Name: Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek trofoblastu kosmówkowego i hodowlę w warunkach niedotlenienia/reoksygenacji w celu badania ochronnego działania melatoniny przeciwko stresowi oksydacyjnemu w łożysku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (nr 262011-2009) do CV i March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) dla CV i JTS; przez stypendia dla LSF od Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) oraz Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, do HC z Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, do AAHT z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) i FRQ-Santé oraz do JBP z NSERC; stypendium dla EMAS od Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) oraz Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Łożyska zostały pobrane natychmiast po spontanicznych porodach pochwowych z niepowikłanych ciąż w szpitalu CHUM-St-Luc, Montreal, QC, Kanada, za świadomą zgodą pacjentki i za zgodą komisji etycznych (CHUM-St-Luc Hospital i INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Kanada).
1. Izolacja i oczyszczanie kosmków komórek cytotrofoblastu
<ol>
	<li>Rozwiązania i media
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę transportową, uzupełniając zmodyfikowany Eagle's Medium High-Glucose (DMEM-HG) firmy Dulbecco antybiotykiem 1% obj./obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować podstawowe pożywki hodowlane, uzupełniając DMEM-HG 10% obj./obj. płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), antybiotyku 1% obj./obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Przygotować 4 l roztworu soli fizjologicznej (0,9% wag./obj. chlorku sodu).</li>
		<li>Przygotuj zmodyfikowany zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS), dodając 25 mM HEPES do 1x HBSS (pH 7,4).</li>
		<li>Przygotować świeże, cztery butelki roztworu wytrawiającego ze zmodyfikowanym HBSS (przygotowanym w ppkt 1.1.4), siarczanem magnezu (MgSO4), chlorkiem wapnia (CaCl2), trypsyną, dezoksyrybonukleazą IV (DNazą IV) i antybiotykiem 1% obj./obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny), jak pokazano w Tabeli 1.</li>
		<li>Przygotuj gradient pożywki wirowej o gęstości
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór pożywki do wirowania gęstości, uzupełniając pożywkę wirówkową o gęstości 10% obj./obj. HBSS 10x.</li>
			<li>Przygotować 14 probówek z roztworem pożywki do odwirowania o dużej gęstości i zmodyfikowanym HBSS, jak opisano w tabeli 2.</li>
			<li>Energicznie wymieszać każdy roztwór gęstości (etap 1.1.6.2) przed dodaniem jego zawartości do gradientu. Delikatnie dodać roztwory o gęstości do szklanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z pompą perystaltyczną (1 ml/min), zaczynając od najwyższego stężenia (70%). Unikaj kropelek, spuszczając roztwory ze ścianki rury, aby utrzymać właściwą separację każdej warstwy gradientu.
			<ol>
				<li>W przypadku braku pompy perystaltycznej warstwy należy nakładać bardzo delikatnie za pomocą pipet Pasteura.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować końcowy bufor do biegania, uzupełniając bufor bieżący (patrz Tabela materiałów) antybiotykiem/antybiotykiem przeciwgrzybiczym o stężeniu 2% obj. / obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja cytotrofoblastu kosmków 
	Uwaga: Używaj sterylnego sprzętu chirurgicznego, szkła, pipet, kolb itp.
	<ol>
		<li>W dniu izolacji cytotrofoblastu kosmków, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ogrzać roztwory wytrawiające (z kroku 1.1.5) i 70 ml FBS. Uwaga: Użyć 50 ml FBS do przerwania trawienia i pozostałych 20 ml do etapu zamrażania (1.2.22), które po rozmrożeniu można umieścić na lodzie.</li>
		<li>Po porodzie należy jak najszybciej (w czasie krótszym niż 1 godzina) dostarczyć łożysko do laboratorium w lodowatym podłożu transportowym (z kroku 1.1.1).</li>
