Name: Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę szybkiej izolacji HDL z ludzkiej osocza krwi do analizy miRNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych i funkcji ochronnych lipoprotein o wysokiej gęstości w hepatologii i kardiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana, w całości lub w części, przez NIH Grants R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 i T32 DK 007150-38 do AJS i T32 DK 007150-38 do AA. Jest to praca oryginalna i nie jest brana pod uwagę nigdzie indziej do publikacji.

1. Pobieranie próbek krwi
<ol>
	<li>Pobrać próbki krwi z żył obwodowych na czczo do 10 ml plastikowych probówek zawierających antykoagulant kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (który ma kilka zalet w porównaniu z innymi antykoagulantami) przez standardowe nakłucie dożylne wystającej żyły w dole przedłokciowym.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi przy 1 600 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej w celu uzyskania osocza wolnego od czerwonych krwinek i niewielkich ilości RNA.</li>
	<li>Sekwencyjnie odwirować supernatant w temperaturze 3 000 g (4 °C) w obracającym się wirniku kubełkowym przez 10 minut w celu usunięcia WBC i płytek krwi, a następnie dodatkowe 15 minut w celu usunięcia pozostałych resztek komórek.</li>
	<li>Zmierz gęstość osocza za pomocą densytometru o temperaturze pokojowej zgodnie z instrukcją producenta. 
	UWAGA: Dostosowanie gęstości (d = 1,023 g/ml) 0,9% roztworem soli może być wymagane po usunięciu egzosomów, ale przed ultrawirowaniem w gradiencie gęstości.</li>
</ol>
2. Usuwanie egzosomów z osocza
<ol>
	<li>Usuń krążące egzosomy, które mają gęstość podobną do HDL i reprezentują ilościowo istotne źródło miRNA3.
	<ol>
		<li>W tym celu należy dodać 252 μl roztworu wytrącającego egzosomy do 1 ml osocza, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Aby wydrobować egzosomy, należy odwirować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 1 500 g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby wyizolować HDL, należy przenieść 1 ml powstałego supernatantu do grubościennej probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w celu dalszego przetwarzania z ultrawirowaniem w gradieniu gęstości (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (Rysunek 1).
<ol>
	<li>Aby oddzielić HDL, należy zastosować 3-etapowy proces wykorzystujący ultrawirówkę podłogową z wirnikiem o stałym kącie działania, pracującą odpowiednio w temperaturze 448 811 x G i 8 °C.</li>
	<li>Dla każdej izolacji należy przygotować trzy roztwory o różnej gęstości sekwencyjnie i na świeżo.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór A (izolacja VLDL, d = 1,006 g/ml) rozpuszczając 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na i 1 ml 1N NaOH w 1,000 ml autoklawowanej wody destylowanej. Następnie dodaj dodatkowe 3 ml autoklawowanej wody destylowanej.</li>
		<li>Przygotować roztwór B (izolacja LDL, d = 1,182 g/ml) dodając 25,2 g NaBr do 100 ml roztworu A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).</li>
		<li>Przygotować roztwór C (izolacja HDL, d=1,470 g/ml) mieszając 78,8 g NaBr ze 100 ml roztworu A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Potwierdzić odpowiednią gęstość przy RT za pomocą densytometru. Wszystkie roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja VLDL
<ol>
	<li>Wymieszać 1 ml osocza (średnia gęstość = 1,023 g/ml) i wolne od nukleaz 200 μl Fat Red 7B w grubościennej probówce ultrawirówkowej z poliwęglanu o pojemności 6,5 ml.</li>
	<li>Następnie ostrożnie ułóż 5 ml roztworu A na wierzchu mieszaniny. W razie potrzeby dodaj dodatkowy Fat Red 7B na wierzch roztworu A, aby zrównoważyć wagę każdej probówki. Wirować przez 2 godziny (przyspieszenie - 5), (opóźnienie - 7). 
