Name: Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Poznaj implementację mikroskopii CARS do bezbarwnego obrazowania żywych komórek na standardowym mikroskopie laserowym z laserami Ti:Sapphire i OPO. Ta metoda umożliwia badanie procesów biologicznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dr. Philippe'owi Combette'owi (IES, UM, Montpellier, Francja) za wypożyczenie szybkiego oscyloskopu i podziękować za wsparcie finansowe ze strony Montpellier RIO Imaging (MRI). HR dziękuje, że ANR przyznaje France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) i France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) sieci infrastrukturalne na rozwój spójnego obrazowania ramanowskiego. Prace te były głównie wspierane przez grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (FP7-IDEAS-ERC 311610) oraz grant INSERM - AVENIR dla NT.

<ol><li>Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValeur%2C+B+%22Molecular+Fluorescence%3A+Principles+and+Applications%22">Molecular Fluorescence: Principles and Applications</a>. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+imaging+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+B%22%5BJournal%5D)">Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy.</a> JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Yelin, D., Silberberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+third-harmonic-generation+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology.</a> Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+Second-Harmonic+Generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).</li>
<li>Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).</li>
<li>Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+imaging+and+scoring+of+collagen+in+fibrotic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues.</a> Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+Instrumentation%2C+theory%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications.</a> J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).</li>
<li>Volkmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+and+microspectroscopies+based+on+coherent+anti-Stokes+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D%3A+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy.</a> J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).</li>
<li>Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+chemical+imaging+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).</li>
<li>Mukamel, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMukamel%2C+S+%22Principles+of+nonlinear+optical+spectroscopy%22">Principles of nonlinear optical spectroscopy</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope.</a> Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+metabolism+in+live+Caenorhabditis+elegans+using+fingerprint+vibrations%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+and+applications+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology.</a> Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).</li>
<li>Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diffusion+in+the+human+nail+measured+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).</li>
<li>Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+molecular+cutaneous+absorption+in+human+skin+using+label+free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy.</a> J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).</li>
<li>Kano, H., Hamaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-nonlinear+optical+imaging+of+a+living+cell+using+a+supercontinuum+light+source+generated+from+a+photonic+crystal+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber.</a> Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).</li>
<li>Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parametric+oscillator-based+light+source+for+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+practical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview.</a> J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+platform+for+nonlinear+optical+microscopy+and+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy.</a> Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).</li>
<li>Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Photonics+Rev%22%5BJournal%5D)">Multimodal nonlinear optical microscopy.</a> Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multimodal+nonlinear+optical+microscopy+reveals+fundamental+insights+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development.</a> Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).</li>
<li>Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+atherosclerotic+lesions+using+multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).</li>
<li>Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+disease+and+enlightening+biomedicine%3A+Raman+spectroscopy+as+a+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool.</a> Analyst. 138, 3871-3884 (2013).</li>
<li>A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator">http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator</a> (2015).</li>
<li>Ozçelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pals1+is+a+major+regulator+of+the+epithelial-like+polarization+and+the+extension+of+the+myelin+sheath+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves.</a> J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).</li>
<li>Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+saturated+and+unsaturated+lipids+by+wide-field+CARS-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy.</a> Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).</li>
<li>Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectra+measurement+of+olive+oil+and+other+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils.</a> J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).</li>
<li>King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy%3A+normal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Clin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy: normal structure.</a> Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).</li>
<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+3D+in+vivo+imaging+of+sebaceous+glands+by+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+normal+function+and+response+to+cryotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy.</a> J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najtrudniejszą częścią pracy jest czasowa synchronizacja wiązek laserowych. Wymaga to szybkiej fotodiody połączonej z szybkim oscyloskopem, ale na początku można wykonać tylko przybliżone nakładanie się w czasie. Następnie wymagana jest dalsza regulacja o kilka cm. Wreszcie, mikrometr porusza się w liniowym stopniu translacji, co pozwala na ostateczną precyzyjną regulację długości linii opóźniającej w celu wyzwolenia sygnału CARS. Sygnał ten jest utrzymywany w wąskim zakresie około 20 mikrometrów, co obserwuje się poprze...