		<li>Wyrzuć pożywkę transportową i krew łożyskową do płynnego kosza na śmieci. Zważ łożysko i zanurz w zimnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
		<li>Zmierz i przeanalizuj następujące cechy: długość pępowiny; lokalizacja pępowiny; długość, szerokość, kształt łożyska (owalny, dyskoidalny); kolor błony; patologie struktury liścienia. Uwaga: Dane są prezentowane w sekcji wyników.</li>
		<li>Przeciąć pępowinę wzdłuż jej wprowadzenia przez łożysko (tj. u jej podstawy z dodatkowym okręgiem o promieniu 1 cm wokół pępowiny). Zanurzyć w 300 ml histologicznego roztworu utrwalającego tkanki (formalina 10%) w celu późniejszej analizy histologicznej.</li>
		<li>Pokrój całe łożysko w kostkę o wymiarach 5 x 5 x 5 cm. Dokładnie umyj (4 razy x ~ 1 min) w roztworze soli fizjologicznej (0,9%), aby usunąć krwinki, aż roztwór soli fizjologicznej będzie klarowny. Wylej płyn do płukania.</li>
		<li>W szkiełku zegarkowym usuń błony łożyskowe i zmiel tkanki, aby usunąć naczynia krwionośne i zwapnienia. Mocno chwyć naczynia krwionośne kleszczami i usuń tkanki za pomocą tylnej części nożyczek Metzenbaum.
		<ol>
			<li>Umieść rozdrobnione łożysko w lejku Büchnera. Przepłukać około 100 ml buforu soli fizjologicznej. Kontynuuj mielenie, aż uzyskasz 30 - 35 g zmielonej tkanki (użyj plastikowej łódki do ważenia i wagi). W razie potrzeby zmielić pozostałą część łożyska, aby uzyskać do trzech dodatkowych preparatów o wadze 30 - 35 g. W tym czasie umieść zmieloną tkankę w łodzi wagowej na lodzie. 
			Uwaga: Ten krok zajmie około 45 minut do 1 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 30 - 35 g mielonej tkanki łożyskowej do kolby trypsynizującej. Przenieść 150 ml przygotowanego roztworu wytrawiającego 1 (tabela 1) do kolby trypsynizującej i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Umieścić kolbę trypsynizującą w wytrząsającej łaźni wodnej na 30 minut z prędkością nie większą niż 50 cykli/min i ręcznie mieszać kolbę trypsynizującą co 5 minut w celu uzyskania jednorodnego roztwarzania.</li>
		<li>Pod koniec pierwszego trawienia wyjąć kolbę trypsynizującą z łaźni wodnej i przechylić ją (45°) na 1 minutę w celu osadzenia tkanki łożyska. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml usunąć i wyrzucić około 80 ml supernatantu. Unikaj zasysania tkanki.</li>
		<li>Przenieść 100 ml roztworu wytrawiającego 2 (tabela 1) do kolby trypsynizującej; dobrze wymieszać i powtórzyć krok 1.2.9.</li>
		<li>Pod koniec drugiego wytrawiania wyjąć kolbę trypsynizującą z łaźni wodnej i przechylić ją pod kątem 45° na 1 minutę. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml usunąć 80 ml supernatantu i delikatnie przenieść do probówki wirówkowej z sitkiem do komórek (oczko 100 μm). Przefiltrowany sklarowany sklarowany sklarowany sklarat nad osadem należy przenieść do zlewki zawierającej 2 ml FBS za każdym razem, gdy probówka wirówkowa jest pełna.</li>
		<li>Przeprowadzić trzecie wytrawianie zgodnie z opisem dla drugiego wytrawiania (1.2.11 i 1.2.12) przy użyciu 75 ml roztworu do wytrawiania 3. Równolegle wykonaj kroki od 1.2.15 do 1.2.16.1 dla trawienia 2.</li>
		<li>Przeprowadzić czwarte wytrawianie dokładnie tak samo, jak trzecie wytrawianie, używając roztworu wytrawiającego 4 (75 ml), ale zebrać maksymalną ilość supernatantu. Wykonaj kroki od 1.2.15 do 1.2.16.1 równolegle dla trawienia 3 i na końcu dla trawienia 4.</li>
		<li>Porcjować supernatant (z procesów trawienia 2, 3 i 4) na 13,5 ml części, z których każda składa się na jedną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml. Za pomocą szklanej pipety Pasteura o długości 22,8 cm bardzo delikatnie i powoli umieść 1,5 ml FBS na dnie każdej probówki, aby utworzyć osobną warstwę. Nie mieszać FBS i supernatantu. Wirować probówki bez hamulca przez 20 minut przy 1 250 x g w temperaturze pokojowej. 
		Uwaga: Po odwirowaniu w probówce widoczne są 4 warstwy, jak pokazano na rysunku 1. Oddzielenie komórek trypsyny i trofoblastu pozwala uniknąć nadmiernego trawienia komórkowego.</li>
