Name: Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Naucz się mikroiniekcji nefrotoksyn u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek. Ta metoda umożliwia obserwację uszkodzeń i regeneracji komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez DP2OD008470 grantu NIH. Dodatkowo RAM był częściowo wspierany przez fundusze dostarczone przez University of Notre Dame Graduate School. Dziękujemy pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych, Centrum Badań nad Danio Pręgowanym oraz Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu Notre Dame. Szczególnie dziękujemy członkom laboratorium za angażujące dyskusje na temat biologii nerek i ich pomocne opinie na temat tej pracy.

Procedury pracy z zarodkami danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować 50-krotny roztwór podstawowy pożywki dla zarodków E3, mieszając 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 i 9,95 gMgSO4 w 5 l wody destylowanej i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W przypadku hodowli zarodków danio pręgowanego rozcieńczyć 50x roztwór podstawowy podłoża zarodkowego E3 do 1x roztworu roboczego wodą destylowaną, a następnie dodać 200 μl 0,05% błękitu metylenowego do każdego 1 litra 1x E3, aby działał jako fungicyd i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować roztwór blokujący pigmentację pożywki zarodkowej E3 z 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznik (PTU), łącząc 40 ml 50-krotnego E3 z 0,06 mg PTU. Następnie doprowadzić objętość do całkowitej objętości 2 l wodą destylowaną.</li>
	<li>Wymieszaj E3/PTU O/N w temperaturze pokojowej, aby proszek PTU znalazł się w roztworze. Następnie przechowuj E3/PTU w RT. 
	Uwaga: E3/PTU ma okres trwałości około jednego tygodnia, a starsze roztwory będą mniej skuteczne w blokowaniu rozwoju pigmentacji u larw danio pręgowanego.</li>
	<li>Przygotować roztwór znieczulający 0,2% trikainy (MS-222), dodając 1 g trikainy do 500 ml wody destylowanej i dostosować pH do 7,2 za pomocą 1 M Tris, pH 9,5.</li>
	<li>Przygotować do przygotowania 2% roztworu metylocelulozy do obrazowania, umieszczając roztwór 1x E3 (bez błękitu metylenowego), z dodatkiem 1/10 objętości 0,2% trikainy w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Roztwór metylocelulozy jest gęstym, przezroczystym roztworem, który służy do delikatnej stabilizacji żywych zarodków do mikroskopii. Po wykonaniu manipulacji zarodki można umyć w 1x E3 w celu rozpuszczenia metylocelulozy bez uszkadzania zwierzęcia i umożliwienia mikroskopii na kolejnych etapach w tej samej próbce.</li>
	<li>Po schłodzeniu do temperatury 4 °C energicznie wymieszać 1x roztwór E3/Tricaine na płytce mieszającej i stopniowo dodawać odpowiednią ilość proszku metylocelulozy, kontynuując energiczne mieszanie. Stopniowo dodawać proszek do roztworu, aby zapobiec tworzeniu się nierozpuszczalnych agregatów metylocelulozy.</li>
	<li>Po zmieszaniu całego proszku z 2% roztworem metylocelulozy/E3/trikainy, wymieszać roztwór złożony w chłodni o temperaturze 4 °C O/N. 
	Uwaga: Niska temperatura jest najlepsza do całkowitego rozpuszczenia proszku. Jeśli roztwór nie jest klarowny po jednej nocy, mieszaj przez dodatkowy dzień roboczy i/lub drugi O/N.</li>
	<li>Aby usunąć pęcherzyki powietrza z 2% roztworu metylocelulozy/E3/trikainy, należy podzielić mieszaninę na probówki o pojemności 1,5 ml i wirować z dużą prędkością (12 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 30 minut lub do 2 godzin.</li>
	<li>Umieścić 2% roztwór metylocelulozy/E3/trikainy w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania. 
	Uwaga: Przed użyciem porcje powinny być wstępnie podgrzane do RT do pracy z okazami danio pręgowanego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie narzędzi
<ol>
	<li>Przygotuj narzędzie do manipulowania zarodkami, używane do pozycjonowania zarodków do mikrowstrzyknięcia, mocując końcówkę ładującą żel na końcu 5-calowej prostej igły preparacyjnej i zabezpiecz taśmą lub klejem superglue.</li>
	<li>Przygotuj igły do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do igieł, najpierw umieszczając w instrumencie polerowane ogniowo szkło borokrzemianowe o średnicy 10 cm z żarnikiem i zabezpiecz szkło borokrzemianowe, dokręcając uchwyty.</li>
	<li>Pociągnij szkło borokrzemianowe, aby uzyskać drobno stożkowe igły. Użyj następujących ustawień: ciepło 540, ciąg 245, prędkość 200 i czas 125.</li>
	<li>Umieść igły wewnątrz szalki Petriego, zawieszając je na pasku plasteliny, aby chronić końcówki igieł, i trzymaj naczynie przykryte, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.</li>
	<li>Aby zakończyć przygotowanie igły do mikroiniekcji, użyj żyletki lub cienkiej krawędzi kleszczy, aby przeciąć naciągnięty koniec igły, aby utworzyć ostrą, kątową końcówkę iniekcji o średnicy około 0,05-0,1 mm.</li>
	<li>Aby przygotować tackę do mikroiniekcji, należy przygotować 1,5% roztwór agarozy/E3 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml i rozpuścić agarozę, podgrzewając E3 do wrzenia w kuchence mikrofalowej, a następnie pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.</li>
	<li>Wlej schłodzony roztwór agarozy/E3 na szalkę Petriego, aby utworzyć fundament o głębokości około 0,5 cm. Gdy to zastygnie, wlej drugą warstwę o głębokości około 0,3 cm i włóż prefabrykowaną formę do studzienki zarodkowej i pozwól agarozie zestalić się w temperaturze RT. 
