Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ogólnym celem tej metody jest opracowanie uproszczonego podejścia do szybkiej izolacji oczyszczonych lipoprotein o wysokiej gęstości z ludzkiej plazmy krwi w celu analizy mikroRNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hepatologii i kardiologii, takie jak zrozumienie mechanizmów molekularnych i funkcji ochronnych lipoprotein o wysokiej gęstości. Główną zaletą tej techniki jest to, że oczyszczone mikroRNA z HDL są izolowane z mniejszej objętości próbek w krótkim odstępie czasu.

W niniejszym protokole plazma jest uzyskiwana z próbek żylnej krwi obwodowej pobranej na czczo poprzez wielokrotne etapy wirowania, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Przenieś plazmę do nowej probówki. Następnie zmierz gęstość plazmy za pomocą densytometru w temperaturze pokojowej, zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby usunąć krążące egzosomy, które stanowią źródło kontaminacji mikroRNA, należy dodać 252 µL roztworu do precypitacji egzosomów do 1 mL plazmy. Następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po tym czasie odwirować mieszaninę przez 30 minut, aby wytrącić egzosomy w formie osadu.

Przenieś jeden mililitr otrzymanego supernatantu do poliwęglanowej probówki do ultrawirówki z grubą ścianką w celu dalszej obróbki, zgodnie z instrukcją pokazaną w następnym segmencie wideo. Izolacja lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) odbywa się za pomocą trzystopniowego protokołu ultrawirowania w gradiencie gęstości, który obejmuje sekwencyjną izolację lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz HDL. Trzy różne roztwory o różnych gęstościach, A, B i C, muszą zostać przygotowane na świeżo, zgodnie z procedurą opisaną w tekście protokołu.

W poliwęglanowej probówce do ultrawirówki o grubych ściankach o pojemności 6,5 ml zmieszaj 1 ml osocza i 200 µL Fat Red 7B wolnego od nukleaz. Następnie ostrożnie nałóż 5 ml roztworu A na wierzch mieszaniny. W razie potrzeby dodaj dodatkowy Fat Red 7B na wierzch roztworu A, aby zrównoważyć wagę każdej probówki.

Umieść probówki w uprzednio schłodzonym rotorze. Umieść rotor w wirówce stacjonarnej i wiruj przez dwie godziny. Po zakończeniu procesu powinny być widoczne dwie warstwy.

Odbierz 1,5 ml górnej warstwy, która stanowi frakcję VLDL, i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety przenieś 4 ml z dna probówki do nowej probówki o pojemności 50 ml.

Zawartość ta obejmuje frakcję LDL i HDL. Kolejnym krokiem jest izolacja LDL. Wymieszaj 2 ml roztworu B i 100 µl Fat Red 7B wolnego od nukleaz w probówce zawierającej frakcję LDL i HDL.

Przechowywać w lodzie od pięciu do dziesięciu minut. Przenieść 6,5 milliliters wymieszanej próbki do poliwęglanowej, grubościennej probówki do ultracentryfugi. Umieścić probówkę w schłodzonym rotorze i wirować przez trzy godziny.

Po zakończeniu wirowania należy pobrać 1,5 mililitra górnej warstwy, stanowiącej frakcję LDL, i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść cztery mililitry z dna probówki, zawierające frakcję HDL, do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Trzecim krokiem jest izolacja HDL.

Wymieszaj dwa mililitry roztworu C, 100 µL Fat Red 7B wolnego od nukleaz oraz 15 µL 98% beta-merkaptoetanolu w probówce zawierającej frakcję HDL. Sprawdź gęstość mieszaniny. Umieść probówkę w schłodzonym wcześniej rotorze i wiruj przez trzy godziny.

Następnie należy pobrać dwa mililitry górnej warstwy, reprezentującej frakcję HDL, i przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadmiar soli musi zostać usunięty z frakcji lipoprotein, aby uniknąć zakłóceń podczas późniejszej elektroforezy w żelu agarozowym i PCR. W tym filmie odsalanie i zagęszczanie zostaną zademonstrowane wyłącznie dla frakcji HDL.

Do frakcji HDL dodać 13 ml zimnego PBS i przenieść do urządzenia do filtracji odśrodkowej z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 10K. Wirować w rotorze z koszykami wahadłowymi przy 4000 ×g i temperaturze 4°C przez 30 minut. Odsolić frakcję HDL po raz drugi, używając 13 ml zimnego PBS i wirując w taki sam sposób jak poprzednio.

Po wirowaniu należy usunąć roztwory zawierające lipoproteiny i przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby ocenić jakość i czystość wyizolowanych lipoprotein, przeprowadzono elektroforezę w żelu agarozowym z wykorzystaniem ludzkich standardów lipoprotein, które posłużyły jako punkt odniesienia dla wielkości cząsteczek. Reprezentatywne wyniki izolacji, przeprowadzonej bez użycia beta-merkaptoetanolu, wykazały, że frakcja HDL jest wolna od zanieczyszczeń VLDL i wykazuje typową ruchliwość alfa.

Jednakże frakcja HDL wykazuje również ślady ruchliwości beta ze względu na zanieczyszczenie lipoproteinami. Dodanie beta-merkaptoetanolu do roztworu C podczas ostatniego etapu wirowania skutecznie usuwa wszystkie zanieczyszczające lipoproteiny z frakcji HDL. Aby wykazać możliwość ilościowego oznaczenia mikroRNA przeniesionych przez ludzkie HDL oczyszczone tą metodą, przeprowadzono amplifikację dwóch różnych mikroRNA za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym.

Na tych wykresach amplifikacji linie poziome reprezentują próg detekcji. Reprezentatywne dane z PCR w czasie rzeczywistym z izolowanego HDL, uzyskane z sześciu próbek, wykazały spójną detekcję obu mikroRNA. Na koniec, analizy krzywych topnienia wyraźnie pokazują pojedynczy, wyraźny pik dla obu mikroRNA, co jest zgodne ze specyficzną amplifikacją w poprzedzającym etapie PCR.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu dziewięciu godzin, wliczając w to procedury odsolenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały czas pracować w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza oraz dostosować gęstość każdej frakcji lipoprotein przed ultrawirowaniem.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące czystości HDL. Po opracowaniu technika ta pozwoli badaczom zajmującym się zespołem metabolicznym badać związane z HDL mikroRNA jako biomarkery u ludzi z podejrzeniem stłuszczenia wątroby. Może ona również zostać wykorzystana do lepszego zrozumienia funkcji HDL oraz mechanizmów molekularnych, dzięki którym białko to zmienia biologię komórki.