	UWAGA: Podczas wirowania lipoproteiny są gromadzone jako pasmo w ich obszarach gęstości równowagi.</li>
	<li>Pod koniec biegu obserwuj 2 warstwy. Usunąć 1,5 ml frakcji VLDL stanowiącej wierzchnią warstwę i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na koniec, za pomocą pipety, przenieść 4 ml z dna probówki zawierającej frakcję LDL, HDL, albuminę i kwasy tłuszczowe do nowej probówki z poliwęglanu w celu izolacji LDL.</li>
</ol>
5. Izolacja LDL
<ol>
	<li>Zmieszać 2 ml roztworu B i 100 μl wolnego od nukleaz Fat Red 7B w probówce zawierającej odpowiednio frakcję LDL i HDL (sekcja 4).</li>
	<li>Następnie odwirowywać przez 3 godziny (przyspieszenie 9, opóźnienie 7). Następnie usunąć 1,5 ml frakcji LDL stanowiącej wierzchnią warstwę i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -80 °C. Na koniec przenieść 4 ml z dna probówki zawierającej frakcję HDL do nowej probówki z poliwęglanu.</li>
</ol>
6. Izolacja HDL
<ol>
	<li>Zmieszać odpowiednio 2 ml roztworu C, 100 μl wolnego od nukleaz Fat Red 7B i 15 μl 98% β-merkaptoetanolu z probówką zawierającą frakcję HDL.</li>
	<li>Wirować przez 3 godziny (przyspieszenie 9, opóźnienie 7). Następnie usunąć 2 ml frakcji HDL reprezentującej wierzchnią warstwę i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. Odsalanie i zagęszczanie frakcji lipoprotein
<ol>
	<li>Aby uniknąć zakłóceń w późniejszej elektroforezie w żelu agarozowym i PCR, należy usunąć nadmiar soli dodanej podczas ultrawirowania w gradiencie gęstości za pomocą filtrów odśrodkowych z odpowiednią granicą masy cząsteczkowej (probówka 3K dla VLDL i probówka 10K dla LDL/HDL) zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Krótko, po dodaniu 2,5 ml zimnego PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4; pH 7,4) odwirować całą frakcję VLDL zebraną podczas ultrawirowania w gradiencie gęstości w temperaturze 4 °C przez 60 minut za pomocą wahadłowego wirnika kubełkowego.</li>
		<li>Odsolić frakcję LDL dwukrotnie za pomocą 10 ml lodowatego PBS przez 30 minut każde. Następnie dwukrotnie użyj 13 ml lodowatego PBS do odsalania frakcji HDL. Większa objętość PBS jest niezbędna do poprawy mobilności za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Po odwirowaniu usunąć lipoproteiny zawierające substancje rozpuszczone i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Elektroforeza w żelu agarozowym
<ol>
	<li>Elektroforeza w żelu agarozowym lipoprotein Perfrom z wykorzystaniem zestawu z niewielkimi modyfikacjami instrukcji producenta w następujący sposób. 
	UWAGA: Ten krok ma na celu jedynie ocenę jakości i czystości skoncentrowanych próbek lipoprotein.
	<ol>
		<li>Na krótko uzyskać 6 μl odsolonej frakcji lipoprotein za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości i załadować na wstępnie złożony żel lipoproteinowy. Użyj ludzkich wzorców lipoprotein dla VLDL, LDL i HDL jako odniesienia do rozmiaru. Przeprowadzać elektroforezę w temperaturze pokojowej przy napięciu 100 V przez 60 minut przy użyciu bufora Rep Prep.</li>
		<li>Suszyć żel przez 10 minut, a następnie barwić przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą Fat Red 7B. Żel należy odbarwić w mieszaninie metanol-woda w stosunku 75:25 (v/v) i ponownie schnąć przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA
<ol>
	<li>Perfrom izolacja miRNA przez oczyszczony ludzki HDL przy użyciu zestawu do izolacji i oczyszczania miRNA surowicy/osocza.
	<ol>
		<li>Na krótko dodać 1 ml odczynnika do lizy RNA do 200 μl oczyszczonego HDL, wymieszać z wirownikiem, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych i inaktywację RNaz.</li>
		<li>Następnie wprowadzić do mieszaniny 3,5 μl syntetycznego mikroRNA Caenorhabditis elegans (cel-miR-39; 1,6 x 108 kopii/μl). Następnie przeprowadzić ekstrakcję RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić oczyszczanie wyekstrahowanego miRNA za pomocą eluujących kolumn spinowych zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierz stężenie miRNA z oczyszczonego HDL za pomocą spektroforometru. 
