Name: Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowe testy mikroskopowe do identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek HeLa Brucellą. Ta metoda wykorzystuje ekranowanie siRNA i automatyczną analizę obrazu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty 51RT 0_126008 i 51RTP0_151029 dla projektu badawczo-technologicznego (RTD) InfectX i TargetInfectX, odpowiednio, w ramach SystemsX.ch, Szwajcarskiej Inicjatywy na rzecz Biologii Systemów. Potwierdzamy 310030B_149886 grantów Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNSF). Prace S.H.L i A.C. były wspierane przez Międzynarodowy Program Doktorancki "Fellowships for Excellence" Biozentrum. Simone Muntwiler jest znana z pomocy technicznej. Chcielibyśmy podziękować Dirkowi Bumannowi za dostarczenie pNF106 oraz Jeanowi Celli za pJC43 i pJC44.

<ol><li>Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+global+map+of+human+brucellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The new global map of human brucellosis.</a> Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).</li>
<li>Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+human+pathogenic+Brucella+species+with+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).</li>
<li>Guzman-Verri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+of+the+Rho+subfamily+are+required+for+Brucella+abortus+internalization+in+nonprofessional+phagocytes%3A+direct+activation+of+Cdc42%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42.</a> J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).</li>
<li>Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+intracellular+replication+requires+trafficking+through+the+late+endosomal%2Flysosomal+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment.</a> Traffic. 9, 678-694 (2008).</li>
<li>Boschiroli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brucella+suis+virB+operon+is+induced+intracellularly+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).</li>
<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
<li>Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acidification+of+phagosomes+containing+Brucella+suis+is+essential+for+intracellular+survival+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages.</a> Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).</li>
<li>Anderson, T. D., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+morphometric+analysis+of+Brucella+abortus-infected+trophoblasts+in+experimental+placentitis.+Bacterial+replication+occurs+in+rough+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum.</a> Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).</li>
<li>Ramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+large-scale+RNAi+screens+for+pathogen+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry.</a> BMC genomics. 15, 1162(2014).</li>
<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Patogeny bakteryjne wyewoluowały wiele strategii manipulowania eukariotycznymi komórkami gospodarza na swoją korzyść. Patogeny wywołujące ostre infekcje często wykazują szybką proliferację, której towarzyszy znaczne zaniepokojenie układu odpornościowego i utrata żywotności zakażonych komórek. W przeciwieństwie do tego, bruceloza i inne patogeny powodujące przewlekłe infekcje są w stanie nawiązać długotrwałe interakcje w komórkach gospodarza. Dlatego bakterie muszą precyzyjnie dostroić funkcje komórek gospodarza ...

Gatunki Brucella to gram-ujemne, fakultatywne patogeny wewnątrzkomórkowe należące do klasy α-Proteobacteria. Powodują poronienia i bezpłodność u swoich naturalnych żywicieli, takich jak bydło, kozy lub owce, powodując poważne straty ekonomiczne na obszarach endemicznych. Bruceloza jest jedną z najważniejszych chorób odzwierzęcych na świecie, powodującą rocznie ponad pół miliona nowych zakażeń u ludzi1. Przeniesienie na człowieka jest najczęściej spowodowane bezpośrednim kontaktem z zakażonymi zwierzętami lub spożyciem skażonej żywności, takiej jak niepasteryzowane mleko. Objawy choroby gorączkowej są niespecyficzne, co powoduje trudności w rozpoznaniu brucelozy. Nieleczona choroba może doprowadzić do rozwoju przewlekłej infekcji z poważniejszymi objawami, takimi jak zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia i neuropatia2.
