Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego testu opartego na mikroskopii jest identyfikacja czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek HeLa Brucella. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji patogenów gospodarza, takie jak identyfikacja białek gospodarza, które promują lub zapobiegają kolonizacji przez wewnątrzkomórkowy patogen Brucella. Główną zaletą tej techniki jest to, że półautomatyczny przepływ pracy od laboratorium weterynaryjnego do analizy obrazu pozwala robotom i wydajnym eksperymentom o wysokiej przepustowości na tworzenie eksperymentów.

Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w interakcje z gospodarzem Brucella za pomocą badań przesiewowych siRNA. Większość protokołu można zastosować do innych strategii badań przesiewowych. Na przykład lub biblioteki siRNA.

Po wyhodowaniu komórek HeLa i przygotowaniu płytek przesiewowych z siRNA zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić czarną 384-dołkową płytkę przez odwirowanie w temperaturze 300 razy G i temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przygotować pożywkę transfekcyjną przy użyciu dmem o temperaturze pokojowej bez FCS. Aby rozcieńczyć odczynnik do transfekcji jeden do 200 i dokładnie wymieszać przed użyciem.

Za pomocą dozownika odczynników dodaj 25 mikrolitrów pożywki do transfekcji do każdego dołka płytki 384-dołkowej i wymieszaj roztwory, przesuwając płytkę do przodu i do tyłu. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby umożliwić utworzenie kompleksu odczynników do transfekcji siRNA. W międzyczasie przygotuj komórki HeLa, odsysając pożywkę hodowlaną i dodając 2,5 mililitra 0,05% trypsyny EDTA do PBS, aby raz przemyć subkonfluentne komórki kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych.

Następnie dodaj 1,5 mililitra świeżej trypsyny i przenieś kolbę do 37 stopni Celsjusza na dwie do trzech minut, aż komórki się zaokrąglą. Użyj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego dmem 60% FCS, aby ponownie zawiesić ogniwa. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki przed przygotowaniem zawiesiny komórek 10 000 komórek na mililitr w dmem z 16% FCS.

Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki odczynnika do transfekcji. Daje to 500 komórek na studzienkę. Przesuwaj płytkę do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Następnie pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na pięć do 10 minut, aby komórki mogły się uspokoić. Użyj parafilmu, aby uszczelnić płytkę. I inkubuj go w wilgotnym inkubatorze na wstępnie podgrzanej aluminiowej płycie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% C02 przez 72 godziny.

Praca z patogenem klasy trzeciej B.abortus jest niebezpieczna i należy przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego, które obejmują noszenie kombinezonu ochronnego, rękawic ochronnych, maski i okularów. Na jeden dzień, przed zakażeniem, należy zaszczepić wcześniej ustaloną ilość kultury starterowej B.abortus w 50 mililitrach pożywki TSB KM. W butelce z zakrętką o pojemności 250 mililitrów.

Użyj parafilmu, aby uszczelnić butelkę i hodować bakterie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 100 obr./min na wytrząsarce do gęstości optycznej 600,8 do 1,1. Zmierz gęstość optyczną 600 kultury bakteryjnej. I przygotuj pożywkę infekcyjną, rozcieńczając kulturę bakteryjną w dmem 10% FCS, aby osiągnąć pożądaną wielokrotność infekcji.

Lub MOI. Za pomocą automatycznej myjki do płytek wymień pożywkę transfekcyjną na 50 mikrolitrów pożywki infekcyjnej. Wewnątrz okapu przenieś płytkę do klatki wirówki i odwiruj płytkę 384-dołkową w temperaturze 400 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.

Następnie użyj parafilmu, aby uszczelnić płytkę i inkubować ją na wstępnie podgrzanej aluminiowej płycie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% C02 przez cztery godziny. Po inkubacji za pomocą automatycznej myjki do płytek należy użyć dmem z 10% FCS zawierającego 100 mikrogramów na mililitr dentrimysenu lub GM do przemycia komórek w celu inaktywacji bakterii zewnątrzkomórkowych. Następnie użyj parafilmu, aby uszczelnić płytkę i umieść ją z powrotem na wstępnie podgrzanej aluminiowej płytce w inkubatorze na kolejne 40 godzin w celu przeprowadzenia testu punktu końcowego.