		<li>Za pomocą pompy próżniowej odessać i wyrzucić warstwy supernatantu (roztwór do wytrawiania) i FBS, w tym białawy film między dwiema warstwami. Zawiesić osad (trofoblasty i warstwy krwinek czerwonych) w 1 ml pożywki do hodowli komórek ciepłych (etap 1.1.2; bez FBS i bez HEPES).
		<ol>
			<li>Zbierz zawieszone komórki ze wszystkich probówek i połącz je w 1 probówkę. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej do końca wszystkich roztwarzeń. Uwaga: Po wszystkich trawieniach zwykle uzyskuje się 3 probówki zawieszonych komórek (po jednej na trawienie).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uzupełnić objętość do 15 ml ciepłym podłożem do hodowli komórkowych. Wirować przy 1 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej. Unikać zasysania granulki.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić osad otrzymany z 3 probówek z 1 ml pożywki do hodowli ciepłokomórkowych. Zbierz ich zawartość w 1 tubie. Aby uzyskać 8 ml, uzupełnij objętość ciepłym podłożem do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Bardzo delikatnie nałożyć zawiesinę komórek na gradient separacji za pomocą pipety Pasteura. Wirować bez hamulca przez 30 minut przy 507 x g w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po odwirowaniu zidentyfikuj różne warstwy komórek w gradiencie za pomocą podświetlenia. Zlokalizuj warstwy zawierające trofoblast i komórki zanieczyszczające między 40 a 50% gęstości pożywki wirowej. Za pomocą pompy próżniowej usuń górne warstwy (> 50%).</li>
		<li>Zebrać komórki znajdujące się w warstwach zainteresowania za pomocą pipety Pasteura i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Uzupełnić objętość do 50 ml pożywką do hodowli komórkowych. Wirować przez 10 minut w temperaturze 1 250 x g w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W sterylnych warunkach wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad z 20 ml FBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Na lodzie dodać 2,22 ml sterylnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i delikatnie wymieszać, odwracając. Podwielokrotność 1,5 ml zawiesiny komórkowej przelać do fiolek kriogenicznych, zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C i przenieść do zbiornika z ciekłym azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie trofoblastu
	<ol>
		<li>Zamontuj płuczące i robocze oraz nową kolumnę filtracyjną na magnetycznym przyrządzie do oczyszczania zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj "program czyszczenia", aby wyczyścić porty ujemne 1, dodatnie 1 i dodatnie 2, a następnie wprowadź probówki o pojemności 50 ml pod każdy port zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Szybko rozmrozić komórki, które zostały zamrożone w kroku 1.2.22 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml i delikatnie zawiesić komórki za pomocą 20 ml zimnego roztworu buforowego. Odwirowywać probówkę przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant. Powtórz etap mycia z buforem do pracy na zimno. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić żywotność. Powtórzyć wirowanie (przez 5 minut, 450 x g w temperaturze 4 °C). Ostrożnie usunąć supernatant. Dodać 1 ml zimnego buforu zawierającego 1% obj./obj. mysich przeciwciał anty-HLA-ABC. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.</li>
		<li>Dodać 6 ml buforu do pracy na zimno. Wirować przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i powtórzyć ten krok. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu zawierającego 10% obj./obj. wtórnych kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami przeciw myszy. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.</li>
		<li>Dodać 6 ml buforu do pracy na zimno. Wirować przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 5 ml buforu do pracy na zimno.</li>
		<li>Oddzielić komórki trofoblastu za pomocą magnetycznego przyrządu do oczyszczania. Zebrać komórki w porcie ujemnym i dodać 20 ml buforu pracującego na zimno. 
