In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

Ogólnym celem tego testu transkrypcji in vitro jest zbadanie złożonych etapów regulacyjnych podczas transkrypcji poprzez zapewnienie platformy do testowania wpływu czynników transkrypcyjnych, małych cząsteczek i inhibitorów transkrypcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii molekularnej, takie jak dokładne mechanizmy związane z regulacją transkrypcji, funkcja czynników transkrypcyjnych o nieznanych mechanizmach oraz wpływ normalnych inhibitorów transkrypcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bezpośrednią wizualizację wszystkich produktów transkrypcji na osi czasu z pojedynczego żelu do sekwencjonowania RNA.

Rozpocznij tę procedurę od dwukrotnego oczyszczenia płytek z aparatu do sekwencjonowania żelu 70% etanolem i oczyszczoną wodą. Zmontuj komórkę za pomocą grzebienia i dwóch przekładek. Rozpuść 33,6 grama mocznika w 22 mililitrach wody i 16,4 mililitrach pięciokrotnego buforu TBE za pomocą mieszadła magnetycznego.

Dodaj 16 mililitrów 40% roztworu akrylamidu, tego akrylamidu do roztworu mocznika i przefiltruj przez filtr 0,45 mikrometra. Dodać do przefiltrowanej substancji rozputonowej 514 mikrolitrów świeżo przygotowanego 10% roztworu nadsiarczanu amonu. Następnie 51,4 mikrolitrów TEMED.

Delikatnie odwrócić roztwór żelu, aby uniknąć nadmiernego napowietrzenia, a następnie natychmiast i płynnie wstrzyknąć z dolnego otworu iniekcyjnego do poziomo umieszczonej, wstępnie wypełnionej komórki sekwencjonującej. Należy uważać, aby podczas wstrzykiwania nie tworzyć pęcherzyków powietrza. Pozostaw żel do całkowitego stwardnienia na jedną do 1,5 godziny przed użyciem.

Aby rozpocząć procedurę tworzenia kompleksu wydłużającego transkrypcję, dodaj jeden mikrolitr enzymu rdzeniowego polimerazy RNA do probówki o pojemności 1,5 mikrolitra. Dodaj jeden mikrolitr oczyszczonego czynnika sigma 70 do polimerazy RNA i inkubuj na lodzie przez 10 minut, aby utworzyć holoenzym polimerazy RNA. Dodaj do holoenzymu polimerazy RNA 3 mikrolitry oczyszczonego matrycy DNA o stężeniu 500 nanomolowców w buforze transkrypcyjnym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby utworzyć otwarty kompleks.

Następnie przygotuj mieszaninę składników reakcji, dodając następujące odczynniki do 1,5 mililitrowej probówki. Pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, dwa mikrolitry 250 mikromolowego GTP, dwa mikrolitry 250 mikromolowych UTP, jeden mikrolitr jednego milimolowego ATP i jeden mikrolitr alfa P 32 znakowanego UTP. Dodaj uzdatnioną wodę DEPC do mieszaniny do 41 mikrolitrów.

Przenieść mieszaninę do probówki zawierającej otwarty kompleks i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez piętnaście minut, aby utworzyć kompleks wydłużający transkrypcję zatrzymany na plus 26 nukleotydach. Po 15 minutach przenieś reakcję do temperatury pokojowej i dodaj jeden mikrolitr 2,4 miligrama na mililitr ryfampicyny do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr. Dodać jeden mikrolitr 0,1 milimolowego oczyszczonego czynnika transkrypcyjnego NusA do mieszaniny reakcyjnej i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Dodać dwa mikrolitry CTP o mocy 250 mikromolowców do mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów i zmierzyć czas reakcji za pomocą timera. W każdym punkcie czasowym przenieś pięć mikrolitrów roztworu reakcyjnego do 2 mikrolitrów buforu ładującego żel RNA, aby wygasić reakcję. Przed elektroforezą próbek należy wstępnie uruchomić żel przez około 1,5 godziny w temperaturze 50 stopni Celsjusza i 50 watów w jednorazowym buforze TBE, aż temperatura żelu i buforu ustabilizuje się na poziomie 50 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu cyklu wstępnego podgrzej próbki w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 30 sekund i przenieś je na lód. Załaduj pierwszą studzienkę na wierzch żelu dwoma mikrolitrami drabinki RNA, a następnie załaduj próbki do dołków wzdłuż drabiny. Uruchom żel z mocą 50 watów i 50 stopniami Celsjusza w jednorazowym buforze TBE przez około 1,5 godziny, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do około 2/3 żelu.