	UWAGA: Elucja miRNA z kolumn wirowych wykorzystywała 16 μl wody wolnej od RNaz.</li>
</ol>
10. Odwrotna transkrypcja (RT-PCR)
<ol>
	<li>Wyizolować 100 ng miRNA z HDL wzbogaconego syntetycznym miRNA (cel-miR-39) i poddać odwrotnej transkrypcji w objętości reakcyjnej 20 μl przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji i zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykonaj odpowiednie kontrole bez matrycowego miRNA (NTC) i bez mieszanki enzymów odwrotnej transkryptazy (NRT).</li>
</ol>
11. PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) 
<ol>
	<li>Perfrom Real-time PCR w całkowitej objętości 20 μl z 2 μl cDNA w rozcieńczeniu 1:2, 10 μl mieszanki PCR, 2 μl startera uniwersalnego, 2 μl starterów miRNA i 4 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję w 96-dołkowych płytkach w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie w 45 cyklach w temperaturze 94 °C przez 15 sekund i 55 °C przez 30 s oraz fazę przedłużającą w temperaturze 70 °C przez 30 s.ec Z wszystkich reakcji w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Następnie oblicz względne ilości miRNA za pomocą metody 2-ΔΔCt po normalizacji do syntetycznego genu porządkowego zgodnie z instrukcjami producenta .</li>
</ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).</li>
<li>Vickers, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+185%2C+96%2C+and+223+repress+selective+high-density+lipoprotein+cholesterol+uptake+through+posttranscriptional+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition.</a> Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).</li>
<li>Rayner, K. J., Moore, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+of+high-density+lipoprotein+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function.</a> Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+endosomal-derived+vesicles+shipping+extracellular+messages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Foreman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+human+serum+lipoproteins+by+single-spin+gradient+ultracentrifugation%3A+quantification+of+apolipoproteins+B+and+A-1+and+lipid+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components.</a> J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+LDL-+and+HDL-cholesterol+determined+by+ultracentrifugation+and+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC.</a> J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).</li>
<li>Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low+temperature+flotation+method+to+rapidly+isolate+lipoproteins+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma.</a> J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).</li>
<li>Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+of+apolipoprotein+%28a%29+and+lipoprotein+%28a-%29+derived+from+the+dissociation+of+human+plasma+lipoprotein+%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a).</a> J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).</li>
<li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).</li>
<li>Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+a+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: a new source of biomarkers.</a> Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).</li>
<li>Stefanie, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+profiling+with+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker profiling with microRNAs.</a> Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).</li>
<li>Prasun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+promising+biomarkers+in+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics.</a> Biomarker Research. 2 (19), (2014).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease?</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJonathan%2C+S+%22miRNA+profiling+from+blood+-challenges+and+recommendations%22">miRNA profiling from blood -challenges and recommendations</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.qiagen.com">www.qiagen.com</a> (2015).</li>
<li>Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%2C+novel+biomarkers+of+acute+myocardial+infarction%3A+a+systemic+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review.</a> World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Identyfikacja nowych biomarkerów z krwi pomoże w diagnostyce klinicznej i prognozowaniu różnych chorób. Wiadomo, że mikroRNA posiadają wszystkie cechy biomarkerów i wykazano w różnych badaniach, że są one 14-17. W tym badaniu pokazaliśmy szybką i prostą, łatwą metodę izolacji miRNA z osocza HDL. Konwencjonalna metoda ultrawirowania z gradientem gęstości polegająca na izolacji VLDL, LDL i HDL polega na dokładnym pobraniu próbek osocza, precyzyjnym przygotowaniu roztworu buforowego, pomiarze gęstości i transferz...