	Uwaga: Podczas wkładania formy do górnej warstwy agaru/E3, umieść formę w agarze pod kątem, aby zmniejszyć liczbę pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Gdy cała tacka do mikroiniekcji jest już ustawiona, należy dobrze podnieść prefabrykowany zarodek, powoli i ostrożnie uformować za pomocą czerpaka, a następnie napełnić naczynie roztworem E3 i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Skonfiguruj zbiorniki godowe danio pręgowanego, umieszczając przegrody w komorach godowych i napełnij wodą systemową.</li>
	<li>Umieścić po jednej rybie z każdej strony przegrody w taki sposób, aby w każdej komorze krynowej znajdowała się jedna samica i jeden samiec ryby, a następnie przykryć każdą komorę kryjową.</li>
	<li>Następnego ranka usuń przegrody, aby umożliwić tarło.</li>
	<li>Sprawdź ryby po około 30 minutach, a po powrocie dorosłych do akwarium zbierz ich zarodki, przepuszczając wodę ze zbiornika godowego przez drobne sitko z siatki drucianej.</li>
	<li>Odwróć sitko na szalce Petriego i spłucz E3, aby zebrać zarodki.</li>
	<li>Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C O/N.</li>
	<li>Gdy zarodki osiągną stadium 24-26 somitów26, zdekantować większość pożywki E3, a następnie dokonać dechorionatu, dodając 100 μl 50 mg/ml pronazy do każdej szalki z zarodkami i inkubując szalkę w temperaturze 23 °C) przez około 15 minut 
	Uwaga: Potrzeba około 24-25 godzin od momentu zapłodnienia, aby zarodki osiągnęły stadium somitów 24-26, jeśli zostaną zebrane w opisany sposób i inkubowane O/N w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Napełnij naczynie E3, a następnie delikatnie zamieszaj, aby usunąć kosmówkę z zarodków.</li>
	<li>Zdekantować E3/pronazę i opłukać naczynie 25 ml świeżego E3. Powtórz etap płukania, aby usunąć całą pronazę.</li>
	<li>Aby zahamować rozwój pigmentacji, należy zdekantować E3 i zastąpić 25 ml świeżego E3/PTU, gdy zarodki osiągną 24 godziny po zapłodnieniu. 
	Uwaga: W przypadku eksperymentów trwających kilka dni należy raz dziennie zastąpić roztwór E3/PTU świeżymi pożywkami, aby utrzymać naczynie w czystości.</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja roztworu nefrotoksyny
<ol>
	<li>W dniu wstrzyknięcia należy przygotować żądany roztwór nefrotoksyny wraz z odpowiednią kontrolą nośnika.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj lub wymieszaj, aby upewnić się, że lek(i) jest/są w roztworze, sprawdzając boki rurki i górną część słupa wody. 
	Uwaga: Roztwory nefrotoksyn można przygotować tak, aby zawierały śladowe ilości fluorescencyjnie sprzężonego dekstranu w celu monitorowania skuteczności mikroiniekcji, a także oceny klirensu nerkowego w kolejnych punktach czasowych20,28.</li>
	<li>Załaduj przyciętą igłę do mikroiniekcji ~ 2-3 μl nefrotoksyny, nawlekając cienką końcówkę ładującą żel z tyłu igły i zawieś igłę pionowo za pomocą kawałka taśmy, aby roztwór mógł wypełnić przyciętą końcówkę igły grawitacyjnie.</li>
	<li>Gdy końcówka igły jest pełna, zabezpiecz załadowaną igłę w mikromanipulatorze.</li>
	<li>Zbadaj objętość mikroiniekcji, umieszczając kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i wstrzyknij do oleju, aby ocenić wielkość kropli. Objętość wtrysku 500 pl ma średnicę 0,1 mm.</li>
	<li>Wyjąć szalkę z zarodkami z inkubatora i znieczulić, dodając około 5 ml 0,2% trikainy do szalki z zarodkami.</li>
	<li>Aby zapewnić całkowite znieczulenie, delikatnie dotknij zarodka końcówką narzędzia do manipulowania zarodkami. Brak ruchu wskazuje na wystarczające znieczulenie.</li>
	<li>Po udanym znieczuleniu przenieś zarodki do formy iniekcyjnej za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Manewruj każdym zarodkiem w innym dołku pleśni, umieszczając głowę w najgłębszym obszarze studzienki tak, aby tułów spoczywał wzdłuż zagłębienia, a ogon wystawał z zagłębienia.</li>
	<li>Wprowadzić wypełnioną igłę do mikromanipulatora i umieścić końcówkę igły obok zarodka.</li>
	<li>Delikatnie włóż igłę do naczynia ogonowego, przesuwając joystick do przodu i wciśnij pedał nożny, aby wprowadzić mikrowstrzyknięcie. 
	Uwaga: Udane wstrzyknięcie można ocenić, obserwując, jak ciecz wchodzi do obiegu. Co więcej, jednoczesne wstrzyknięcie nefrotoksyny z fluorescencyjnie sprzężonym dekstranem umożliwia badaczowi zweryfikowanie udanego wstrzyknięcia po zabiegu.</li>
	<li>Delikatnie pociągnij joystick do tyłu, aby wyjąć igłę z zarodka.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu przenieść zarodki do czystego naczynia i spłukać w celu usunięcia trikainy i zastąpić ją świeżym E3/PTU.</li>
	<li>Inkubuj zarodek do pożądanego punktu czasowego, aby ocenić morfologię, którą można udokumentować za pomocą fotografii w pożywce montażowej metylocelulozy lub procesu analizy eksperymentalnej zgodnie z życzeniem. 
	Uwaga: Powrót do zdrowia zarodków powinien być oceniany w celu określenia odsetka osób z obrzękiem, który zwykle wskazuje na uszkodzenie nerek.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Z AKI29 powiązano różnorodną liczbę środków terapeutycznych. Poczyniono znaczne postępy w badaniach nad zrozumieniem szkód indukowanych przez wiele pojedynczych związków, takich jak aminoglikozyd gentamycyna30 i szeroko stosowana chemioterapeutyk cisplatyna31,32. Niektóre zmiany patologiczne związane z tymi stanami pozostają jednak przedmiotem trwających badań. Jednym z najpoważniejszych wyzwań pozostaje zrozumienie, w jaki sposób wiele leków niekorzystnie wpływa na pacjentów, zwłaszcza w...