		Uwaga: Komórki trofoblastu nie zawierają kompleksu HLA-ABC, a zatem są oddzielone od innych typów komórek i skierowane w stronę ujemnego portu 1.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 20 ml ciepłej pożywki pierwotnej. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić żywotność.</li>
		<li>Płytki komórek o następującej gęstości: 0,15 x 106 komórek/dołek na płytkach 96-dołkowych, 1,6 x 106 komórek/basenik na płytkach 24-dołkowych i 4,5 x 106 komórek/basenik na płytkach 6-dołkowych. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Potwierdzić czystość komórek trofoblastu za pomocą cytometrii przepływowej16,17 i/lub immunocytochemii18. 
		Uwaga: Czystość komórek oczyszczonych immunologicznie określono przy użyciu sprzężonych z FITC przeciwciał monoklonalnych przeciwko cytokeratynie-7 i wimentynie17-19. Protokół ten jest szczegółowo opisany w Lanoix et al., 20087.</li>
		<li>Po upływie co najmniej 4 godzin należy dwukrotnie przepłukać komórki ciepłą pożywką hodowlaną w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek, a następnie przenieść płytki do komory normoksji, która składa się z 8%O2 (patrz rysunek 2 i sekcja 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indukcja in vitro normoksji i niedotlenienia/reoksygenacji
<ol>
	<li>Działanie w komorze inkubatora (patrz rysunek 2A w celu konfiguracji).
	<ol>
		<li>W okapie z przepływem laminarnym umieścić szalkę Petriego zawierającą sterylną wodę na dnie komory inkubatora, aby uniknąć wysuszenia, a następnie umieścić wcześniej przygotowane płytki lub kolby do hodowli komórkowych (etap 1.3.10) na górnych półkach komory.</li>
		<li>Na zewnątrz okapu przymocuj komorę (otwór wlotowy) do węża gazowego (Rysunek 2A: 5a, b i c), aby dotrzeć do rurki z gazem (8% O2 lub 0.5% O2) (Rysunek 2A: 7). Otwórz zarówno otwory wlotowe, jak i wylotowe komory. W tym momencie reduktor gazu (Rysunek 2A: 4) powinien pozostać zamknięty.</li>
		<li>Ostrożnie otwórz zawór regulatora gazu (Rysunek 2A: 4). Płukanie przez 4 minuty z przepływem powietrza 25 l/min w celu całkowitej wymiany powietrza wewnątrz komory.</li>
		<li>Po przepłukaniu komory należy zamknąć reduktor gazu, a następnie porty wlotowe i wylotowe komory.</li>
		<li>Odłączyć wąż wylotowy przepływomierza (Rysunek 2A: 5c) od króćca wlotowego komory i umieścić komorę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wymienić powietrze znajdujące się obecnie na płytkach, kolbach i rozpuszczone w pożywce, napełniając komorę gazem po upływie 1 godziny od wykonania czynności 2.1.3.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.6 dla pozostałych składów gazowych (np. 2%O2 dla hodowli trofoblastu w pierwszym trymestrzeciąży9).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź procentową zawartość tlenu (Rysunek 2B-C)
	<ol>
		<li>Aby potwierdzić stężenie tlenu w pożywce do hodowli komórkowej (bez komórek) wewnątrz komory, należy użyć elektrody tlenowej podłączonej do adaptera tlenowego. Podłącz elektrodę tlenową do woltomierza.</li>
		<li>Należy utworzyć krzywą kalibracyjną w tym samym roztworze (tj. pożywce do hodowli komórkowych), wystawiając roztwór na działanie gazów o znanej zawartości tlenu (np. 0% i 21% tlenu). Po ustabilizowaniu odczytów dla każdego stężenia, wprowadzić elektrodę do medium w komorze. 
		Uwaga: Wszystkie pomiary należy wykonywać na tej samej głębokości, aby uniknąć odchyleń w stężeniu tlenu10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja normoksji i hipoksja/reoksygenacja w trofoblastach.
	<ol>
		<li>Po dodaniu pierwotnych komórek trofoblastu do odpowiednich kolb do hodowli komórkowych, płytek lub szalek Petriego, w razie potrzeby należy wykonać zabiegi.</li>
		<li>Równolegle, wewnątrz komory, wystawiaj komórki na działanie żądanej mieszaniny gazów, aby co 24 godziny odtwarzać określony stan (ryc. 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

