Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ogólnym celem tej metody jest opracowanie uproszczonego podejścia do szybkiego izolowania oczyszczonych lipoprotein o wysokiej gęstości z ludzkiego osocza krwi do analizy mikro RNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w hepatologii i kardiologii, takie jak zrozumienie mechanizmów molekularnych i funkcji ochronnych lipoprotein o dużej gęstości. Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że oczyszczone mikro RNA HDL są wstępnie izolowane z mniejszej objętości próbek w krótkim czasie.

W tym protokole osocze uzyskuje się z próbek krwi żylnej obwodowej na czczo za pomocą wielu etapów wirowania, jak opisano w tekście protokołu. Przenieś plazmę do nowej probówki. I zmierz gęstość plazmy za pomocą densytometru w temperaturze pokojowej, zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby usunąć krążące egzosomy, które stanowią źródło zanieczyszczenia mikro RNA, dodaj 252 mikrolitry roztworu wytrącającego egzosomy do jednego mililitra osocza. I inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwiruj mieszaninę przez 30 minut, aby usunąć egzosomy.

Przenieś jeden mililitr powstałego supernatantu do grubościennej probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w celu dalszego przetwarzania, jak pokazano w następnym segmencie filmu. Izolacja lipoprotein o wysokiej gęstości lub HDL odbywa się za pomocą trzystopniowego protokołu ultrawirowania gradientu gęstości, który obejmuje sekwencyjną izolację lipoprotein o bardzo niskiej gęstości lub VLDL, lipoprotein o niskiej gęstości lub LDL i HDL. Trzy roztwory o różnej gęstości, A, B i C, muszą być przygotowane na świeżo, zgodnie z procedurą opisaną w tekście protokołu.

W grubościennej ultrawirówce z poliwęglanu o grubości 6,5 mililitra wymieszaj jeden mililitr osocza i 200 mikrolitrów wolnego od nukleaz tłuszczu czerwonego 7B. Następnie ostrożnie ułóż pięć mililitrów roztworu A na wierzchu mieszaniny. W razie potrzeby dodaj dodatkowy Fat Red 7B na wierzch roztworu A, aby zrównoważyć wagę każdej probówki.

Załaduj rurki do wstępnie schłodzonego wirnika. Umieść wirnik w wirówce podłogowej i wiruj przez dwie godziny. Na końcu biegu powinny być widoczne dwie warstwy.

Usuń 1,5 mililitra górnej warstwy, reprezentującej frakcję VLDL. I przechowuj go w czterech stopniach Celsjusza. Użyj pipety, aby przenieść cztery mililitry z dna probówki do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Zawiera frakcję LDL i HDL. Kolejnym krokiem jest izolacja LDL. Wymieszaj dwa mililitry roztworu B i 100 mikrolitrów wolnego od nukleaz Fat Red 7B z probówką zawierającą frakcję LDL i HDL.

Połóż na lodzie na pięć do dziesięciu minut. Przenieś 6,5 mililitra zmieszanej próbki do grubościennej probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu. Załaduj probówkę do wstępnie schłodzonego wirnika i odwiruj przez trzy godziny.

Po zakończeniu wirowania usuń 1,5 mililitra wierzchniej warstwy, reprezentującej frakcję LDL i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś cztery mililitry z dna probówki zawierającej frakcję HDL do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Trzecim krokiem jest izolacja HDL.

Wymieszaj dwa mililitry roztworu C, 100 mikrolitrów wolnego od nukleaz tłuszczu czerwonego 7B i 15 mikrolitrów 98% beta merkaptoetanolu do probówki zawierającej frakcję HDL. Sprawdź gęstość mieszanki. Załaduj probówkę do wstępnie schłodzonego wirnika i odwiruj przez trzy godziny.

Następnie usuń dwa mililitry górnej warstwy, reprezentujące frakcję HDL i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadmiar soli musi zostać usunięty z frakcji lipoprotein, aby uniknąć zakłóceń w późniejszej elektroforezie w żelu agarozowym i PCR. W tym filmie zostanie zademonstrowane odsalanie i zatężanie tylko dla frakcji HDL.

Dodaj 13 mililitrów zimnego PBS do frakcji HDL i przenieś do odśrodkowego urządzenia filtrującego z odcięciem masy cząsteczkowej 10K. Odwiruj w wahadłowym wirniku kubełkowym, przy 4000 razy g i czterech stopniach Celsjusza, przez 30 minut. Odsolić frakcję HDL po raz drugi, używając 13 mililitrów zimnego PBS i odwirować jak poprzednio.

Po odwirowaniu usuń lipoproteiny zawierające substancje rozpuszczone i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby ocenić jakość i czystość wyizolowanych lipoprotein, przeprowadzono elektroforezę w żelu agarozowym przy użyciu ludzkich wzorców lipoprotein, uwzględnionych jako odniesienie do wielkości. Reprezentatywne wyniki izolacji, bez beta merkaptoetanolu, wykazały, że frakcja HDL jest pozbawiona jakiegokolwiek zanieczyszczenia VLDL i wykazuje typową ruchliwość alfa.

Jednak frakcja HDL wykazuje również ślady ruchliwości beta z powodu zanieczyszczenia lipoproteinami. Dodanie beta merkaptoetanolu do roztworu C, podczas ostatniego etapu wirowania, skutecznie usuwa wszystkie zanieczyszczające lipoproteiny z frakcji HDL. Aby zademonstrować wykonalność ilościowego oznaczania mikro RNA, przenoszonego w ludzkim HDL, oczyszczonego tą metodą, dwa różne mikro RNA amplifikowano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.

Na tych wykresach wzmocnienia linie poziome reprezentują próg wykrywania. Reprezentatywne dane PCR w czasie rzeczywistym z izolowanego HDL, uzyskane z sześciu próbek, wykazały spójne wykrywanie obu mikro RNA. Wreszcie, analizy krzywej topnienia wyraźnie pokazują wyraźny pojedynczy pik dla obu mikro RNA, zgodny ze specyficzną amplifikacją w poprzednim PCR.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dziewięciu godzin, wraz z procedurami odsalania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały czas pracować w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. I dostosować gęstość każdej frakcji lipoprotein przed ultrawirowaniem.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak czystość HDL. Po opracowaniu, technika ta pozwoli naukowcom w dziedzinie zespołu metabolicznego na zbadanie mikro RNA związanych z HDL jako biomarkerów u ludzi z podejrzeniem stłuszczenia wątroby. Może być również wykorzystany do lepszego zrozumienia funkcji HDL i mechanizmów molekularnych, za pomocą których zmienia on biologię komórki.