AKI to nagła utrata funkcji nerek, która może prowadzić do katastrofalnych konsekwencji zdrowotnych1. AKI jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie ze względu na wysoką częstość występowania wynoszącą około 20% wśród hospitalizowanych pacjentów, z jeszcze wyższymi wskaźnikami 30-50% w przypadkach intensywnej terapii i osób starszych oraz śmiertelnością 50-70%1-3. Niestety, częstość występowania AKI rośnie i przewiduje się, że będzie się dalej nasilać w ciągu następnej dekady, częściowo ze względu na różnorodność czynników, które mogą indukować AKI, w tym stres pooperacyjny, niedokrwienie i narażenie na nefrotoksyny, takie jak antybiotyki i chemioterapeutyki.
AKI wiąże się z nagłym uszkodzeniem komórek w nerkach, często występującym w nefronach, które są podstawowymi jednostkami funkcjonalnymi i składają się z filtra krwi i segmentowanego kanalika, który odprowadza mocz do centralnych kanałów zbiorczych1. Gdy znaczna liczba nefronów zostaje uszkodzona podczas AKI, natychmiastowe skutki obejmują przerwę w usuwaniu odpadów z krążenia oraz zmniejszony lub zniesiony przepływ płynu przez nefrony z powodu niedrożności ze strony martwych i umierających komórek1. Z biegiem czasu niedrożność kanalików może prowadzić do zwyrodnienia całych nefronów, co trwale zmniejsza czynność nerek1. Fizjologiczne zmiany w nerkach po AKI obejmują również złożone zdarzenia zapalne, które mogą prowadzić do przewlekłych bliznowaceń1.
Pomimo tych wyników, nefrony mają pewną zdolność do regeneracji po AKI, która odtwarza nabłonek rurkowy5,6. Chociaż istnieje coraz większa wiedza molekularna na temat regeneracji nefronów, mechanizmy te pozostają nieuchwytne pod wieloma względami i wymagajądalszych badań7. Stopień, w jakim AKI powoduje trwałe uszkodzenie nerek, również pozostaje nieznany. Obecne badania sugerują, że potencjał regeneracyjny nerek jest najwyższy po mniej ciężkich przypadkach AKI, podczas gdy bardziej wyraźne lub powtarzające się epizody prowadzą do przewlekłej choroby nerek (PChN) i prowadzą do schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), która wymaga ratującego życie przeszczepu lub dializy8,9. Ponadto osoby już cierpiące na PChN są narażone na jeszcze większe ryzyko zachorowania na ciężki epizod AKI8,9. Podsumowując, jasne jest, że kontynuowanie badań podstawowych i klinicznych jest niezbędne do zrozumienia, leczenia i zapobiegania AKI.
Badania na modelach zwierzęcych były kluczowe w docenieniu postępu lokalnych i środowiskowych zmian, które zachodzą podczas AKI10. Aby poszerzyć tę wiedzę, a także opracować nowe terapie, model zwierzęcy danio pręgowanego został wykorzystany na różne sposoby11,12. Nefrony nerki danio pręgowanego, zarówno u zarodka, jak i osobnika dorosłego, wykazują wysoki stopień ochrony u ssaków13-16. Co więcej, uszkodzenie nabłonka nefronów u danio pręgowanego przypomina proces u wyższych kręgowców, w którym po miejscowym zniszczeniu komórek kanalikowatych następuje proliferacja wewnątrzkanalikowa i przywrócenie architektury nefronów17-19. Jednak w zarodku rozległe uszkodzenie kanalików przez nefrotoksyny, takie jak cisplatyna, wiąże się ze śmiertelnością20,21. Dla porównania, dorosłe rybki danio pręgowanej przeżywają AKI i wykazują znaczne zdolności regeneracyjne w nerkach. Na przykład, po ekspozycji na antybiotyk aminoglikozydowy gentamycynę, danio pręgowany regeneruje uszkodzenia nabłonka kanalików i wytwarza nowe jednostki nefronów22-24. Chociaż te indukowane gentamycyną badania AKI dostarczyły bezcennych informacji, zrozumienie uszkodzenia nerek przez różne nefrotoksyny pozostaje kluczowe, aby docenić efekty i reakcję na różne rodzaje uszkodzeń.
Zarodek danio pręgowanego, ze względu na swoją wielkość, przezroczystość i genetyczną wykonalność, ma wiele zalet dla badań nad nefrotoksynami25, gdzie metoda mikroiniekcji20,21 jest używana do podawania cząsteczki (cząsteczek) do badań. Nefrony powstają w ciągu 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) i zaczynają filtrować krew o około 48 hpf26,27. W ten sposób szybkie tworzenie i funkcja embrionalnej nerki ułatwia analizę eksperymentalną. Jednak proces mikroiniekcji wiąże się z wyzwaniami technicznymi, a opanowanie tej techniki może wymagać stromej krzywej uczenia się. W tym artykule wideo opisujemy, jak wykonywać mikrozastrzyki i podajemy wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, aby zwiększyć wskaźnik udanych zastrzyków.