U ssaków rozwój płodu jest bezpośrednio zależny od odpowiedniej funkcji łożyska. Rozwojowe pochodzenie zaburzeń zdrowotnych opiera się na hipotezie, że przyczyna chorób objawiających się w późniejszym życiu może być prześledzona we wczesnym rozwoju i że łożysko odgrywa mechanistyczną rolę w programowaniu płodu30-32. Łożysko jest kluczowym mediatorem wzrostu i rozwoju płodu: reguluje transport składników odżywczych, chroni przed szkodliwym narażeniem i pełni ważne funkcje hormonalne. Opracowanie przez Klimana <...

Przez cały okres ciąży u ludzi, komórki cytofoblast łożyska, które są jednojądrowymi komórkami macierzystymi, szybko się namnażają i różnicują w kosmkowe lub pozakosmkowe komórki cytotrofobostowe. Pozakosmkowe cytotrofoblasty atakują i przebudowują spiralne tętnice ściany macicy. Z drugiej strony cytotrofoblasty kosmkowe nadal proliferują, różnicują się i łączą się, tworząc wielojądrowy syncytiotrofoblast (syncytium)1. Utrzymanie homeostazy trofoblastu kosmków jest niezbędne dla dobrego samopoczucia płodu i zdrowej ciąży. W rzeczywistości trofoblasty kosmkowe umożliwiają matczyno-płodową wymianę tlenu i składników odżywczych oraz wytwarzają hormony niezbędne do zajścia w ciążę. Co więcej, synciotrofoblast jest jedynym typem komórki, który ma bezpośredni kontakt z krążeniem krwi matki i zapewnia niezbędną barierę fizyczną i immunologiczną. Dlatego syncytiotrofoblast musi przejść apoptozę i wymianę w celu utrzymania homeostazy i uniknięcia patologii łożyska2-5.
Technika opracowana przez Klimana i wsp.6 W 1986 r. wyizolowanie pierwotnych cytotrofoblastów kosmków z ludzkich łożysk spowodowało rewolucję w badaniach nad łożyskiem, umożliwiając badanie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w różnicowanie trofoblastów kosmków. Ta klasyczna technika, oparta na sekwencyjnym trawieniu enzymatycznym z trypsyną i DNazą, a następnie izolacji w pożywkach wirujących o gęstości (koloidalne cząstki krzemionki pokryte poliwinylopirolidonem lub Percollem) jest obecnie uznawana za złoty standard izolacji komórek cytotrofoblastu kosmków. Technikę tę można zoptymalizować poprzez immunooczyszczanie magnetyczne, procedurę, która oddziela cytotrofoblasty kosmkowe od komórek nietrofoblastycznych w oparciu o różnicową ekspresję określonych antygenów na powierzchni tych komórek. Wybraliśmy ludzki antygen leukocytarny ABC (HLA-ABC) ze względu na brak jego ekspresji na błonie komórek trofoblastycznych7,8.
Łożysko to narząd, który ulega dramatycznym zmianom poziomu tlenu podczas ciąży. W pierwszym trymestrze ciąży współczynnik natlenienia jest fizjologicznie bardzo niski (2%O2), ale wzrasta do łagodnego poziomu natlenienia (8%O2) w drugim i trzecim trymestrze. Tuuli i wsp.9 opisano, że rozmnażanie in vitro środowiska trofoblastu wewnątrz kosmków łożyskowych jest wyzwaniem, a zmiany w poziomach natlenienia mogą nawet prowadzić do zmian fenotypowych. W związku z tym sugeruje się przyjęcie 8% tlenu jako normoksji, aby naśladować ciśnienie tlenu występujące w kosmkach łożyskowych w trzecim trymestrze ciąży8,9. Chen i wsp.10 szeroko zbadano kilka zmiennych związanych z napięciem tlenu w hodowli komórek trofoblastu i wykazano znaczenie oznaczania poziomu tlenu w środowisku okołokomórkowym. Poziom tlenu w kosmkach ma tendencję do zwiększania się z powodu waskulogenezy. Przepływ krwi w kosmkach łożyskowych stale rośnie, a poziom nadtlenku wodoru (obfitej w reaktywną formę tlenu) jest ważnym sygnałem, który kontroluje waskulogenezę11,12. W powikłaniach ciąży brak unaczynienia powoduje niedotlenienie, a co ważniejsze, przerywane zmiany natlenienia (zwane hipoksją/reoksygenacją). Stany te prowadzą do nieprawidłowego wzrostu stresu oksydacyjnego, który zagraża żywotności łożyska i płodu13,14. Zmiany, jakie komórki trofoblastu ulegają in vivo podczas epizodów niedotlenienia/reoksygenacji, można naśladować in vitro w następujący sposób: kosmkowe cytotroblasty są utrzymywane w warunkach normoksyjnych (8%O2), aż zróżnicują się w syncytiotrofoblast. Następnie poddaje się je warunkom hipoksyjnym (0,5%O2) przez 4 godziny, po których następuje dodatkowe 18 godzin normoksji (reoksygenacji). Stosując to podejście hipoksji/reoksygenacji, trofoblasty wykazują rozregulowany status redoks i zwiększony poziom wewnętrznej apoptozy8, co zaobserwowano w przypadku niektórych powikłań ciąży. W związku z tym jest to przydatny model in vitro do oceny nowych podejść zapobiegawczych i terapeutycznych do zwalczania powikłań ciąży związanych z niedotlenieniem/reoksygenacją łożyska.
Komórki łożyska produkują melatoninę, która pełni kilka ważnych funkcji, takich jak zdolność do eliminowania stresu oksydacyjnego i dysfunkcji łożyska15. W tym miejscu przedstawiamy podejście eksperymentalne i modele komórkowe stosowane do wykazania ochronnego działania melatoniny w komórkach trofoblastu łożyska na poziomie molekularnym, komórkowym i funkcjonalnym8.

