Name: In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj metodę testów transkrypcji in vitro do badania regulacji transkrypcji i aktywności inhibitorów antybakteryjnych. Technika umożliwia bezpośrednią wizualizację produktów RNA na żelu sekwencjonującym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca potwierdza przyznanie stypendium na wczesną karierę naukową z Uniwersytetu w Newcastle (CM).

Uwaga: Eksperymenty obejmują użycie radioaktywnego izotopu 32P i nie należy podejmować żadnych prac, dopóki nie zostaną spełnione wszystkie odpowiednie warunki bezpieczeństwa. Ogólnie rzecz biorąc, personel jest zobowiązany do uczestnictwa w kursie bezpieczeństwa i poddania się nadzorowanej praktyce przed eksperymentami z użyciem odczynników radioaktywnych. Podczas przeprowadzania reakcji należy nosić środki ochrony osobistej (dozymetr termoluminescencyjny, okulary ochronne, rękawice, fartuchy laboratoryjne do radiacji, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami).
1. Przygotowanie materiałów testowych
<ol>
	<li>Uzyskać białka wymagane do testu transkrypcji.
	<ol>
		<li>W opisanym tutaj eksperymencie należy nadprodukować i oczyścić RNAP E. coli w laboratorium, jak opisano11, lub uzyskać ze źródła komercyjnego (Lista materiałów). 
		Uwaga: Oba dają podobne wyniki. Można również stosować inne metody oczyszczania RNAP natywnego lub znakowanego powinowactwem12,13. Współczynniki Sigma/NusA można uzyskać zgodnie z opisem w poprzedniej pracy14,15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie uzdatnionego pirowęglanu dietylu (DEPC) 
	Uwaga: Alternatywnie, wodę wolną od RNaz można uzyskać ze źródeł komercyjnych (lista materiałów).
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml pirowęglanu dietylu (DEPC) do 1 l oczyszczonej wody (0,1% v/v) i mieszać przez noc.</li>
		<li>Autoklaw DEPC woda i końcówki dwa razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie matrycy DNA
	<ol>
		<li>Oczyść plazmid pSG115416 i/lub pIA22617 za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu (lista materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Aby amplifikować matrycę do testów transkrypcji spływowej (fragment 360 pz obejmujący region promotora ksylu P), należy przeprowadzić reakcję PCR na lodzie, w tym 25 μl mieszaniny 2x PCR (lista materiałów), po 2 μl każdy ze starterów (5 μM): 5′-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3′ (do przodu) i 5′-CCCATTAACATCACCATC-3′ (do tyłu), 1 μl preparatu plazmidowego pSG1154 (250 μM) i 20 μl oczyszczonej wody).
		<ol>
			<li>Lub alternatywnie, w przypadku testów transkrypcji pojedynczej rundy, amplifikować fragment 447 pz obejmujący region promotora λ PR z pIA22617. Przygotuj reakcję PCR na lodzie, używając 25 μl 2x mieszanki PCR, po 2 μl każdy ze starterów (5 μM): 5′-GTGCTCATACGTTAAATCT-3′ (do przodu) i 5′-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3′ (do tyłu), 1 μl preparatu plazmidowego pIA22617 (250 μM) i 20 μl oczyszczonej wody). 
			Uwaga: W tej matrycy brakuje cytozyny aż do pozycji +26 nt, która jest 26. nukleotydem z miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Dlatego transkrypcja przy użyciu tego szablonu pozwoli na inicjację, usunięcie promotora i zatrzymanie na poziomie +26 nt w celu utworzenia stabilnego kompleksu elongacji transkrypcji (EC), gdy w reakcji obecne są tylko ATP, UTP i GTP.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw reakcję PCR w następujących warunkach: 95 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund, powtarzając przez 30 cykli.</li>
		<li>Oczyść produkt za pomocą zestawu do czyszczenia PCR (lista materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i wymyj w 100 μl buforu transkrypcyjnego do testu transkrypcji.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie matrycowego DNA za pomocą fluorospektrometru (wykaz materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie NTP 
	Uwaga: NTP można uzyskać z różnych źródeł komercyjnych (lista materiałów).