MikroRNA to endogenne, niekodujące, maleńkie gatunki RNA, które są wysoce konserwatywne i są uważane za kluczowych graczy w regulacji różnych procesów biologicznych poprzez degradację lub tłumienie specyficznych docelowych informacyjnych RNA1. Ponieważ miRNA działają wewnątrzkomórkowo, zostały zbadane jako biomarkery pochodzenia tkankowego, co doprowadziło do odkrycia specyficznych dla tkanek funkcji tych miRNA. Jednak miRNA występują również zewnątrzkomórkowo albo związane z białkami, albo w egzosomach/mikropęcherzykach, które skutecznie mogą chronić je przed degradacją przez zewnątrzkomórkowe RNazy2. Nowsze badania wykazały, że ochronne działanie HDL może nie być ściśle związane z jego zdolnością do promowania wypływu cholesterolu, ale raczej z jego ładunkiem niezwiązanym z cholesterolem, w szczególności jako krążącego nośnika miRNA 3, 4. Te miRNA mogą nie tylko modulować metabolizm lipidów, ale są również związane z przeciwzapalnym, przeciwutleniającym i przeciwzakrzepowym działaniem kompleksu HDL-miRNA 5, 6.
Aby dokładniej zbadać rolę miRNA przenoszonych w cząsteczkach HDL, należy ustalić prosty i łatwy protokół ekstrakcji miRNA z izolowanego wysoko oczyszczonego HDL do użytku klinicznego. Opisano wiele metod izolacji HDL. Metody te są albo bardzo czasochłonne, albo wymagają dużej objętości osocza, co może wymagać łączenia próbek, rozległej dializy w celu odsalania izolowanych lipoprotein i nie usuwają całkowicie egzosomów jako źródła miRNA3, odpowiednio. Tutaj opisujemy prostą i szybką metodę, która może wyizolować miRNA z wysoko oczyszczonego HDL przy użyciu małej objętości próbek krwi na większą skalę. Uważamy, że metoda ta może służyć jako dobre odniesienie do promowania badań nad rolą krążących miRNA, a w szczególności nad rolą HDL w ułatwianiu komunikacji między różnymi komórkami i narządami.

<table><tbody><tr><td>Plastikowe tuby Vacutainer Lavender K2EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Densytometr 75004261 Densito 30PX</td><td>Rozwiązanie Mettler Toledo</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>ExoQuick&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>4484451</td><td></td></tr><tr><td>Grubościenna ultrawirówka z poliwęglanu</td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Sorvall WX100&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>Tłusta Czerwień 7B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201618</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Filtry odśrodkowe 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-odśrodkowe urządzenia filtrujące 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo&nbsp;</td><td>Laboratoria Helena&nbsp;</td><td>3344,3544T</td><td></td></tr><tr><td>Wzorce lipoprotein ludzkich dla lipotroli VLDL, LDL i HDL</td><td>; Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Bufor przygotowawczy Rep&nbsp;</td><td>Laboratoria Helena&nbsp;</td><td>Kolumny wirujące 3100</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute&nbsp;</td><td>Analizator Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217184</td><td></td></tr><tr><td>miScript Testy Primer</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> 480878 <tr><td>0,20 i #181; M sterylny filtr strzykawkowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji mirna z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Małe niekodujące RNA (miRNA) są zaangażowane w różne choroby ludzkie, w tym zespoły metaboliczne. Mogą być wykorzystywane jako biomarkery do diagnozowania i prognozowania lub mogą służyć jako cele do opracowywania leków. Ostatnio wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach, szczególnie lipoproteinach o wysokiej gęstości (HDL) i są dostarczane do komórek biorców w celu wychwytu. Stwarza to możliwość, że miRNA odgrywają kluczową i kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek i narządów poprzez regulację ekspresji genów, a także jako przekaźnik komunikacji komórka-komórka i przesłuchy między narządami. Obecne metody izolacji miRNA z oczyszczonego HDL są niepraktyczne w przypadku wykorzystania małych próbek na dużą skalę. Wynika to w dużej mierze z czasochłonnych i pracochłonnych metod stosowanych do izolacji lipoprotein. Opracowaliśmy uproszczone podejście do szybkiego wyizolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z próbek osocza. Metoda ta powinna ułatwić badania nad rolą miRNA w zdrowiu i chorobie, a w szczególności dostarczyć nowych informacji na temat różnorodności funkcji biologicznych, poza odwrotnym transportem cholesterolu, które przypisuje się HDL. Ponadto gatunki miRNA, które są obecne w HDL, mogą dostarczyć cennych informacji na temat biomarkerów klinicznych do diagnozowania różnych chorób.