Aby naprawić komórki, najpierw użyj PBS do umycia studzienek. Następnie wymień PBS na 50 mikrolitrów 3,7% PFA. W 2 przy pH 7,4.

I inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po inkubacji użyć 50 mikrolitrów PBS do wymiany pożywki utrwalającej. Aby wybarwić próbki za pomocą automatycznej myjki do płytek, należy użyć 50 mikrolitrów 1%Triton X-100 w PBS przez 10 minut, aby przeniknąć do komórek.

Po trzykrotnym użyciu PBS do mycia komórek dodaj 50 mikrolitrów PBS z jednym mikrogramem na mililitr DAPI i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj PBS, aby trzykrotnie umyć komórki przed ochroną ich przed światłem. Przenieś płytkę do mikroskopu automatycznego.

Ustaw parametry mikroskopu. Wybierz 10-X subiektywny. Następnie wybierz format płytki odpowiadający płytce 384-dołkowej.

Zdobądź dziewięć miejsc na odwiert. Wybierz opcję Włącz ustawianie ostrości na podstawie lasera. I skup się na talerzu i dnie studni.

Następnie ustaw pierwszą dobrze nabytą jako początkową studnię do znalezienia próbki i wszystkich miejsc do autofokusa witryny. Następnie dla kanału DAPI ręcznie dostosuj przesunięcie Z dla ostrości. Następnie naciśnij Znajdź próbkę, aby ustawić ostrość na dnie studni.

Korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji, można uzyskać dokładne oszacowanie czasu ekspozycji. Ręcznie skoryguj czas ekspozycji dla kanału DAPI, aby zapewnić szeroki zakres dynamiki przy niskim prześwietleniu. Użyj tego czasu naświetlania, aby zobrazować kilka miejsc na całej płycie.

I dostosuj czas ekspozycji ręcznie, aż najjaśniejsze piksele osiągną około 80% maksymalnej jasności nad witrynami. Powtórz kroki, aby ustawić ostrość i czas ekspozycji, odpowiednio dla wszystkich innych kanałów. Następnie rozpocznij pozyskiwanie pełnej płyty.

Do oznaczania punktu końcowego należy użyć kanałów DAPI i GFP, aby zobrazować pełną płytkę. Aby uruchomić analizę obrazu na wybarwionych komórkach w teście punktu końcowego, po obliczeniu modelu cieniowania, zgodnie z protokołem tekstowym w obszarze Wyświetl ustawienia wyjściowe wybierz folder wejściowy z obrazami i folder wyjściowy z wynikami. Następnie zdefiniuj tekst, który jest wspólny dla obrazów, i wczytaj modele cieniowania.

Kliknij przycisk Rozpocznij tryb testowy i upewnij się, że ustawienie pauzy i wyświetlaczy dla wszystkich modułów jest wyłączone. Włącz ustawienie pauzy i wyświetlania dla modułu dziewiątego ImageMath. Symbol włączonej pauzy pojawi się na żółto.

Włączona funkcja wyświetlania pojawi się jako otwarte oko. Następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić analizę do modułu dziewiątego. W module dziewiątym dostosuj parametr pomnóż drugi obraz przez do wartości, która stłumi sygnał DAPI w Brucelli bez tłumienia jąder.

Aby przetestować wartości modułu, naciśnij przycisk Krok. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo otwarty obraz i ustaw kontrast obrazu na znormalizowany. Kilkakrotnie cofnij się do modułu dziewiątego.

Dostosuj parametr, pomnóż drugi obraz przez i ponownie przejdź przez moduł, aż sygnał Brucella zostanie całkowicie stłumiony, jednocześnie minimalizując czarne obszary wskazujące na nadmierne odejmowanie. Znalezienie dobrych parametrów dla poszczególnych modułów wymaga stopniowej optymalizacji parametrów. Zdecydowanie ważne jest, aby wielokrotnie przechodzić przez moduły, wypróbowując różne wartości i obserwując wpływ na wyświetlany wynik.

Włącz pauzę i wyświetlanie dla modułu 10. Zidentyfikuj obiekty podstawowe. Ustawia dolną granicę parametru na progu, na tyle wysoką, aby jądra były segmentowane, a tło ignorowane.