Mikroskopia optyczna stała się główną techniką nieniszczącej wizualizacji dynamicznych procesów w żywych systemach biologicznych z rozdzielczością subkomórkową. Mikroskopia fluorescencyjna jest obecnie najpopularniejszym kontrastem obrazowym stosowanym w żywych komórkach ze względu na wysoką swoistość i czułość1. Pojawiła się szeroka paleta sond fluorescencyjnych (barwniki egzogenne, białka kodowane genetycznie, nanocząstki półprzewodnikowe). Rozwinęły się różne techniki fluorescencyjne oparte na oświetleniu próbek (takie jak mikroskopia konfokalna lub dwufotonowa) w celu wykonania obrazowania 3D i zmniejszenia głównej wady tej techniki, jaką jest fotowybielanie2. Inne ograniczenia obejmują wymóg znakowania fluoroforami, ponieważ większość gatunków molekularnych nie jest wewnętrznie fluorescencyjna, a zatem te fluorofory muszą być sztucznie wprowadzone do obrazowanej próbki. Ta sztuczna manipulacja może być uciążliwa, zwłaszcza w przypadku małych cząsteczek lub indukować potencjalną fototoksyczność. Powody te sprawiają, że mikroskopia fluorescencyjna nie nadaje się do obserwacji in vivo. Stąd stosowanie technik obrazowania optycznego o wysokiej czułości i specyficznych kontrastach molekularnych bez użycia cząsteczek fluorescencyjnych jest wysoce pożądane w naukach biomedycznych.
Pojawiło się kilka nieliniowych technik obrazowania optycznego bez etykietowania i barwienia, w tym generacja drugiej harmonicznej (SHG)3,4 i generacja trzeciej harmonicznej (THG)5. Mikroskopia SHG została wykorzystana do obrazowania układów strukturalnych na poziomie supramolekularnym, takich jak mikrotubule lub kolagen6. THG jest generowany z niejednorodności optycznych, takich jak granica faz między środowiskiem wodnym a lipidami7. Wykazano również, że THG obrazuje mielinę8,9. Obie techniki mogą być stosowane na dwufotonowym mikroskopie fluorescencyjnym i wymagają tylko jednej wiązki laserowej. Wymagają one jednak dużej intensywności lasera (zwykle 50 mW przy 860 nm dla SHG10, 25 - 50 mW przy 1 180 nm dla THG9), co jest szkodliwe dla żywych próbek i nie zapewnia specyficzności chemicznej, która jest wymagana do jednoznacznego obrazowania określonych struktur biologicznych.
Chemicznie selektywne obrazowanie można uzyskać z naturalnych sygnałów drgań molekularnych opartych na rozpraszaniu Ramana. Kiedy wiązka światła uderza w materię, fotony mogą być absorbowane i rozpraszane przez atomy lub cząsteczki. Większość rozproszonych fotonów będzie miała taką samą energię, tj. częstotliwość, jak fotony padające. Ten proces nazywa się rozpraszaniem Rayleigha. Jednak niewielka liczba fotonów zostanie rozproszona z częstotliwością optyczną inną niż częstotliwość padających fotonów, tj. w nieelastycznym procesie rozpraszania zwanym rozpraszaniem Ramana. Różnica w energii wynika ze wzbudzenia modów wibracyjnych w zależności od struktury molekularnej i środowiska. Dlatego spontaniczne rozpraszanie Ramana zapewnia chemicznie selektywne obrazowanie, ponieważ różne cząsteczki mają określone częstotliwości drgań. Jest jednak ograniczony ze względu na wyjątkowo słaby sygnał. Konfokalna mikroskopia Ramana została opracowana i zapewnia rozdzielczość przestrzenną 3D, ale wymaga wysokiej średniej mocy i długiego czasu akwizycji11. Aby przezwyciężyć te trudności, ostatnie postępy w technologii laserowej umożliwiły rozwój nieliniowej optycznej mikroskopii wibracyjnej, w szczególności koherentnego rozpraszania Ramana przeciwko Stokesowi (CARS)11,12,13.
CARS to nieliniowy proces optyczny trzeciego rzędu. Trzy wiązki laserowe, składające się z wiązki pompy o częstotliwości ωP, wiązki Stokesa o częstotliwości ωS i wiązki sondy (najczęściej będącej pompą) są skupiane w próbce i generują wiązkę anty-Stokesa o częstotliwości ωAS= (2ωP - ωS)14. Sygnał anty-Stokesa może być znacznie wzmocniony, gdy różnica częstotliwości między pompą a wiązkami Stokesa jest dostrojona do drgań molekularnych Ramana ΩR=(ωP - ωS). Sygnał CARS opiera się na oddziaływaniu wielu fotonów. Generuje zatem spójny sygnał o rzędy wielkości silniejszy niż spontaniczne rozpraszanie Ramana.
Mikroskopia CARS została po raz pierwszy eksperymentalnie zademonstrowana przez Duncana i wsp.15. Zumbusch i wsp. udoskonalili następnie technikę, stosując dwie skupione wiązki lasera femtosekundowego w bliskiej podczerwieni z soczewką obiektywową o dużej aperturze numerycznej, co pozwoliło na warunek dopasowania fazowego CARS i uniknięcie dwufotonowego tła nierezonansowego16. Mikroskopia CARS stała się zatem potężnym narzędziem do obrazowania żywych komórek i tkanek, poprzez chemiczne wykrywanie cząsteczek, takich jak lipidy (za pomocą wibracji rozciągających C-H)17,18, woda (za pomocą wibracji rozciągających O-H), białka, DNA w żywych komórkach19,20, ale także deuterowane związki chemiczne do zastosowań farmaceutycznych21 i kosmetycznych22.
Główne ograniczenie mikroskopii nieliniowej wynika ze złożoności i kosztu źródeł optycznych. System CARS wymaga dwóch laserów o regulowanej długości fali o krótkim czasie trwania impulsów oraz z czasowo i przestrzennie zsynchronizowanymi ciągami impulsów. Wczesne mikroskopy CARS opierały się na dwóch zsynchronizowanych pikosekundowych laserach Ti:sapphire20. Obrazowanie CARS uzyskano również za pomocą pojedynczego femtosekundowego lasera Ti:szafirowego generującego źródło światła superkontinuum23. Ostatnio źródła laserowe składające się z pojedynczego femtosekundowego lasera Ti:szafirowego pompującego przestrajalne optyczne oscylatory parametryczne (OPO) zostały wykorzystane w mikroskopii CARS. Taka konfiguracja umożliwia samoistnie zsynchronizowane czasowo wiązki z różnicą częstotliwości między pompą a wiązką Stokesa, obejmujące pełne spektrum drgań molekularnych24. Ponadto laserowe mikroskopy skaningowe oparte na laserze fs "pod klucz" i OPO, używane głównie do fluorescencji dwufotonowej (TPF), są obecnie dostępne dla osób niebędących fizykami. Potencjał takich zestawów można znacznie zwiększyć bez konieczności dodatkowych inwestycji poprzez włączenie innych nieliniowych metod obrazowania optycznego, ponieważ każda metoda obrazowania nieliniowego (NLO) jest wrażliwa na określone struktury lub cząsteczki. Multimodalne obrazowanie NLO wykorzystuje zatem potencjał mikroskopii NLO dla złożonych próbek biologicznych25. Sprzężenie tych technik pozwoliło na zbadanie wielu zagadnień biologicznych, w szczególności dotyczących metabolizmu lipidów, rozwoju skóry lub raka26, rozwoju mięśni szkieletowych27, zmian miażdżycowych28. Co więcej, implementacja skanowania wiązką laserową za pomocą CARS daje możliwość obrazowania o wysokiej szybkości, tj. atrakcyjnego narzędzia do badania procesów dynamicznych in vivo.
Celem tej pracy jest pokazanie każdego kroku do wdrożenia techniki CARS na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym. Mikroskop oparty jest na laserze fsec Ti:sapphire oraz OPO (pompowanym laserem Ti:sapphire) obsługiwanym przez oprogramowanie dla biologów. Integracja została zrealizowana poprzez dostosowanie długości jednej ze ścieżek wiązki laserowej w celu zsynchronizowania w czasie obu wiązek. Opisujemy krok po kroku implementację tej techniki, która wymaga jedynie podstawowego przygotowania w zakresie optyki eksperymentalnej. Ilustrujemy również obrazowanie CARS uzyskane na osłonkach mielinowych nerwu kulszowego gryzoni i pokazujemy, że obrazowanie to można wykonywać jednocześnie z innymi nieliniowymi obrazami optycznymi, takimi jak standardowa technika fluorescencji dwufotonowej i generacja drugiej harmonicznej.