<table><tbody><tr><td>Zakrzywione nożyczki Metzenbaum</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>sprzęt chirurgiczny (izolacja komórek) (2 sztuki)</td></tr><tr><td>Kleszcze do odłamków Fine 41/2 in</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>sprzęt chirurgiczny (izolacja komórek) (2 sztuki)</td></tr><tr><td>Nożyczki 4,5 Str Rozwarstwienie</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>sprzęt chirurgiczny (izolacja komórek) (2 sztuki)</td></tr><tr><td>Gąbka z gazy 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td>361020733</tr><tr><td>Naczynie do pieczenia ze szkła podłużnego</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>Szkło (2,8 l)</td></tr><tr><td>Lejek Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Szkło szklane (średnica 114 mm)</td></tr><tr><td>Szkło zegarkowe&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>Szkło</td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>histologicznego roztworu utrwalającego tkanki</td></tr><tr><td>Kolby trypsynizujące</td> Naczynia szklane <td>Wheaton</td><td>355395</td><td>(1 szt)</td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki hodowlane</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>Wyroby szklane</td></tr> ze <tr><td>szkła borokrzemianowego Pipet Pasteura (22,8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>Naczynia szklane</td></tr><tr><td>250 ml Zlewki szklane</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td>Szkło</td></tr><tr><td>Butelki na media szklane z nakrętką</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>Szkło (8 sztuk)</td></tr><tr><td>Tubka Corex50 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td><td>(1 szt.)</td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa z polistyrenu</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa z polistyrenu</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>sitko do komórek 100 &mu; m Nylon</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Chłonna wkładka</td><td>Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp; ml Butelki Górny filtr</td><td>Corning</td><td></td><td>Pore: 0,22&nbsp; &mikro; m / pożywka i preparat HBSS</td></tr><tr><td>2 ml Fiolki kriogeniczne</td><td>Pojemnik</td> do zamrażania <td>Corning 430488</td><td></td></tr><tr><td>, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>Model P3 Kąpiel</td><td></td></tr><tr><td>wodna z wytrząsaniem</td><td>Fisher</td><td>Model 127</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Roztwór soli 0,9%</td></tr> <tr><td>Hank' s Buforowany roztwór soli (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Ilość: 9,25 (jedna fiolka) na 1 l roztworu wytrawiającego</td></tr><tr><td>Kwas hydroksypiperazynoetanosulfonowy (Hepes)</td><td><a name="ZASIĘG! B29">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>25 ml (1 M) na 1 l roztworu wytrawiającego</td></tr><tr><td>Trypsyna typu I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9,888 U</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza typu IV</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402,000 U</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna Siarczan</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Gradient pożywki wirującej o gęstości. Objętość: 36 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr> Separator magnetyczny <tr><td>sulfotlenku dimetylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Model 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp; Kolumny&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do biegania Automacs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania Automacs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Anty-ludzki oczyszczony klon Hla Abc W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td> przeciwciało <td>przeciw myszom</td></tr><tr><td>Mikrogranulki Igg</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa -&nbsp; 6 dołków z Pokrywka</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Powierzchnia wiązania komórek</td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa -&nbsp; 24 Studnia z pokrywką</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Powierzchnia wiązania komórek</td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa -&nbsp; 96 Studnia z pokrywką</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Powierzchnia wiązania komórek</td></tr><tr><td>Modułowa komora inkubatora&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Zestaw dwóch jest niezbędny do jednoczesnego generowania warunków normoksji i hipoksji/reoksygenacji</td></tr><tr><td>Pojedynczy przepływomierz</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Filtr liniowy</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, pory: 1,0 i mikro; m</td></tr><tr><td>Gas Regulator</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>Zestaw dwóch jest niezbędny do jednoczesnego generowania warunków normoksji i hipoksji/reoksygenacji</td></tr><tr><td>Wąż gazowy Klasa Vi Przezroczysty 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 sztuki z ~ 0,5 m</td></tr><tr><td>17 mm Regulowany zacisk węża gazowego</td><td>Opaska zaciskowa Owijki</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Butla gazowa Normoxia&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Rozmiar K (3rd trymestr skład: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Butla z gazem Normoxia&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Rozmiar K (3rd trymestr skład: 5% CO2, 0,5% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Mikroelektroda tlenowa Mi-730</td><td>Mikroelektrody INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td>Adapter tlenowy</td><td>Mikroelektrody INC</td><td>3572</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do wykrywania ROS: CM-H2DCFDA&nbsp;</td><td>Zestaw Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-hCG ELISA&nbsp;</td><td>DRG międzynarodowe</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-wimentynowe</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>Gospodarz: mysie</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-cytokeratyny 7 (FITC)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>Gospodarz: mysz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H& L przeciwciało</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Ten protokół opisuje, w jaki sposób kosmkowe komórki cytotrofoblastu są izolowane z łożysk w terminie przez kolejne trawienia enzymatyczne, po których następuje wirowanie gęstości, izolacja gradientu pożywki i oczyszczanie immunomagnetyczne. Jak zaobserwowano in vivo, jednojądrzaste komórki cytotrofoblastu kosmków w hodowli pierwotnej różnicują się w wielojądrowe komórki syncytiotrofoblastu po 72 godzinach. W porównaniu z normoksją (8%O2), kosmkowe komórki cytotrofoblastu, które ulegają hipoksji/reoksygenacji (0,5% / 8%O2), ulegają zwiększonemu stresowi oksydacyjnemu i wewnętrznej apoptozie, podobnej do obserwowanej in vivo w powikłaniach ciąży, takich jak stan przedrzucawkowy, przedwczesny poród i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu. W tym kontekście, pierwotne trofoblasty kosmkowe hodowane w warunkach niedotlenienia/reoksygenacji stanowią unikalny system eksperymentalny pozwalający lepiej zrozumieć mechanizmy i szlaki sygnałowe, które są zmienione w ludzkim łożysku i ułatwić poszukiwanie skutecznych leków chroniących przed niektórymi zaburzeniami ciąży. Trofoblasty kosmkowe człowieka wytwarzają melatoninę i wyrażają jej enzymy i receptory syntetyzujące. Melatonina została zasugerowana jako leczenie stanu przedrzucawkowego i wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu ze względu na jej ochronne działanie przeciwutleniające. W pierwotnym modelu komórek cytotrofoblastu kosmków opisanym w tym artykule, melatonina nie ma wpływu na komórki trofoblastu w stanie normoksycznym, ale przywraca równowagę redoks komórek syncytiotrofoblastu zakłóconych przez niedotlenienie/reoksygenację. Tak więc ludzkie komórki trofoblastu kosmków w hodowli pierwotnej są doskonałym podejściem do badania mechanizmów stojących za ochronnym działaniem melatoniny na funkcję łożyska podczas niedotlenienia/reoksygenacji.