Po zakończeniu cyklu powoli otwórz dwie płytki żelowe i ostrożnie oddziel górną płytkę od komórki sekwencjonującej, bardzo uważając, aby nie doszło do pęknięcia żelu. Wytnij bibułę chromatograficzną, aby dopasować rozmiar żelu od góry do niebieskiego barwnika bromofenolowego. Użyj licznika Geigera, aby potwierdzić przybliżoną pozycję radioaktywnie znakowanych transkryptów RNA.

Ostrożnie przykryj żel bibułą filtracyjną i mocno dociśnij, aż żel przylgnie do bibuły filtracyjnej. Odetnij i wyrzuć spód żelu jako odpad radioaktywny, ponieważ niewbudowane NTP biegną do dna żelu, który może być wysoce radioaktywny. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej o podobnej wielkości na łożu suszenia suszarki próżniowej i ostrożnie połóż na nim papier pokryty żelem stroną do góry.

Przykryj żel folią spożywczą i susz w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po wyschnięciu żelu owiń drugą stronę pokrytej żelem bibuły filtracyjnej folią spożywczą i umieść fotostylowalną płytkę luminoforową w etui do obrazowania na odpowiedni czas naświetlania. Następnie zobrazuj płytkę luminoforową za pomocą skanera imager zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby przetestować wpływ zmutowanej domeny końcowej NusA lub NTD w transkrypcji, przeprowadzono testy wstrzymania wydłużania transkrypcji bez NusA lub z NusA-NTD, NusA-NTD z usuniętą Helix 3 i NusA-NTD z podstawieniami alaniny w ośmiu resztach. Produkty pauzy, zakończenia i spływu zostały pomyślnie zwizualizowane. W obecności NusA-NTD pojawienie się produktów RNA było znacznie opóźnione w porównaniu z eksperymentem kontrolnym bez NusA.

Pokazano aktywność pauzy w okresie półtrwania zmutowanego NusA-NTD w stosunku do białka typu dzikiego. Delecja helisy 3, czyli przemiana szeregu aminokwasów w alaninę, spowodowała całkowitą utratę aktywności pauzy NusA. Wykazano, że reszty Helix 3, arginina 104 i lizyna 111, są niezbędne dla aktywności pauzy NusA-NTD.

Testy transkrypcji in vitro mogą być również wykorzystywane do badania wpływu nowo zidentyfikowanych bakteryjnych inhibitorów transkrypcji, takich jak związek C5. Procentowe hamowanie transkrypcji określono przez produkt RNA w stosunku do kontroli przeciwko stężeniu C5 użytemu w reakcji. Mechanistycznie rzecz biorąc, dodanie C5 do polimerazy RNA, a następnie czynnika sigma 70 do mieszaniny reakcyjnej było znacznie bardziej skuteczne w hamowaniu transkrypcji niż użycie C5 po utworzeniu holoenzymu polimerazy RNA. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak ELISA i kalorymetria miareczkowa izotermiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak inhibitor wpływa na transkrypcję.

Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie biologii molekularnej lub chemicznej. Zbadanie mechanizmu i powiązanych inhibitorów transkrypcji bakteryjnej. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami radioaktywnymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak pełne środki ochrony osobistej.