<table><tbody><tr><td>Oscyloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotodetektor</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II</td><td>Koherentny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>optyczny oscylator parametryczny OPO Kompaktowa rodzina</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Examiner mikroskop LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peryskop z napędem Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw W Plan-apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sumator wiązki</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulator akustyczno-optyczny</td><td>Carl Zeiss Tłumik mocy OPO Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa fotopowielacza</td> Carl <td>Zeiss</td> Oprogramowanie Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td> Carl <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Bandpass <td></td><td></td></tr><tr><td> filtry</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp; Nm; 465 - 610&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Długość fali odcięcia 760&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Srebrne lustra</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20 000&nbsp; nm, Ilość 4</td></tr><tr><td>Jednoosiowy stolik translacyjny z mikrometrem wzorcowym</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Ilość 1</td></tr><tr><td>Aluminiowa listwa</td><td>stykowa Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Ilość 1</td></tr><tr><td>Uchwyt lustrzany</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Ilość 4</td></tr><tr><td>Uchwyt lusterka do &Oslash; Optyka 1"&nbsp;</td><td>ilość Thorlabs</td><td>MH25</td><td>4</td></tr><tr><td>Przysłony irysowe&nbsp;</td><td>ilość Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>3</td></tr><tr><td>Skrzynka ochronna</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Ilość 1</td></tr><tr><td>Słupki optyczne</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Ilość 8 (długości w zależności od konfiguracji)</td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 661 - 690 nm</td><td>Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy Semrock 676/29 nm BrightLine&reg;</td><td>Ilość 1</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&handel; Zestaw rozmiarów mikrosfer fluorescencyjnych</td> Karta do oglądania lasera Thorlabs IR Laserowe szkło bezpieczne Newport LV-F22.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromielina i handel; Czerwona fluorescencyjna plama mielinowa&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