Aby zidentyfikować dobrą wartość, przejdź przez moduł, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram w miejscu, w którym szczyt zwykle wskazuje tło. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż do uzyskania dobrej segmentacji jąder, jak pokazano na obrazie wyjściowym. Celem procesu analizy obrazu jest identyfikacja komórek, które zawierają replikujące się bakterie.

Osiąga się to poprzez ustawienie różnych progów dla sygnału patogenu w jądrze, jądrze okołojądrowym i ciele komórki Woronoja. Włącz pauzę i wyświetlanie dla modułu 15. Filtruj obiekty, jak pokazano wcześniej, i naciśnij Uruchom.

Ustaw minimalną wartość parametru na tyle wysoką, aby zachowane zostały tylko komórki z wyraźnie widoczną Brucellą w jądrze, a wszystkie inne zostały odfiltrowane. Aby zidentyfikować dobrą wartość, przejdź przez moduł i wyświetl obraz wyjściowy. Zwiększaj wartość stopniowo, aż zostaną zachowane tylko komórki z wyraźnie widoczną brucelozą w jądrze.

Po przefiltrowaniu komórek z bakteriami w jądrze okołojądrowym i ciele komórki Woronoja w modułach 16 i 17 zgodnie z protokołem tekstowym, wyjdź z trybu testowego i odznacz wszystkie symbole oczu obok modułów, aby upewnić się, że żaden z modułów nie pokazuje swojego wyświetlacza przed uruchomieniem pełnej analizy. Na koniec naciśnij Analizuj obrazy, aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy sprawdź wynikowe obrazy PNG oraz arkusz kalkulacyjny CSV, aby upewnić się, że analiza działała niezawodnie na całej płycie.

Przeprowadzić test wejściowy i ocenę punktową infekcji zgodnie z protokołem tekstowym. Na rysunku przedstawiono przykład analizy obrazu wykorzystywanej do automatycznej identyfikacji zakażonych komórek w teście punktu końcowego. Zidentyfikowano jądra komórek HeLa barwionych DAPI.

Okołojądro o szerokości ośmiu pikseli otaczające jądro. Obliczono ciało komórki Woronoja przez wydłużenie jądra o 25 pikseli. Komórkę uważano za zakażoną, jeśli sygnał patogenu przekroczył odpowiedni próg w co najmniej jednym przedziale.

Brucella wymaga działania rearanżacji w celu pomyślnego zaangażowania komórek gospodarza. Zatem wyczerpanie ARP23 jest odpowiednią kontrolą pozytywną do badań przesiewowych siRNA. Wyczerpanie ARPC3 zmniejszyło liczbę komórek z namnażającymi się bakteriami dwa dni po zakażeniu.

W porównaniu z jajecznicą traktowaną komórkami kontrolowanymi. Zautomatyzowana analiza obrazu wykazała ilościowo zmniejszenie infekcji komórek HeLa zubożonych w ARPC3 w porównaniu z komórkami kontrolowanymi na tym wykresie. Zubożenie ARPC3 wykazało również zmniejszenie zakażenia Brucellą w teście wejściowym w porównaniu z komórkami kontrolowanymi.

Jak widać po zmniejszonej liczbie wewnątrzkomórkowych Brucella przedstawionych na żółto. Wreszcie, kwantyfikacja infekcji za pomocą automatycznej analizy obrazu potwierdziła, że liczba zakażonych komórek, jak również liczba bakterii wewnątrzkomórkowych w zakażonych komórkach została zmniejszona przez wyczerpanie ARPC3. Po opanowaniu protokół ten może dać wyniki analizy obrazu w ciągu półtora tygodnia od rozpoczęcia eksperymentu.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dokładnie przejrzeć wyniki analizy obrazu, aby upewnić się, że wybrane parametry działają dobrze na całej płycie. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania. Na przykład, gdy handlujesz, pewien czynnik gospodarza wchodzi w interakcję z Brucellą.

Albo jak wyczerpanie genu wpływa na wewnątrzkomórkową dynamikę infekcji. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią zakażeń do zbadania czynników gospodarza wymaganych do zakażenia Brucellą w teście z komórek HeLa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować czynniki gospodarza, które promują lub uniemożliwiają pomyślną kolonizację komórek HeLa przez wewnątrzkomórkowy patogen Brucella abortus.

Nie zapominaj, że praca z Brucella abortus może być bardzo niebezpieczna i należy ściśle przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.