Izolacja lipoprotein o wysokiej gęstości po usunięciu egzosomów 
Aby uzyskać miRNA z wysoko oczyszczonych HDL, konieczne jest usunięcie egzosomów, które stanowią źródło zanieczyszczenia miRNA7. Przeprowadzono to przed ultrecentryfugacją w gradiencie gęstości przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu. W celach praktycznych zmodyfikowano standardowy trzystopniowy protokół ultrecentryfugacji w gradiencie gęstości opracowany przez firmę komercy...

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Ogólnym celem tej metody jest opracowanie uproszczonego podejścia do szybkiej izolacji oczyszczonych lipoprotein o wysokiej gęstości z ludzkiej plazmy krwi w celu analizy mikroRNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hepatologii i kardiologii, takie jak zrozumienie mechanizmów molekularnych i funkcji ochronnych lipoprotein o wysokiej gęstości. Główną zaletą tej techniki jest to, że oczyszczone mikroRNA z HDL są izolowane z mniejszej objętości próbek w krótkim odstępie czasu.W niniejszym protokole plazma jest uzyskiwana z próbek żylnej krwi obwodowej pobranej na czczo poprzez wielokrotne etapy wirowania, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Przenieś plazmę do nowej probówki. Następnie zmierz gęstość plazmy za pomocą densytometru w temperaturze pokojowej, zgodnie z instrukcjami producenta.Aby usunąć krążące egzosomy, które stanowią źródło kontaminacji mikroRNA, należy dodać 252 µL roztworu do precypitacji egzosomów do 1 mL plazmy. Następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po tym czasie odwirować mieszaninę przez 30 minut, aby wytrącić egzosomy w formie osadu.Przenieś jeden mililitr otrzymanego supernatantu do poliwęglanowej probówki do ultrawirówki z grubą ścianką w celu dalszej obróbki, zgodnie z instrukcją pokazaną w następnym segmencie wideo. Izolacja lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) odbywa się za pomocą trzystopniowego protokołu ultrawirowania w gradiencie gęstości, który obejmuje sekwencyjną izolację lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz HDL. Trzy różne roztwory o różnych gęstościach, A, B i C, muszą zostać przygotowane na świeżo, zgodnie z procedurą opisaną w tekście protokołu.W poliwęglanowej probówce do ultrawirówki o grubych ściankach o pojemności 6,5 ml zmieszaj 1 ml osocza i 200 µL Fat Red 7B wolnego od nukleaz. Następnie ostrożnie nałóż 5 ml roztworu A na wierzch mieszaniny. W razie potrzeby dodaj dodatkowy Fat Red 7B na wierzch roztworu A, aby zrównoważyć wagę każdej probówki.Umieść probówki w uprzednio schłodzonym rotorze. Umieść rotor w wirówce stacjonarnej i wiruj przez dwie godziny. Po zakończeniu procesu powinny być widoczne dwie warstwy.Odbierz 1,5 ml górnej warstwy, która stanowi frakcję VLDL, i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety przenieś 4 ml z dna probówki do nowej probówki o pojemności 50 ml.Zawartość ta obejmuje frakcję LDL i HDL. Kolejnym krokiem jest izolacja LDL. Wymieszaj 2 ml roztworu B i 100 µl Fat Red 7B wolnego od nukleaz w probówce zawierającej frakcję LDL i HDL.Przechowywać w lodzie od pięciu do dziesięciu minut. Przenieść 6,5 milliliters wymieszanej próbki do poliwęglanowej, grubościennej probówki do ultracentryfugi. Umieścić probówkę w schłodzonym rotorze i wirować przez trzy godziny.Po zakończeniu wirowania należy pobrać 1,5 mililitra górnej warstwy, stanowiącej frakcję LDL, i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść cztery mililitry z dna probówki, zawierające frakcję HDL, do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Trzecim krokiem jest izolacja HDL.Wymieszaj dwa mililitry roztworu C, 100 µL Fat Red 7B wolnego od nukleaz oraz 15 µL 98% beta-merkaptoetanolu w probówce zawierającej frakcję HDL. Sprawdź gęstość mieszaniny. Umieść probówkę w schłodzonym wcześniej rotorze i wiruj przez trzy godziny.Następnie należy pobrać dwa mililitry górnej warstwy, reprezentującej frakcję HDL, i przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadmiar soli musi zostać usunięty z frakcji lipoprotein, aby uniknąć zakłóceń podczas