implementacja koherentnego systemu rozpraszania ramana (cars) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym ti:sapphire i opo

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laserowe mikroskopy skaningowe łączące femtosekundowy laser Ti:szafirowy i optyczny oscylator parametryczny (OPO) do powielania linii laserowej stały się dostępne dla biologów. Systemy te przeznaczone są przede wszystkim do wielokanałowej dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak bez żadnych modyfikacji, komplementarna nieliniowa mikroskopia optyczna, taka jak generacja drugiej harmonicznej (SHG) lub generacja trzeciej harmonicznej (THG), może być również wykonywana za pomocą tej konfiguracji, umożliwiając bezznacznikowe obrazowanie cząsteczek strukturalnych lub wodnych granic faz międzylipidowych. Techniki te dobrze nadają się do obserwacji in vivo, ale mają ograniczoną specyficzność chemiczną. Chemicznie selektywne obrazowanie można uzyskać na podstawie nieodłącznych sygnałów wibracyjnych opartych na rozpraszaniu Ramana. Konfokalna mikroskopia ramanowska zapewnia rozdzielczość przestrzenną 3D, ale wymaga dużej średniej mocy i długiego czasu akwizycji. Aby przezwyciężyć te trudności, ostatnie postępy w technologii laserowej umożliwiły opracowanie nieliniowej optycznej mikroskopii wibracyjnej, w szczególności koherentnego rozpraszania Ramanowskiego Stokesa (CARS). Mikroskopia CARS stała się zatem potężnym narzędziem do obrazowania biologicznego i żywych komórek, poprzez chemiczne mapowanie lipidów (za pomocą wibracji rozciągających C-H), wody (za pomocą wibracji rozciągających O-H), białek lub DNA. W niniejszej pracy opisano implementację techniki CARS na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym sprzężonym z OPO. Opiera się na synchronizacji w czasie dwóch linii laserowych poprzez regulację długości jednej ze ścieżek wiązki laserowej. Przedstawiamy krok po kroku implementację tej techniki na istniejącym systemie wielofotonowym. Pomocne jest podstawowe zaplecze w optyce eksperymentalnej, a prezentowany system nie wymaga drogiego wyposażenia dodatkowego. Ilustrujemy również obrazowanie CARS uzyskane na osłonkach mielinowych nerwu kulszowego gryzonia i pokazujemy, że obrazowanie to może być wykonywane jednocześnie z innymi nieliniowymi obrazami optycznymi, takimi jak standardowa technika fluorescencji dwufotonowej i generacja drugiej harmonicznej.