<table><tbody><tr><td>Amerykański</td><td>AB01915</td><td></td><td>bioanalityczny</td></tr><tr><td>Amerykański Chlorek potasu</td> Amerykański <td>AB01652</td><td></td><td>Bioanalityczny</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td> Amerykański <td>AB00366</td><td></td><td>bioanalityczny</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu (trikaina)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Jednorazowe szalki Petriego, sterylne, Corning:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;( taca do mikroiniekcji) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator niskotemperaturowy</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Mikro pęseta preparcyjna</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>Mikrometr RS-5010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nerki są podatne na uszkodzenia spowodowane ekspozycją na substancje chemiczne, które filtrują z krwiobiegu. Może to prowadzić do uszkodzenia narządów związanego z szybkim pogorszeniem czynności nerek i rozwojem zespołu klinicznego znanego jako ostre uszkodzenie nerek (AKI). Środki farmakologiczne stosowane w leczeniu różnych schorzeń, od infekcji bakteryjnej po raka, podawane pojedynczo lub w połączeniu z innymi lekami, mogą zainicjować AKI. Danio pręgowany jest użytecznym modelem zwierzęcym do badania wpływu chemicznego na czynność nerek in vivo, ponieważ tworzą embrionalną nerkę składającą się z jednostek funkcjonalnych nefronów, które są konserwatywne z wyższymi kręgowcami, w tym z ludźmi. Co więcej, danio pręgowany może być wykorzystywany do wykonywania genetycznych i chemicznych badań przesiewowych, które dają możliwość wyjaśnienia komórkowych i molekularnych aspektów AKI oraz opracowania strategii terapeutycznych, takich jak identyfikacja cząsteczek nefroprotekcyjnych. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób mikroiniekcja do zarodka danio pręgowanego może być wykorzystana jako paradygmat do badań nefrotoksyn.