późniejszej elektroforezy w żelu agarozowym i PCR. W tym filmie odsalanie i zagęszczanie zostaną zademonstrowane wyłącznie dla frakcji HDL.Do frakcji HDL dodać 13 ml zimnego PBS i przenieść do urządzenia do filtracji odśrodkowej z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 10K. Wirować w rotorze z koszykami wahadłowymi przy 4000 ×g i temperaturze 4°C przez 30 minut. Odsolić frakcję HDL po raz drugi, używając 13 ml zimnego PBS i wirując w taki sam sposób jak poprzednio.Po wirowaniu należy usunąć roztwory zawierające lipoproteiny i przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby ocenić jakość i czystość wyizolowanych lipoprotein, przeprowadzono elektroforezę w żelu agarozowym z wykorzystaniem ludzkich standardów lipoprotein, które posłużyły jako punkt odniesienia dla wielkości cząsteczek. Reprezentatywne wyniki izolacji, przeprowadzonej bez użycia beta-merkaptoetanolu, wykazały, że frakcja HDL jest wolna od zanieczyszczeń VLDL i wykazuje typową ruchliwość alfa.Jednakże frakcja HDL wykazuje również ślady ruchliwości beta ze względu na zanieczyszczenie lipoproteinami. Dodanie beta-merkaptoetanolu do roztworu C podczas ostatniego etapu wirowania skutecznie usuwa wszystkie zanieczyszczające lipoproteiny z frakcji HDL. Aby wykazać możliwość ilościowego oznaczenia mikroRNA przeniesionych przez ludzkie HDL oczyszczone tą metodą, przeprowadzono amplifikację dwóch różnych mikroRNA za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym.Na tych wykresach amplifikacji linie poziome reprezentują próg detekcji. Reprezentatywne dane z PCR w czasie rzeczywistym z izolowanego HDL, uzyskane z sześciu próbek, wykazały spójną detekcję obu mikroRNA. Na koniec, analizy krzywych topnienia wyraźnie pokazują pojedynczy, wyraźny pik dla obu mikroRNA, co jest zgodne ze specyficzną amplifikacją w poprzedzającym etapie PCR.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu dziewięciu godzin, wliczając w to procedury odsolenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały czas pracować w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza oraz dostosować gęstość każdej frakcji lipoprotein przed ultrawirowaniem.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące czystości HDL. Po opracowaniu technika ta pozwoli badaczom zajmującym się zespołem metabolicznym badać związane z HDL mikroRNA jako biomarkery u ludzi z podejrzeniem stłuszczenia wątroby. Może ona również zostać wykorzystana do lepszego zrozumienia funkcji HDL oraz mechanizmów molekularnych, dzięki którym białko to zmienia biologię komórki.

fast-simplified-method-for-high-through-put-isolation-mirna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Ten film opisuje ekstrakcję krążącego mikroRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego za pomocą ekstrakcji organicznej, a następnie wzbogacenia kolumny z włókna szklanego. miRNA są stabilne w płynach biologicznych, takich jak surowica i osocze, co czyni je idealnymi krążącymi biomarkerami do diagnozowania raka, rokowania oraz podejmowania decyzji dotyczących leczenia i monitorowania. Metoda ta pomoże zidentyfikować nowe krążące biomarkery zdolne do przewidywania wyników klinicznych u...

Ekstrakcja krążącego miRNA: metoda izolowania miRNA z próbek osocza poprzez ekstrakcję organiczną i wzbogacanie małego RNA

Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Do analizy lipoprotein osocza użyto kilku metod; jednak ultrawirowanie jest nadal jedną z najbardziej popularnych i niezawodnych metod. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania lipoprotein z osocza za pomocą sekwencyjnego ultrawirowania o gęstości oraz jak analizować apolipoproteiny zarówno do celów diagnostycznych, jak i badawczych.

Izolacja i analiza lipoprotein osocza metodą ultrawirowania

Poznaj uproszczoną metodę szybkiej izolacji HDL z ludzkiej osocza krwi do analizy miRNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych i funkcji ochronnych lipoprotein o wysokiej gęstości w hepatologii i kardiologii.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Przeglądaj więcej filmów