	<ol>
		<li>Rozpuścić NTP (o czystości ≥99%) w wodzie uzdatnionej DEPC, aby uzyskać 1 M bulion, podamy 1 ml roztworu do probówek o pojemności 1,5 ml (po 50 μl w każdej probówce) i przechowujemy w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Zamów α-32P UTP (3,000 Ci/mmol) przed eksperymentem. Rozdział 32P ma krótki okres półtrwania wynoszący 14,29 dni. 
		Uwaga: Korzystanie z UTP z oznaczeniem alfa pozwala uniknąć porównywania intensywności pasm o różnej długości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie drabinki RNA
	<ol>
		<li>Przeprowadzić następującą reakcję w temperaturze pokojowej: 0,5 μg mieszaniny matryc RNA (lista materiałów), 80 mM bufor HEPES o pH 7,5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP/CTP/GTP, 0,5 mM UTP, 2 μl α-32P UTP, 0,5 μl T7 RNAP (lista materiałów), woda uzdatniona DEPC do 20 μl.</li>
		<li>Pozostawić reakcję do obrotu w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie żelu do sekwencjonowania RNA
<ol>
	<li>Przygotowanie żelu
	<ol>
		<li>Wyczyść płytki z aparatu do sekwencjonowania z żelu (Lista Materiałów) dwukrotnie 70% etanolem i oczyszczoną wodą, a następnie zmontuj komórkę za pomocą grzebienia i dwóch przekładek. 
		Uwaga: Jedna płytka może być pokryta odczynnikiem silikonowym (Lista materiałów), aby ułatwić usuwanie żelu w kroku 4.2.</li>
		<li>Rozpuścić 33,6 g mocznika w 22 ml wody i 16,4 ml 5x buforu Tris/Boran/EDTA (TBE) (54 g tris(hydroksymetylo)aminometanu; 27,5 g kwasu borowego; 10 ml 1 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), pH 7,4 w 1 l wody) za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Dodać 16 ml 40% roztworu akryloamidu/bis-akrylamidu (19:1) do roztworu mocznika i przefiltrować przez filtr 0,45 μm.</li>
		<li>Do przefiltrowanego roztworu dodać 514 μl 10% (m/v) świeżo przygotowanego nadsiarczanu amonu do wody, a następnie 51,4 μl N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).</li>
		<li>Delikatnie odwrócić roztwór żelu, aby uniknąć nadmiernego napowietrzenia, a następnie natychmiast i płynnie wstrzyknąć do poziomo umieszczonej, wstępnie wypełnionej komórki sekwencjonującej od dolnego otworu iniekcyjnego. Należy uważać, aby podczas wstrzykiwania nie tworzyć pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Odczekaj 1-1,5 godziny, aż żel całkowicie stwardnieje przed użyciem w teście transkrypcji. Żel może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez dwa lub trzy dni, gdy jest owinięty wilgotną wodą chusteczką na wierzchu komórki sekwencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Reakcja na transkrypcję
<ol>
	<li>Wydłużenie transkrypcji wstrzymujące test
	<ol>
		<li>Tworzenie kompleksu wydłużającego transkrypcję
		<ol>
			<li>Dodać 1 μl enzymu rdzeniowego RNAP (1 μM zapas w buforze transkrypcyjnym) do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Dodać 1 μl oczyszczonego czynnika sigma-70 (σ70; 3 μM zapasu w buforze transkrypcyjnym) do RNAP i inkubować na lodzie przez 10 minut, aby wytworzyć holoenzym RNAP.</li>
			<li>Dodać 3 μl oczyszczonej matrycy DNA o długości 500 nM (promotor λ PR z produktu pIA226 PCR) w buforze transkrypcyjnym do holoenzymu RNAP i inkubować w temperaturze 37 ºC przez 5 minut, aby utworzyć otwarty kompleks.</li>
			<li>Przygotować mieszaninę składników reakcji w innej probówce o pojemności 1,5 ml, używając 5 μl 10-krotnego buforu transkrypcyjnego (Lista materiałów: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50% glicerolu, pH 7,9 w wodzie uzdatnionej DEPC), 2 μl po 250 μM każdy GTP i UTP, 1 μl 1 mM ATP, i 1 μl α-32P UTP (3 000 Ci/mmol). Dodaj uzdatnioną wodę DEPC do 41 μl. 