Konfiguracja stanowiska do mikroiniekcji obejmuje stereomikroskop, mikromanipulator oraz regulator ciśnienia (Ryc. 1A). Podczas tej procedury zaleca się stosowanie oświetlenia przechodzącego płytki iniekcyjnej w celu lepszej widoczności okazów (Ryc. 1B). Przygotowanie igły do iniekcji polega na wyciągnięciu odpowiedniego szkła borokrzemianowego, a następnie przygotowaniu krawędzi poprzez odcięcie oraz końcowym napełnieniu igły od tyłu. Optymalnie końcówka...

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie rybek zebrafish do obserwacji wpływu nefrotoksyn, takich jak gentamycyna lub cisplatyna, w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że model zebrafish umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym uszkodzeń komórek oraz regeneracji po ostrym uszkodzeniu nerek. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować narzędzie do manipulacji embrionami w celu ich ustawienia do mikroiniekcji, mocując końcówkę do nakładania żelu na końcu pięciocalowej prostej igły sekcyjnej i zabezpieczając ją taśmą lub superklejem.Następnie należy przygotować cienkie, stożkowate igły do mikroiniekcji, wyciągając wypalane ogniowo szkło borokrzemianowe za pomocą wyciągarki do pipet. Następnie, używając żyletki lub krawędzi precyzyjnej pęsety, należy odciąć końcówki igieł, aby uzyskać ostre, kątowe wierzchołki do iniekcji. W dalszej kolejności igły należy umieścić na pasku plasteliny w szalce Petriego, aby zabezpieczyć ich końcówki.Aby przygotować tackę do mikroiniekcji, należy sporządzić 1,5% roztwór agarozy w E3 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml, rozpuszczając agarozę w E3 w kuchence mikrofalowej. Następnie należy pozwolić mieszaninie ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około dziesięć minut. Schłodzony roztwór agarozy w E3 wlać do szalki Petriego, aby utworzyć warstwę o grubości około 0,5 cm.Po zastygnięciu wlej drugą warstwę roztworu agarozy E3. Następnie wstaw prefabrykowaną formę do dołków na embriony w agar, pod kątem, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, i pozwól agarozie zastygnąć w temperaturze pokojowej. Gdy cała tacka do mikroiniekcji stwardnieje, powoli i ostrożnie wyjmij prefabrykowaną formę do dołków na embriony, następnie napełnij naczynie roztworem E3 i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W tej procedurze należy przygotować zbiorniki do rozrodu rybek zebrafish, umieszczając przegrody w komorach rozrodczych i wypełniając je wodą systemową. Następnie należy umieścić po jednej rybie po każdej stronie przegrody, tak aby każda komora zawierała jedną samicę i jednego samca, a następnie przykryć obie komory. Następnego ranka należy usunąć przegrody, aby umożliwić tarło.Po około 30 minutach należy sprawdzić, czy na dnie zbiornika znajdują się embriony. Następnie ryby należy przenieść z powrotem do akwarium, a embriony zebrać, przepuszczając wodę ze zbiornika do zapłodnienia przez drobne sito z drucianej siatki. Następnie sito należy odwrócić nad szalką Petriego i przepłukać roztworem E3 w celu zebrania embrionów.Następnie inkubować zarodki w temperaturze 28.5 °C przez noc. Gdy zarodki osiągną stadium 24 do 26 somytów, odlać większość medium E3. Następnie przeprowadzić dechorionację, dodając medium E3, a następnie 100 µL pronazy o stężeniu 50 mg/mL do każdej płytki z zarodkami i inkubując zarodki w temperaturze 28 °C przez 15 minut.Po 15 minutach napełnij naczynie medium E3, a następnie delikatnie zakręć nim, aby oddzielić choriony od embrionów. Następnie odlej E3 z pronazą i wypłucz naczynie 25 mililitrami świeżego E3. Aby zablokować rozwój pigmentacji, 24 godziny po zapłodnieniu zastąp E3 25 