Na poziomie komórkowym Brucella jest w stanie atakować komórki fagocytarne i niefagocytarne oraz replikować się w obrębie wewnątrzkomórkowego przedziału znanego jako wakuola zawierająca Brucellę (BCV). Internalizacja bakterii wymaga rearanżacji cytoszkieletu aktynowego przez Rac, Rho i bezpośrednią aktywację Cdc423. Wewnątrz eukariotycznej komórki gospodarza BCV przemieszcza się wzdłuż szlaku endocytarnego i pomimo interakcji z lizosomami bakteriom udaje się uniknąć degradacji4. Zakwaszenie BCV przez pęcherzykową ATPazę jest wymagane do indukowania ekspresji bakteryjnego systemu wydzielania typu IV (T4SS)5. Uważa się, że efektory bakteryjne wydzielane przez T4SS są niezbędne do utworzenia przez Brucellę niszy replikacyjnej, ponieważ delecja T4SS6 lub hamowanie pęcherzykowej ATPazy prowadzi do wad w tworzeniu niszy wewnątrzkomórkowej7. Bakterie nie replikują się w fazie transportu, dopóki nie dotrą do przedziału wakuolarnegopochodzącego z ER 8. Gdy dojdzie do proliferacji wewnątrzkomórkowej, BCV znajduje się w ścisłym związku z markerami ER, takimi jak kalneksyna i glukozo-6-fosfataza6.
Mechanizmy molekularne, dzięki którym Brucella dostaje się do komórek, unika degradacji lizosomalnej i w końcu replikuje się w komorze podobnej do ER, pozostają w dużej mierze nieznane. Czynniki gospodarza zaangażowane w różne etapy infekcji zostały zidentyfikowane głównie za pomocą metod celowanych lub badania przesiewowego małego interferującego RNA (siRNA) na małą skalę przeprowadzonego w komórkach Drosophila 9. Rzuciły one światło na udział poszczególnych czynników gospodarza w zakażeniu Brucellą, ale nadal jesteśmy dalecy od pełnego zrozumienia całego procesu.
Tutaj przedstawione są protokoły, które pozwalają na identyfikację czynników ludzkich gospodarzy za pomocą badań przesiewowych interferencji RNA (RNAi) na dużą skalę w połączeniu z automatyczną mikroskopią fluorescencyjną o szerokim polu widzenia i automatyczną analizą obrazu. Odwrotna transfekcja siRNA komórek HeLa jest wykonywana zgodnie z wcześniejszym opisem10,11 z niewielkimi modyfikacjami. Test punktu końcowego obejmuje dużą część wewnątrzkomórkowego cyklu życia Brucelli, z wyjątkiem wyjścia i infekcji sąsiednich komórek. Aby dokładniej scharakteryzować trafienia zidentyfikowane w teście punktu końcowego, stosuje się zmodyfikowany protokół identyfikacji czynników zaangażowanych we wczesne etapy infekcji.
Szczep Brucella abortus, który konstytutywnie wyraża GFP, jest używany do testu końcowego, w którym bakterie mogą infekować komórki przez dwa dni. W tym czasie bakterie dostają się do komórek, przemieszczają się do niszy replikacyjnej pochodzącej z ER i replikują się w przestrzeni okołojądrowej. Wysoki poziom sygnału GFP może być następnie wykorzystany do niezawodnego wykrywania pojedynczych komórek, które zawierają replikujące się bakterie.
Aby zbadać wejście Brucella do wysokoprzepustowego testu, ważne jest, aby móc rozróżnić bakterie wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Przedstawiona tutaj metoda omija różnicowe barwienie przeciwciałami bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych. Opiera się na szczepie Brucella wykazującym ekspresję GFP indukowanego tetracykliną w połączeniu z konstytutywną ekspresją dsRed. Obecność składowego markera dsRed pozwala na identyfikację wszystkich bakterii obecnych w próbce. Ekspresja GFP jest indukowana przez dodanie nietoksycznego analogu tetracykliny anhydrotetracykliny (aTc) jednocześnie z inaktywacją bakterii zewnątrzkomórkowych przez gentamycynę (Gm). Podczas gdy nieprzepuszczalny dla komórek antybiotyk Gm zabija bakterie zewnątrzkomórkowe, aTc może dostać się do komórki gospodarza i selektywnie indukować ekspresję GFP w bakteriach wewnątrzkomórkowych. Ten podwójny reporter umożliwia solidne oddzielenie pojedynczych bakterii wewnątrzkomórkowych (sygnał GFP i dsRed) od bakterii zewnątrzkomórkowych (tylko sygnał dsRed) przy użyciu mikroskopii szerokokątnej. Aby osiągnąć wykrywalną ekspresję GFP przez wewnątrzkomórkową Brucellę, stwierdziliśmy, że 4 godziny indukcji przez aTc dają wiarygodny sygnał. Podobne schematy indukcji do selektywnej ekspresji GFP w bakteriach wewnątrzkomórkowych były wcześniej wykorzystywane do badania wewnątrzkomórkowego Shigella12.