			Uwaga: Inhibitor RNazy (lista materiałów) może być stosowany w celu zminimalizowania zanieczyszczenia RNazą.</li>
			<li>Przenieść roztwór mieszaniny do probówki zawierającej otwarty kompleks i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby utworzyć kompleks wydłużający transkrypcję zatrzymany na +26 nt.</li>
			<li>Przenieść reakcję do temperatury pokojowej (~21 °C) i dodać 1 μl 2,5 mg/ml ryfampicyny do końcowego stężenia 50 μg/ml.</li>
			<li>Dodać 1 μl 0,1 mM oczyszczonego NusA do mieszaniny reakcyjnej i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodać 2 μl 250 μM CTP do mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać końcową objętość 50 μl i zmierzyć czas reakcji za pomocą timera.</li>
			<li>Przenieść 5 μl roztworu reakcyjnego do 2 μl buforu ładującego żel RNA (95% formamidu, 0,05% błękitu bromofenolowego i 0,05% cyjanolu ksylenowego) po 30, 60, 120, 240, 480 i 1,200 sekundach w celu wygaszenia reakcji.</li>
			<li>Końcówki i rurki 32P UTP należy wyrzucić do pojemnika na odpady radioaktywne.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test inicjacji transkrypcji
	<ol>
		<li>Powstanie kompleksu otwartego
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć oczyszczony σ70 do 0,5 μM.</li>
			<li>Powtórzyć kroki od 3.1.1.1 do 3.1.1.3, używając 0,5 μM (zamiast 3 μM) oczyszczonych σ70 i matrycy DNA (region promotora Pxyl z produktu pSG1154 PCR).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hamowanie testu inicjacji transkrypcji
		<ol>
			<li>Dodać inhibitor przeznaczony do zapobiegania tworzeniu się holoenzymu RNAP do enzymu rdzeniowego RNAP przed dodaniem σ70 (po etapie 3.1.1.1), a następnie kroki 3.1.1.2 i 3.1.1.3 w celu zbadania, czy inhibitor jest w stanie zakłócić tworzenie holoenzymu.</li>
			<li>Alternatywnie, po kroku 3.1.1.2, dodać inhibitor, aby zbadać, czy jest on w stanie kompetycyjnie hamować wiązanie σ70 z RNAP.</li>
			<li>W reakcjach kontrolnych należy użyć tej samej ilości DMSO, rozpuszczalnika inhibitora, zamiast zapasu inhibitora.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zakończenie reakcji
		<ol>
			<li>Rozpuścić heparynę w wodzie do stężenia podstawowego 1 mg/ml i przygotować w temperaturze -20 °C. 
			Uwaga: Heparyna jest konkurentem DNA, który może sekwestrować RNAP, który nie utworzył otwartego kompleksu. Po utworzeniu otwartego kompleksu heparyna nie może dostać się do miejsca wiązania DNA RNAP i hamować transkrypcji z wcześniej utworzonego otwartego kompleksu. Dlatego heparyna jest wymagana tylko do testów jednorundowych; Nie jest potrzebny do testów wielorundowych.</li>
			<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną przy użyciu 5 μl 10-krotnego buforu transkrypcyjnego (wykaz materiałów), 1 μl 1 mg/ml roztworu heparyny, 1 μl 10 mM ATP, GTP i CTP, 2,5 mM UTP i 1 μl α-32P UTP (3,000 Ci/mmol). Dodać uzdatnioną wodę DEPC do 45 μl.</li>
			<li>Mieszaninę reakcyjną zmieszać z otwartym kompleksem transkrypcyjnym, wirować pulsacyjnie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
			<li>Przenieść 10 μl roztworu reakcyjnego do 5 μl buforu ładującego żel RNA (95% formamidu, 0,05% błękitu bromofenolowego i 0,05% cyjanolu ksylenowego) w celu wygaszenia reakcji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Bieganie i rozwój żelu RNA
<ol>
	<li>Uruchamianie żelu poliakryloamidowego do denaturacji
	<ol>
		<li>Uruchomić żel w temperaturze 50 ºC i 50 W w 1x buforze TBE przez około 1,5 godziny, aż temperatura żelu i buforu ustabilizuje się na poziomie 50 ºC.</li>
		<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 90 ºC przez 30 sekund i przenieść je na lód przed załadowaniem do żelu.</li>
		<li>Załaduj próbki do studzienek na wierzchu żelu wzdłuż jednego pasa zawierającego drabinkę 2 μl RNA (rozcieńczenie 1:100).</li>
		<li>Uruchom żel w temperaturze 50 W i 50 ºC w 1x buforze TBE, aż niebieski barwnik bromofenolowy osiągnie ~2/3 w dół żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie żelem
	<ol>
		<li>Otwórz powoli i ostrożnie oddziel górną płytkę od komórki sekwencyjnej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie złamać żelu.</li>
		<li>Wytnij bibułę chromatograficzną (lista materiałów), aby dopasować rozmiar żelu od góry do niebieskiego barwnika bromofenolowego. Użyj licznika Geigera, aby potwierdzić przybliżoną pozycję radioaktywnie znakowanych transkryptów RNA.</li>