mililitrami świeżego E3 PTU. W przypadku eksperymentów trwających kilka dni, wymieniaj roztwór E3 PTU na świeżą pożywkę raz dziennie, aby utrzymać czystość naczynia.W dniu iniekcji należy przygotować wybrany roztwór nefrotoksyny wraz z odpowiednią kontrolą nośnika. Próbkę należy wymieszać w wortexie lub delikatnie zmieszać ręcznie. Następnie należy sprawdzić ścianki probówki oraz powierzchnię słupa cieczy, aby upewnić się, że substancje lecznicze całkowicie rozpuściły się w roztworze.Napełnij przyciętą igłę do mikroiniekcji dwiema do trzech mikrolitrów nefrotoksyny, wprowadzając cienką końcówkę do nakładania żelu do tylnej części igły, a następnie zawieś igłę pionowo za pomocą kawałka taśmy, aby roztwór wypełnił przyciętą końcówkę igły pod wpływem grawitacji. Gdy końcówka igły zostanie całkowicie wypełniona, zamocuj napełnioną igłę w mikromanipulatorze. Sprawdź objętość mikroiniekcji, umieszczając kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i wykonując wtrysk do oleju w celu oceny wielkości kropelki.Następnie wyjmij szalkę z zarodkami z inkubatora i znieczul je, dodając pięć mililitrów 0,2% tricaine do szalki z zarodkami. Następnie przenieś zarodki do formy do iniekcji za pomocą pipety transferowej. Umieść każdy zarodek w oddzielnej studzience formy, kierując głowę do najgłębszej części studzience tak, aby tułów spoczywał wzdłuż wgłębienia, a ogon lekko wystawał.Teraz należy włożyć napełnioną igłę do mikromanipulatora i ustawić jej końcówkę obok zarodka. Ostrożnie wprowadź igłę do żyły ogonowej w celu wykonania mikroiniekcji. Najbardziej krytycznym etapem procedury jest sama mikroiniekcja.Aby zapewnić sukces, igłę należy odciąć pod ostrym kątem, a następnie ostrożnie przesunąć w pozycję obok zarodka. Jeśli wstrzyknięcie przebiegnie pomyślnie, powinno być widoczne wprowadzanie cieczy do krwiobiegu. Współwstrzykiwanie substancji nefrotoksycznej wraz z dekstryną sprzężoną z fluorescencyjnym znacznikiem umożliwiłoby badaczowi weryfikację powodzenia zabiegu po zakończeniu procedury.Następnie ostrożnie wyjmij igłę z embrionu. Przenieś embrion do czystego naczynia i wypłucz, aby usunąć tricainę, używając świeżego roztworu E3 PTU. Potem inkubuj embrion do pożądanego punktu czasowego w celu oceny morfologii, którą można udokumentować fotograficznie w medium montażowym z metylocelulozy.Lub poddać procesowi analizy eksperymentalnej według uznania. Należy pamiętać, że przeżywalność embrionów powinna być oceniana co 12 do 24 godzin po wstrzyknięciu w celu określenia procenta osobników z obrzękami, co powszechnie wskazuje na uszkodzenie nerek. Przezroczystość embrionu danio pręgowanego ułatwia procedurę mikroiniekcji i może zostać dodatkowo zwiększona poprzez chemicznąy obróbkę PTU w 24 hpf, aby ograniczyć rozwój pigmentacji w typowym przebiegu eksperymentu.W tym przypadku pozwolono zarodkom na rozwój do stadium 72 hpf, a następnie poddano je pozorowanej iniekcji, mikroiniekcji soli fizjologicznej lub mikroiniekcji gentamycyny w stężeniu 2,5 mg/ml. Następnie przeprowadzono obserwację na żywo w pierwszym i drugim dniu po iniekcji, wykorzystując oświetlenie prześwietlające w mikroskopie stereoskopowym. W porównaniu z zarodkami poddanymi pozorowanej iniekcji lub iniekcji soli fizjologicznej, jedynie osobniki po iniekcji gentamycyny wykazały rozwój obrzęku.W tym przypadku wystąpił obrzęk osierdziowy sugerujący zniesienie prawidłowej czynności nerek, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi obserwacjami. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak hybrydyzacja C2 w preparacie całego organizmu (whole mount), aby ocenić zmiany w ekspresji genów po ekspozycji na nefrotoksynę.