Izolacja i immunopuryfikacja komórek cytotrofoblastu kosmkowego z prawidłowej łożyska w terminie, uzyskanej podczas porodu drogą pochwową, pozwoliły na uzyskanie 1 x 108 żywe komórki. Łożysko ważyło 350 g, miało średnicę 19 cm i wysokość 4 cm, kształt dyskowaty oraz przezroczyste błony. Nie stwierdzono malformacji kotyledonów. Pępowina była rozmieszczona paracentralnie i miała długość 56 cm. Czystość oceniono metodą cytometrii przepływowej przy użyciu markerów vimentyny i cytok...

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie efektów ochronnych melatoniny z wykorzystaniem immunopuryfikowanych pierwotnych ludzkich komórek cytotrofoblastu kosmowego, hodowanych w warunkach hipoksji lub reoxygenacji. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu mechanizmów i szlaków sygnałowych związanych z powikłaniami ciąży w przebiegu hipoksji i reoxygenacji łożyska. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania obiecujących metod terapeutycznych, takich jak podawanie melatoniny, w kontekście zaburzeń ciąży związanych ze zwiększonym stresem oksydacyjnym.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z etapami izolacji cytotrofoblastu kosmkowego, takimi jak siekanie tkanek oraz przygotowanie gradientu gęstości do wirowania. Choć metoda ta pozwala na badanie trofoblastu z trzeciego trymestru, może być ona również zastosowana do innych układów, takich jak łożysko z pierwszego trymestru oraz łożyska innych gatunków. Demonstracja wizualna tej metody jest istotna, ponieważ wiele etapów jest trudnych do opanowania bez ich zobaczenia, co może zwiększyć powtarzalność i skrócić czas nauki.Procedurę zademonstrują doktoranci z mojego laboratorium: Andree-Anne Hudon-Thibeaul