		<li>Ostrożnie przykryj żel bibułą filtracyjną i mocno dociśnij, aż żel przylgnie do bibuły filtracyjnej. Odetnij i wyrzuć spód żelu do odpadów radioaktywnych, ponieważ niewbudowane NTP spływają na dno żelu, który może być bardzo gorący.</li>
		<li>Umieść kawałek bibuły filtracyjnej o podobnej wielkości na stole suszącym suszarki próżniowej i ostrożnie połóż na nim papier pokryty żelem stroną do góry.</li>
		<li>Przykryj żel folią spożywczą i susz w temperaturze 60 °C przez 1,5 godziny.</li>
		<li>Owiń drugą stronę pokrytej żelem bibuły filtracyjnej folią spożywczą i umieść na fototymulacyjnej płytce luminoforowej w etui do obrazowania, z odpowiednim czasem naświetlania, który może wynosić od 1 godziny do nocy, w zależności od wydajności reakcji.</li>
		<li>Zobrazuj płytę luminoforową za pomocą skanera imager zgodnie z instrukcjami producenta. Określ względne natężenie pasma za pomocą oprogramowania ImageJ zgodnie z instrukcją oprogramowania.</li>
		<li>Użyj licznika Geigera, aby sprawdzić skażenie radioaktywne w obszarze roboczym, przetrzyj podejrzane przedmioty i obszar chusteczką i środkiem czyszczącym, a następnie wyrzuć chusteczkę do pojemnika na odpady.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+by+RNA+polymerase%3A+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li>
<li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li>
<li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA%3A+the+basic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li>
<li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li>
<li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li>
<li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+at+the+core%3A+Similarities+among+bacterial%2C+archaeal%2C+and+eukaryotic+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li>
<li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Is it easy to stop RNA polymerase?</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li>
<li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li>
<li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li>
<li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design%3A+From+in+silico+screening+to+validation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li>
<li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li>
<li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li>
<li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li>
<li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li>
<li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li>
<li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li>
<li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

We wszystkich organizmach transkrypcja jest ściśle regulowanym procesem. Testy transkrypcji in vitro zostały opracowane w celu zapewnienia platformy do testowania wpływu czynników transkrypcyjnych, małych cząsteczek i inhibitorów transkrypcji. W pracy tej metody opisano test ogólnej transkrypcji bakteryjnej. Testy transkrypcyjne w połączeniu z sekwencjonowaniem elektroforezy transkryptów w żelu są bardzo ważne dla badań mechanistycznych, ponieważ umożliwiają wizualizację wszystkich produktów transkrypcji na osi ...

Transkrypcja to proces, w którym RNA jest syntetyzowane z określonego szablonu DNA. W komórkach eukariotycznych występują trzy odrębne RNAP: RNAP I transkrybuje prekursory rRNA, RNAP II jest odpowiedzialny za syntezę mRNA i niektórych małych jądrowych RNA, a synteza 5S rRNA i tRNA jest przeprowadzana przez RNAP III. U bakterii istnieje tylko jeden RNAP odpowiedzialny za transkrypcję wszystkich klas RNA. Istnieją trzy etapy transkrypcji: inicjacja, wydłużenie i zakończenie. Transkrypcja jest jednym z najbardziej regulowanych procesów w komórce. Każdy etap cyklu transkrypcji stanowi punkt kontrolny dla regulacji ekspresji genów1. W celu inicjacji RNAP musi połączyć się z czynnikiem sigma, aby utworzyć holoenzym, który jest wymagany do skierowania enzymu do określonych miejsc zwanych promotorami2 w celu utworzenia otwartego kompleksu promotorowego. Następnie duży zestaw czynników transkrypcyjnych jest odpowiedzialny za regulację aktywności RNAP w fazach wydłużania i zakończenia. Badanym tutaj czynnikiem transkrypcyjnym jest wysoce konserwatywne i niezbędne białko, NusA. Bierze udział w regulacji pauzowania i zakończenia transkrypcji, a także antyterminacji podczas syntezy rRNA3-5.