<table><tbody><tr><td>Agar sojowy tryptyczny (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml butelka z nakrętką</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Płód Surowica cielęca (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x roztwór podstawowy, rozcieńczony 1:10 w PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Licznik komórek</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>Można użyć alternatywnych urządzeń do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384-dołkowa płytka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Zrywalna folia aluminiowa</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik odczynników: "Dozownik odczynników Multidrop 384"</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>Można użyć alternatywnego dozownika odczynników.</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna myjka do płytek: "Podkładka do płytek ELx50-16"</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>Ta podkładka do płytek zawiera 16-kanałowy kolektor odpowiedni dla płytek 384-dołkowych. Mieści się w komorze bezpieczeństwa biologicznego i posiada pokrywę zakrywającą płytkę podczas mycia, co zmniejsza ryzyko produkcji aerozolu. Można zastosować alternatywne podkładki płytowe o podobnych właściwościach.</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek anhydrotetracykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956; g/ml roztworu w 100% etanolu utrzymuje się w temperaturze -20 & stopni; C zabezpieczone przed światłem w folii aluminiowej</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Rozpuścić w 0,2 M buforze HEPES, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C i rozmrozić świeżo dzień przed użyciem. Uwaga, PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Zaszyfrowane siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Konstrukcja: pJC44 4 trawiono za pomocą EcoRI, a następnie wytwarzano końce enzymem Klenova, a następnie trawiono SalI. TetR-GFP amplifikowano z pNF106 przy użyciu startera prAC090 i prAC092. Po trawieniu z SalI, produkt TetR-GFP podwiązano do strawionego wektora pJC44.</td></tr><tr><td>Podkład prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT</td></tr><tr><td>TC HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Zautomatyzowany mikroskop do obrazowania komórkowego wyposażony w precyzyjny, zmotoryzowany stolik Z. Można zastosować alternatywne systemy do mikroskopii automatycznej oraz alternatywne komponenty do sprzętu i oprogramowania określone poniżej.</td></tr><tr>Szybkie <td>laserowe urządzenia molekularne</td> <td>z autofokusem</td>&nbsp;<td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw CFI Super Fluor 10X</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Pryzmat: 10X, Sprężynowy</td></tr><tr><td>Fotometria CoolSNAP HQ Monochromatyczna kamera CCD</td><td>Urządzenia molekularne&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1,392 x 1,040 pikseli obrazowania, 6,45 x 6,45 i mikro; m pikseli, 12 bitów digitalizacja</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MetaXpress</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Lekki silnik. Stosowane są następujące źródła światła: fioletowy (DAPI), cyjan (GFP), zielony/żółty (RFP)</td></tr><tr><td>Wzbudnica jednopasmowa do DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Jednopasmowa emitera do DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>Jednopasmowa dichroiczna do DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Jednopasmowa wzbudnica do GFP</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>Emiter jednopasmowy do GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Jednopasmowy dichroiczny do GFP</td> Wzbudnica jednopasmowa <td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr> do <tr><td>zapytania ofertowego</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Jednopasmowy emiter do RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Jednopasmowy dichroiczny do RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela brucellą

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Gatunki Brucella to fakultatywne patogeny wewnątrzkomórkowe, które infekują zwierzęta jako ich naturalni gospodarze. Przenoszenie na ludzi jest najczęściej spowodowane bezpośrednim kontaktem z zakażonymi zwierzętami lub spożyciem skażonej żywności i może prowadzić do ciężkich przewlekłych infekcji.