human-primary-trophoblast-cell-culture-model-to-study-protective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tradycyjne, dwuwymiarowe techniki hodowli komórkowej często prowadzą do zmian w charakterystyce markerów różnicowania, cytokin i czynników wzrostu. Trójwymiarowa hodowla komórkowa w rotacyjnym systemie hodowli komórkowej (RCCS) przywraca ekspresję wielu z tych czynników, co zaprezentowano tutaj na przykładzie linii komórkowej trofoblastu pozawillousowego.

Rotacyjne systemy hodowli komórkowych dla hodowli ludzkich komórek: ludzkie komórki trofoblastyczne jako model

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Prezentowany tutaj jest protokół pobierania próbek ludzkiej tkanki kosmków łożyskowych, a następnie izolacji cytotrofoblastów do pierwotnej hodowli komórek. Leczenie trofoblastów TNFα podsumowuje stan zapalny w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości i ułatwia odkrycie celów molekularnych regulowanych przez stan zapalny w łożyskach z otyłością matczyną.

Podstawowy model ludzkiego trofoblastu do badania wpływu stanu zapalnego związanego z otyłością matki na regulację autofagii w łożysku

Tutaj prezentujemy wysoce przystępny protokół oceny ruchu komórek w ludzkich komórkach trofoblastu za pomocą trzech testów in vitro: testu zadrapania, testu inwazji transwell i testu proliferacji komórek.

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Różne efekty różnych stopni hipotermii na ochronę mięśnia sercowego nie zostały dokładnie ocenione. Celem niniejszego badania było ilościowe określenie poziomów śmierci komórek po różnych metodach leczenia hipotermii w modelu opartym na ludzkich kardiomiocytach, kładąc podwaliny pod przyszłe dogłębne badania molekularne.

Ocena in vitro ochrony mięśnia sercowego po wstępnym kondycjonowaniu hipotermicznym w modelu ludzkich miocytów serca

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Samoorganizujące się ludzkie organoidy sercowe (hCO) to nowy system modelowania rozwoju i chorób serca u człowieka. Tutaj przedstawiono metodologię generowania i urazu hCOs przy użyciu hipoksji i reoxygenacji oraz szczegóły oczekiwanych wyników histologicznych i funkcjonalnych po urazie.

Model urazu hipoksji i reoxygenacji u samoorganizujących się ludzkich kardioidów

Zstandaryzowany protokół indukowania przedwczesnego starzenia się w HNM z użyciem tBHP, zstandaryzowane protokoły do analizy kluczowych markerów starzenia się, w tym zatrzymania wzrostu, aktywności SA-β-galaktozydazy i czynników SASP.

Znormalizowany protokół wywoływania starzenia się przedwczesnego wywołanego stresem w pierwotnych ludzkich melanocytach z użyciem hydronadtlenku tert-butylu

Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek trofoblastu kosmówkowego i hodowlę w warunkach niedotlenienia/reoksygenacji w celu badania ochronnego działania melatoniny przeciwko stresowi oksydacyjnemu w łożysku.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją (Wideo) | JoVE Journal

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

Przeglądaj więcej filmów