Testy transkrypcji in vitro zostały opracowane jako potężne narzędzia do badania złożonych etapów regulacyjnych podczas transkrypcji6. Ogólnie rzecz biorąc, liniowy fragment DNA zawierający region promotorowy jest wymagany jako matryca do transkrypcji. Matryca DNA jest zwykle generowana przez PCR lub linearyzację plazmidu. Oczyszczone białka i NTP (w tym jeden znakowany radioizotopem NTP do celów wykrywania) są następnie dodawane, a produkt analizowany po wymaganym okresie inkubacji. Korzystając z odpowiednich szablonów i warunków reakcji, wszystkie etapy transkrypcji zostały zbadane przy użyciu tego podejścia, które umożliwiło szczegółową charakterystykę molekularną transkrypcji w ciągu ostatniego półwiecza7. W połączeniu z informacjami na temat trójwymiarowej struktury RNAP możliwe było również zbadanie molekularnego mechanizmu hamowania transkrypcji przez antybiotyki i antybiotyki oraz wykorzystanie tych informacji do opracowania nowych, ulepszonych leków8-10.
W tej pracy podajemy przykłady jak testy transkrypcyjne mogą być użyte do określenia mechanizmu regulacji przez czynnik wydłużenia/zakończenia transkrypcji NusA, oraz jak można określić mechanizm działania nowego inhibitora inicjacji transkrypcji, prowadzącego.

<table><tbody><tr><td>Otrzymać białka wymagane do oznaczenia</td><td></td><td></td><td></td> transkrypcji</tr><tr><td>E. coli</td><td>Epicentrum</td> RNAP <td>S90250</td><td></td></tr> Przygotowanie pirowęglanu dietylu (DEPC) <tr><td>uzdatnionego</td><td></td><td></td><td></td>wodą</tr><tr><td>DEPC (DEPC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr> Czarodziej <tr><td>przygotowania</td><td></td><td></td><td></td>matrycy DNA</tr> <tr><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td> <td>Ambient Nuclease-Free Water</td></tr><tr><td>&nbsp; Plus&nbsp;SV Minipreps System oczyszczania DNA</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel i PCR Clean-Up System&nbsp;</td>Fluorospektrometr <td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>rNTP o wysokiej czystości</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-32P UTP&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp; &nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td> Przygotowanie drabinki RNA <td>związku promieniotwórczego</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&ndash; 1 kb</td><td>Milipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Preparat</td><td></td><td></td><td></td>żelowy</tr><tr><td>Komórka do sekwencjonowania kwasów nukleinowych Sequi-Gen GT&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp; &nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Mocznik SL2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroksymetylo)aminometan&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>154563</tr><tr><td>kwas borowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Akrylamid/bis-akrylamid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>nadsiarczan amonu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N',-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Test transkrypcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ryfampicyna&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamid&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>cyjanol ksylenowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Inhibitor rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transkrypcyjny&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Naziemna Telewizja Cyfrowa&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Glicerol DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła</td><td></td><td></td><td></td>filtracyjna</tr><tr><td>Whatman&nbsp; Bibuła chromatograficzna 3MM Chr</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioaktywny dekontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Leczenie</td><td></td><td></td><td></td>żelem</tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Testy transkrypcji in vitro zostały opracowane i szeroko stosowane przez wiele lat do badania mechanizmów molekularnych związanych z transkrypcją. Proces ten wymaga wielopodjednostkowej polimerazy RNA zależnej od DNA (RNAP) i szeregu czynników transkrypcyjnych, które działają w celu modulowania aktywności RNAP podczas ekspresji genów. Sekwencjonowanie elektroforezy żelowej transkryptów znakowanych radioaktywnie służy do dostarczania szczegółowych informacji mechanistycznych na temat przebiegu transkrypcji i jakie parametry mogą na nią wpływać. W tym artykule opisano protokół badania, w jaki sposób niezbędny czynnik elongacyjny NusA reguluje pauzę transkrypcji, a także metodę identyfikacji środka przeciwbakteryjnego ukierunkowanego na inicjację transkrypcji poprzez hamowanie tworzenia holoenzymów RNAP. Metody te mogą być wykorzystane jako platforma do opracowania dodatkowych podejść do badania mechanizmu działania czynników transkrypcyjnych, które nadal pozostają niejasne, a także nowych środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na transkrypcję, która jest niedostatecznie wykorzystywanym celem leków w badaniach i rozwoju antybiotyków.

