnologii, takich jak liposomy. W niniejszym badaniu zbadano związek między mikrokrążeniem guza, podwyższonym IFP i akumulacją nanocząstek poprzez eksperymenty in vivo. Osiągnięto to poprzez ocenę mikrokrążenia guza za pomocą dynamicznej tomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastu (DCE-CT) oraz pomiar IFP guza za pomocą nowatorskiego, sterowanego obrazem zrobotyzowanego systemu umieszczania igieł podłączonego do mikrotomografu komputerowego. Akumulację liposomów wewnątrz guza określono za pomocą oceny opartej na obrazie CT liposomalnego preparatu nanocząsteczkowego, który stabilnie kapsułkuje środek kontrastowy ioheksol (liposomy CT). Obrazowanie TK pozwoliło na kolokalizację przestrzennego rozkładu hemodynamiki guza, akumulacji IFP i liposomów CT w indywidualnym mysim modelu ksenoprzeszczepu podskórnego raka piersi. Pomiary doprowadziły do odkrycia, że perfuzja i frakcja objętościowa osocza są silnymi mediatorami dystrybucji liposomów w obrębie guza. Co więcej, wyniki sugerują, że IFP odgrywa pośrednią rolę w pośredniczeniu w dystrybucji liposomów poprzez modulację przepływu krwi.

Powyższy protokół powinien dać liposomy CT z zaklipsowaną koncentracją iohexolu, średnią średnicą liposomów oraz potencjałem zeta na poziomie odpowiednio 55 mg ml-1, 91,8 ± 0,3 nm i -45,5 ± 2,5 mV. Rycina 1a przedstawia reprezentatywne wyniki obrazowania DCE-CT, uzyskane w postaci szeregu czasowego danych objętościowych pokazujących zmiany czasowe w akumulacji iohexolu wewnątrzguzowym. Wybór ROI w obrębie guza pozwala uzyskać krzywą nasycenia (TIC), którą można...

Heterogeniczne nagromadzenie liposomów wewnątrz guza zostało powiązane z nieprawidłowym mikrośrodowiskiem guza. W niniejszej pracy przedstawiono metody pomiaru mikrokrążenia guza za pomocą obrazowania perfuzyjnego i podwyższonego ciśnienia płynu śródmiąższowego (IFP) przy użyciu systemu robotycznego sterowanego obrazem. Pomiary są porównywane z wewnątrznowotworową akumulacją liposomów, oznaczoną za pomocą wolumetrycznego obrazowania mikro-CT.

Pomiary przestrzenne perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest powiązanie wewnątrznowotworowej akumulacji nanoleków z właściwościami mikrośrodowiska guza, w tym z mikrokrążeniem nowotworowym oraz podwyższonym ciśnieniem płynu śródmiąższowego, czyli IFP. Metoda ta pozwala nam odpowiedzieć na istotne pytania dotyczące nanoleków, takie jak: co determinuje heterogeniczne pobieranie nanocząsteczek wewnątrz guza?Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona współlokalizacyjne mapowanie przestrzenne właściwości mikrośrodowiska guza oraz wewnątrznowotworowego rozkładu nanocząstek. Po potwierdzeniu odpowiedniego stopnia znieczulenia za pomocą topenge, należy nałożyć maść do oczu myszy i przymocować kończyny zwierzęcia taśmą w pozycji brzusznej na cienkiej plastikowej płytce. Następnie należy wprowadzić specjalistyczny kaniulę 27-gauge, połączoną z 20-centymetrowym odcinkiem rurki PE10, do bocznej żyły ogonowej i zabezpieczyć rurkę kilkoma kawałkami taśmy.Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml co najmniej 200 µL liposomów do tomografii komputerowej (CT) oraz strzykawkę o pojemności 1 ml co najmniej 150 µL mieszaniny wolnego ioheksolu z solą fizjologiczną w stosunku objętościowym 9:1. Umieść strzykawkę

spatial-measurements-perfusion-interstitial-fluid-pressure-liposomes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Ten film opisuje technikę pomiaru ciśnienia płynu śródmiąższowego w guzie za pomocą obrazowania perfuzyjnego za pomocą systemu robotycznego sterowanego obrazem. Pomiary porównuje się z wewnątrznowotworową akumulacją liposomów w guzie litym.

Przestrzenny pomiar ciśnienia płynu śródmiąższowego guza: metoda pomiaru ciśnienia płynu śródmiąższowego

W tym artykule przedstawiamy metodę analizy mikronaczyń guza in vivo za pomocą dynamicznej wideomikroskopii fluorescencyjnej wzmocnionej kontrastem. Uzyskano dwa parametry ilościowe: funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych odzwierciedlającą unaczynienie guza oraz nieszczelność wskaźnika odzwierciedlającą nieszczelność ściany śródbłonka.

In vivo (in vivo) Obrazowanie angiogenezy guza za pomocą fluorescencyjnej wideomikroskopii konfokalnej

Przedstawiono metodę pomiaru prędkości przepływu krwi mikrokrążącej w raku płuc z przerzutami do powierzchni opłucnej u szczurów w sposób zautomatyzowany, przy użyciu mikroskopii przyżyciowej płuc z zamkniętą klatką piersiową. Model ten ma potencjał do wykorzystania jako szeroko rozpowszechnione narzędzie do prowadzenia badań fizjologicznych nad przerzutami do płuc u gryzoni.

Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Poznaj metodę pomiaru przestrzennego perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych. Technika umożliwia mapowanie mikrośrodowiska nowotworowego i dystrybucji nanocząstek.

Pomiary przestrzenne perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych

Przeglądaj więcej filmów