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy technikę mikroiniekcji aminoglikozydu, gentamyciny, do larw zebrafish w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf) w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek (AKI). Opisujemy również metodę immunohistochemii całego preparatu, zatapiania w plastiku i sekcjonowania larw zebrafish w celu wizualizacji uszkodzeń wywołanych przez AKI.

Dożylne mikroiniekcje u larw rybiek zebra w celu badania ostrego uszkodzenia nerek

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) u ludzi jest częstym problemem klinicznym spowodowanym uszkodzeniem komórek nabłonkowych tworzących nefrony nerkowe, a AKI wiąże się z wysoką śmiertelnością na poziomie 50-70%1. Po zniszczeniu komórek nabłonkowych nefrony mają ograniczoną zdolność do regeneracji, choć mechanizmy i ograniczenia sterujące tym zjawiskiem pozostają słabo poznane. W niniejszym artykule wideo opisujemy naszą technikę celowanej ablacji laserowej komórek nefronu nerki w nerce zarodka ryby...

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Ten film demonstruje dożylne wstrzykiwanie nefrotoksyn do żyły ogonowej zarodka danio pręgowanego w celu zbadania ich chemicznego wpływu na czynność nerek.

Dożylne mikrowstrzyknięcie nefrotoksyn do zarodka danio pręgowanego: technika dostarczania środków nefrotoksycznych do krwiobiegu zarodka danio pręgowanego

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Ta praca przedstawia nowy model in vivo segmentowego uszkodzenia nerek przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego GFP. Model pozwala na indukcję celowanej ablacji komórek nabłonka nerek w celu ukazania komórkowych mechanizmów uszkodzenia i naprawy nefronów.

Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

W niniejszym artykule prezentujemy metodę przeprowadzania HCT u dorosłych danio pręgowanych.

Przeszczepianie całego szpiku nerkowego u dorosłych danio pręgowanych

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Naucz się mikroiniekcji nefrotoksyn u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek. Ta metoda umożliwia obserwację uszkodzeń i regeneracji komórek w czasie rzeczywistym.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Przeglądaj więcej filmów