Wydajność transkrypcji można określić poprzez pomiar poziomu promieniowania w prążkach w różnych punktach czasowych. Test pauzy służący do zbadania funkcji czynnika NusA umożliwił wizualizację produktów pauzy, terminacji oraz run-off (Rycina 1A). W obecności domeny N-końcowej białka NusA (NusA NTD; reszty aminokwasowe 1-137) pojawienie się produktów RNA było znacznie opóźnione w porównaniu z eksperymentem kontrolnym bez udziału NusA. Delecja reszt aminokwasowych 104-137 (...

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Ogólnym celem tego testu transkrypcji in vitro jest badanie złożonych etapów regulacji podczas transkrypcji poprzez zapewnienie platformy do testowania wpływu czynników transkrypcyjnych, małych cząsteczek oraz inhibitorów transkrypcji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii molekularnej, takie jak precyzyjne mechanizmy związane z regulacją transkrypcji, funkcja czynników transkrypcyjnych o nieznanych mechanizmach oraz działanie typowych inhibitorów transkrypcji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej wizualizacji wszystkich produktów transkrypcji w czasie na podstawie jednego żelu do sekwencjonowania RNA.Procedurę należy rozpocząć od dwukrotnego przemycia płyt z aparatury do elektroforezy żelowej do sekwencjonowania 70% ethanol i wodą oczyszczoną. Złożyć komorę, używając grzebienia i dwóch dystansów. Rozpuścić 33,6 g mocznika w 22 ml wody i 16,4 ml pięciokrotnego buforu TBE, korzystając z mieszadła magnetycznego.Dodaj 16 mililitrów 40% akrylamidu, ten roztwór akrylamidu do roztworu mocznika i przefiltruj przez filtr 0,45 mikrometra. Do przefiltrowanego roztworu dodaj 514 mikrolitrów świeżo przygotowanego 10% roztworu nadsiarczanu a

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opracowaliśmy ilościowy test wiążący DNA, oparty na ELISA, do pomiaru interakcji czynników transkrypcyjnych z DNA.  Wysoką swoistość białka RUNX2 osiągnięto dzięki oligonukleotydowi rozpoznającemu DNA i swoistemu przeciwciału monoklonalnemu. Detekcja kolorymetryczna z reakcją substratową przeciwciał sprzężoną z enzymem była monitorowana w czasie rzeczywistym.

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorofenylcorol i jego wolnozasadowy analog wykazują niską cytotoksyczność komórek mikromolowych. W tym artykule opisano reakcję transkrypcji RNA, obrazowanie RNA za pomocą żelu barwionego bromkiem etydyny oraz ilościowe oznaczanie RNA za pomocą spektroskopii UV-Vis, w celu oceny hamowania transkrypcji przez korole i demonstruje prostą metodę oceny właściwości kandydatów przeciwnowotworowych.

Test enzymatyczny in vitro do pomiaru hamowania transkrypcji przez korole galu(III) i H3 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Oporność na leki celowane jest powszechna, a potrzeba identyfikacji mechanizmów oporności - przed lub po rozpoczęciu badań klinicznych - jest kluczowa dla kierowania alternatywnymi strategiami leczenia klinicznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół parowania wyprowadzenia linii lekoopornych in vitro z sekwencjonowaniem, aby przyspieszyć odkrycie tych mechanizmów.

Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Poznaj metodę testów transkrypcji in vitro do badania regulacji transkrypcji i aktywności inhibitorów antybakteryjnych. Technika umożliwia bezpośrednią wizualizację produktów RNA na żelu sekwencjonującym.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Przeglądaj więcej filmów