Częstotliwość serii impulsów standardowego lasera tytanowo-szafirowego (Ti:sapphire) wynosi zazwyczaj około 80 MHz. OPO posiada tę samą częstotliwość, ponieważ jest pompowany przez laser Ti:sapphire. W związku z tym wymagany jest szybki oscyloskop o przepustowości co najmniej 200 MHz. Wymagana jest również szybka fotodioda w zakresie 600 do 1 100 nm. Maksymalne przesunięcie czasowe występuje, gdy sygnały Ti:sapphire i OPO są przesunięte o 1/(2×80×106) = 6,2 nanosekundy. Odpowia...

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wdrożenie uzupełniającej techniki mikroskopowej zwanej CARS, która umożliwia obrazowanie obrazowanie bez znakowania, selektywne chemicznie i w czasie rzeczywistym, przy użyciu standardowego wielofotonowego skaningowego mikroskopu laserowego opartego na femtosekundowym laserze tytano-szafirowym i oscylatorze parametrów optycznych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii lub neuronauki, takie jak zrozumienie chorób związanych z lipidami, mechanizmów przenikania przez skórę lub schorzeń skóry. Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej implementacji w standardowej skaningowej mikroskopii laserowej opartej na laserach Ti:Sapphire i OPO.Procedurę zaprezentują Hassan Boukhaddaoui, adiunkt i kierownik platformy obrazowania w laboratorium, oraz Vasyl Mytskaniuk. Włącz lasery tytano-szafirowe i OPO zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uruchom komputer sterujący mikroskopem.Włącz przełączniki komponentów mikroskopu. Uruchom oprogramowanie, dwukrotnie klikając ikonę na pulpicie, i skonfiguruj je zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie umieść lustro dichroiczne z długością fali odcięcia 760 nm w suwak

implementation-coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-system-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Opisana jest spójna metodologia obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowego oznaczania związków farmaceutycznych w skórze. W artykule opisano przygotowanie tkanki skórnej (ludzkiej i mysiej) i miejscowe stosowanie preparatów, akwizycję obrazu w celu ilościowego określenia czasoprzestrzennych profili stężeń oraz wstępną analizę farmakokinetyczną w celu oceny miejscowego dostarczania leków.

Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Elektroniczne obrazowanie rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana to nowa platforma do wysoce multipleksowanego obrazowania białek opartych na epitopach. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny przewodnik obejmujący przygotowanie przeciwciał, barwienie próbki tkanki, montaż mikroskopu SRS i obrazowanie tkanek epr-SRS.

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Wizualizacja mielinizacji jest ważnym celem dla wielu badaczy zajmujących się układem nerwowym. CARS to technika kompatybilna z immunofluorescencją, która może natywnie obrazować lipidy w tkankach, takich jak mózg, oświetlając wyspecjalizowane struktury, takie jak mielina.

Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Poznaj implementację mikroskopii CARS do bezbarwnego obrazowania żywych komórek na standardowym mikroskopie laserowym z laserami Ti:Sapphire i OPO. Ta metoda umożliwia badanie procesów biologicznych w czasie rzeczywistym.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO (Wideo) | JoVE Journal

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Przeglądaj więcej filmów