Brucella może atakować profesjonalne i nieprofesjonalne komórki fagocytarne i replikować się w wakuolach pochodzących z retikulum endoplazmatycznego (ER). Czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucelli do komórek gospodarza, uniknięcia degradacji lizosomalnej i replikacji w kompartmencie podobnym do ER pozostają w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy dwa testy w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w wnikanie i replikację Brucelli w komórkach HeLa. Protokoły opisują wykorzystanie interferencji RNA, podczas gdy można zastosować alternatywne metody badań przesiewowych. Testy opierają się na wykrywaniu fluorescencyjnie znakowanych bakterii w znakowanych fluorescencyjnie komórkach gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii szerokokątnej. Obrazy fluorescencyjne są analizowane przy użyciu ustandaryzowanego potoku analizy obrazu w CellProfiler, który umożliwia ocenę infekcji na podstawie pojedynczych komórek.
W teście końcowym replikacja wewnątrzkomórkowa jest mierzona dwa dni po zakażeniu. Dzięki temu bakterie mogą przemieszczać się do swojej niszy replikacyjnej, gdzie proliferacja jest inicjowana około 12 godzin po wniknięciu bakterii. Brucella, która z powodzeniem stworzyła niszę wewnątrzkomórkową, będzie więc silnie namnażać się w komórkach gospodarza. Ponieważ bakterie wewnątrzkomórkowe znacznie przewyższają liczebnie pojedyncze zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe bakterie niereplikacyjne, można zastosować szczep konstytutywnie wyrażający GFP. Silny sygnał GFP jest następnie wykorzystywany do identyfikacji zakażonych komórek.
Natomiast dla testu wejściowego niezbędne jest rozróżnienie między bakteriami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi. W tym przypadku stosuje się kodowanie szczepu dla GFP indukowanego tetracykliną. Indukcja GFP przy jednoczesnej inaktywacji bakterii zewnątrzkomórkowych przez gentamycynę umożliwia różnicowanie bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych na podstawie sygnału GFP, przy czym tylko bakterie wewnątrzkomórkowe są zdolne do ekspresji GFP. Pozwala to na solidne wykrywanie pojedynczych bakterii wewnątrzkomórkowych przed rozpoczęciem proliferacji wewnątrzkomórkowej.

Rycina 1A przedstawia przykład analizy obrazu wykorzystywanej do automatycznej identyfikacji zakażonych komórek w teście końcowym. Zidentyfikowano jądra komórek HeLa barwione DAPI, a następnie wyznaczono obszar okojądrowy o szerokości 8 pikseli otaczający jądro oraz ciało komórki w układzie Voronoi poprzez rozszerzenie jądra o 25 pikseli. Ponieważ bakterie proliferują głównie w przestrzeni okojądrowej, intensywność GFP w tym obszarze komórki jest najbardziej wiarygodnym p...

Opisano dwa testy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na mikroskopii czynników gospodarza związanych z infekcją Brucellą. Test wejściowy wykrywa czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucella, a test końcowy te, które są wymagane do replikacji wewnątrzkomórkowej. Chociaż ma zastosowanie do alternatywnych podejść, badania przesiewowe siRNA w komórkach HeLa są wykorzystywane do zilustrowania protokołów.

Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego testu opartego na mikroskopii jest zidentyfikowanie czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję komórek HeLa przez Brucella. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji gospodarza z patogenem, takie jak identyfikacja białek gospodarza, które sprzyjają lub zapobiegają kolonizacji przez wewnątrzkomórkowy patogen Brucella. Główną zaletą tej techniki jest to, że półautomatyczny proces – od laboratorium weterynaryjnego po analizę obrazów – umożliwia wykorzystanie robotów i efektywne tworzenie eksperymentów o wysokiej przepustowości.W ten sposób metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat interakcji Brucella z gospodarzem z wykorzystaniem przesiewowych badań siRNA. Większość protokołu można zastosować w innych strategiach przesiewowych, na przykład w przypadku bibliotek siRNA.Po hodowli komórek HeLa i przygotowaniu płytek screeningowych z siRNA zgodnie z protokołem tekstowym, rozmroź czarną płytkę 384-dołkową poprzez wirowanie przy 300 ×g w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przygotuj medium do transfekcji, używając DMEM w temperaturze pokojowej bez FCS. Rozcieńcz odczyn do transfekcji w stosunku 1:200 i dokładnie wymieszaj przed użyciem.Używając dozownika odczynników, dodaj 25 µL medium do transfekcji do każdej studni płytki 384-dołkowej i wymieszaj roztwory, poruszając płytką w przód i w tył. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby umożliwić tworzenie się kompleksów odczynnika do transfekcji siRNA. W międzyczasie przygotuj komórki HeLa, odsysając medium hodowlane i dodając 2,5 mL 0,05% trypsyny EDTA w PBS, aby raz przemyć subkonfluencyjne komórki w kolbie o powierzchni 75 cm².Następnie dodaj 1,5 mililitra świeżej trypsyny i przenieś kolbę do temperatury 37 °C na dwie do trzech minut, aż komórki zmienią kształt na kulisty. Do resuspensji komórek użyj 10 mililitrów uprzednio ogrzanego dmem z 60% FCS. Następnie, za pomocą automatycznego licznika komórek, określ liczbę komórek przed przygotowaniem zawiesiny o stężeniu 10 000 komórek na mililitr w dmem z 16% FCS.Do każdego dołka z odczynnikiem do transfekcji należy dodać 50 µL zawiesiny komórkowej, tak aby w każdym dołku znalazło się 500 komórek. Płytkę należy przesuwać w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki.Następnie pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut, aby komórki mogły osiąść. Użyj paraflemu do uszczelnienia płytki. Następnie inkubuj ją w wilgotnym inkubatorze na uprzednio podgrzanej aluminiowej płytce w temperaturze 37 °C przy 5% C02 przez 72 godziny.Praca z patogenem klasy trzeciej B.abortus jest niebezpieczna i wymaga przestrzegania lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego, co obejmuje noszenie ochronnego kombinezonu, rękawic ochronnych, maski oraz gogli. Na jeden dzień przed infekcją, zaszczep wcześniej określoną ilość kultury startowej B.abortus w 50 mililitrach pożywki TSB KM. Procedurę należy przeprowadzić w butelce z nakrętką o pojemności 250 mililitrów.Użyj parafilmu do uszczelnienia butelki i inkubuj bakterie przez noc w temperaturze 37°C przy 100 RPM na wytrząsarce do uzyskania gęstości optycznej OD₆₀₀ od 0,8 do 1,1. Zmierz gęstość optyczną OD₆₀₀ hodowli bakteryjnej. Następnie przygotuj medium infekcyjne, rozcieńczając hodowlę bakteryjną w DMEM z 10% FCS, aby uzyskać pożądaną wielokrotność infekcji (MOI).Lub MOI. Używając automatycznego myjni do płytek, wymień medium do transfekcji na 50 µL medium do infekcji. Wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza umieść płytkę w koszyczku wirówki i wiruj płytkę 384-dołkową przy 400 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.Następnie szczelnie zamknąć płytkę za pomocą parafilmu i inkubować ją na podgrzanej płycie aluminiowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery godziny. Po inkubacji, przy użyciu automatycznej myjki do płytek, przemyć komórki medium DMEM z 10% FCS zawierającym 100 µg/mL dentrimycyny lub GM w celu inaktywacji bakterii pozakomórkowych. Następnie ponownie zamknąć płytkę parafilmem i umieścić ją na podgrzanej płycie aluminiowej w inkubatorze na kolejne 40 godzin do przeprowadzenia analizy końcowej.Aby utrwalić komórki, najpierw należy wypłukać studzienki za pomocą PBS. Następnie wymienić PBS na 50 µL 3,7% PFA w pH 7,4.Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po inkubacji użyj 50 µL PBS, aby wymienić medium do fiksacji. Aby zabarwić próbki za pomocą automatycznej myjki do płytek, rozpocznij od zastosowania 50 µL 1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w celu permeabilizacji komórek.Po trzykrotnym przemyciu komórek za pomocą PBS należy dodać 50 µL PBS z DAPI w stężeniu 1 µg/mL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie komórki należy trzykrotnie przemyć PBS, a następnie zabezpieczyć przed światłem. Przenieś płytkę do mikroskopu automatycznego.Skonfiguruj parametry mikroskopu. Wybierz obiektyw 10-X. Następnie wybierz format płytki odpowiadający płytce 384-dołkowej.Należy zebrać dane z dziewięciu pól na każdą studzienkę. Wybierz opcję Enable laser-based focusing. Następnie wykonaj ustawienie ostrości na płytce oraz na dnie studzienki.Następnie ustaw pierwszy zidentyfikowany dołek jako dołek początkowy do wyszukiwania próbki oraz wszystkie miejsca dla autofokusa miejscowego. Następnie, w kanale DAPI, ręcznie dostosuj przesunięcie Z (Z offset) dla ostrości. Po tym naciśnij Find Sample, aby ustawić ostrość na dnie dołka.Używając funkcji AutoExposure, uzyskaj dobrą szacunkową wartość czasu ekspozycji. Ręcznie skoryguj czas ekspozycji dla kanału DAPI, aby zapewnić szeroki zakres dynamiczny przy niskim poziomie prześwietlenia. Wykorzystaj ten czas ekspozycji do obrazowania kilku miejsc na całej płytce.Następnie należy ręcznie dostosować czas ekspozycji, aż najjaśniejsze piksele osiągną około 80% maksymalnej jasności w obrębie poszczególnych obszarów. Powtórz kroki ustawiania ostrości i czasu ekspozycji odpowiednio dla wszystkich pozostałych kanałów. Następnie rozpocznij akwizycję całej płytki.W analizie końcowej (end point assay) należy wykorzystać kanały DAPI i GFP do obrazowania całej płytki. Aby przeprowadzić analizę obrazów zabarwionych komórek w analizie końcowej, po obliczeniu modelu cieniowania, zgodnie z protokołem tekstowym w sekcji View output settings, należy wybrać folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy na wyniki. Następnie należy zdefiniować wspólny tekst w nazwach obrazów i załadować modele cieniowania.Kliknij Start test mode i upewnij się, że ustawienia pauzy oraz wyświetlania dla wszystkich modułów są wyłączone. Włącz ustawienie pauzy i wyświetlania dla modułu dziewiątego ImageMath. Aktywny symbol pauzy pojawi się w kolorze żółtym.Włączona funkcja wyświetlania będzie widoczna jako otwarte oko. Następnie kliknij Run, aby uruchomić analizę do modułu dziewiątego. W module dziewiątym dostosuj parametr multiply the second image by do wartości, która stłumi sygnał DAPI w Brucella, nie tłumiąc jednocześnie jąder komórkowych.Aby przetestować wartości dla modułu, naciśnij Step. Kliknij prawym przyciskiem myszy na nowo otwartym obrazie i ustaw kontrast obrazu na log normalized. Powtórz kroki, aby powrócić do modułu dziewiątego.Dostosuj parametr multiply the second image by i ponownie przejdź przez moduł, aż sygnał Brucella zostanie całkowicie stłumiony, a jednocześnie zminimalizowane zostaną czarne obszary wskazujące na nadmierne odjęcie. Wyznaczenie optymalnych parametrów dla niektórych modułów wymaga stopniowej optymalizacji. Niezwykle ważne jest wielokrotne przechodzenie przez moduły, próbowanie różnych wartości i obserwowanie ich wpływu na wyświetlany wynik.Włącz funkcję pauzy i wyświetlania dla modułu 10. Zidentyfikuj obiekty podstawowe. Ustaw dolną granicę parametru progu na poziomie wystarczająco wysokim, aby jądra zostały wysegmentowane, a tło zignorowane.Aby zidentyfikować odpowiednią wartość, przesuń kursor nad moduł, następnie kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram, w którym szczyt zazwyczaj wskazuje tło. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż do uzyskania prawidłowej segmentacji jąder, widocznej na obrazie wyjściowym. Celem potoku analizy obrazu jest zidentyfikowanie komórek zawierających replikujące się bakterie.Osiąga się to poprzez ustawienie różnych progów dla sygnału patogenu w jądrze, obszarze okołojądrowym oraz w obrębie komórki Voronoia. Włącz funkcję pauzy i wyświetlania dla modułu 15. Przefiltruj obiekty, tak jak pokazano wcześniej, i naciśnij Run.Ustaw wartość minimalną parametru na tyle wysoką, aby zachowano jedynie komórki z wyraźnie widoczną Brucella w jądrze, a wszystkie pozostałe zostały odfiltrowane. Aby określić odpowiednią wartość, uruchom moduł i wyświetl obraz wyjściowy. Zwiększaj wartość stopniowo, aż do momentu, gdy zostaną zachowane tylko komórki z wyraźnie widoczną Brucella w jądrze.Po przefiltrowaniu komórek z bakteriami w obszarze okojądrowym i w obrębie komórki Voronoi w modułach 16 i 17 zgodnie z protokołem tekstowym, wyjdź z trybu testowego i odznacz wszystkie symbole oka obok modułów, aby upewnić się, że żaden z nich nie wyświetla obrazu przed uruchomieniem pełnej analizy. Na koniec naciśnij Analyze Images, aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy sprawdź powstałe obrazy w formacie PNG oraz arkusz CSV, aby upewnić się, że analiza przebiegła niezawodnie dla całej płytki.Przeprowadzić analizę wnikania oraz ocenę infekcji zgodnie z protokołem tekstowym. Rycina ta przedstawia przykład analizy obrazu wykorzystywanej do automatycznej identyfikacji zainfekowanych komórek w końcowym punkcie analizy. Zidentyfikowano jądra komórek HeLa zabarwione DAPI.Obliczono obszar okojądrowy o szerokości ośmiu pikseli otaczający jądro oraz ciało komórki w formie komórki Woronojego, poprzez rozszerzenie jądra o 25 pikseli. Komórkę uznano za zainfekowaną, jeśli sygnał patogenu przekroczył odpowiedni próg w przynajmniej jednym z tych obszarów.Brucella wymaga reorganizacji aktynowej do skutecznego wniknięcia do komórek gospodarza. W związku z tym usunięcie ARP23 stanowi odpowiednią kontrolę pozytywną w badaniach przesiewowych siRNA. Usunięcie ARPC3 zmniejszyło liczbę komórek z proliferującymi bakteriami dwa dni po infekcji.W porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi sekwencją scrambled. Zautomatyzowana analiza obrazu wykazała ilościowy spadek infekcji w komórkach HeLa z wyczerpanym ARPC3 w porównaniu z komórkami kontrolnymi na tym wykresie. Wyczerpanie ARPC3 spowodowało również redukcję infekcji Brucella w teście wnikania w porównaniu z komórkami kontrolnymi.Wskazuje na to zmniejszona liczba wewnątrzkomórkowych Brucella zaznaczonych na żółto. W końcowej fazie ilościowe określenie stopnia infekcji za pomocą zautomatyzowanej analizy obrazu potwierdziło, że zarówno liczba zainfekowanych komórek, jak i liczba bakterii wewnątrzkomórkowych w tych komórkach uległy zmniejszeniu w wyniku deplecji ARPC3. Po opanowaniu techniki, niniejszy protokół pozwala na uzyskanie wyników analizy obrazu w ciągu półtora tygodnia od rozpoczęcia eksperymentu.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest dokładne przeanalizowanie wyników analizy obrazu, aby upewnić się, że wybrane parametry działają prawidłowo na całej płytce. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład podczas badania transportu określonego czynnika gospodarza wchodzącego w interakcję z Brucella.Lub jak usunięcie genu wpływa na wewnątrzkomórkową dynamikę infekcji. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii infekcji do badania czynników gospodarza niezbędnych do zakażenia Brucella w teście z użyciem komórek HeLa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak identyfikować czynniki gospodarza, które sprzyjają lub zapobiegają skutecznej kolonizacji komórek HeLa przez wewnątrzkomórkowy patogen Brucella abortus.Należy pamiętać, że praca z Brucella abortus może być niezwykle niebezpieczna i należy ściśle przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

microscopy-based-assays-for-high-throughput-screening-host-factors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Casanova, A. i in. Testy oparte na mikroskopii do wysokoprzepustowego przesiewania czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję brucella komórkami hela. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje wysokoprzepustowe obrazowanie zakażenia Brucella abortus w komórkach nabłonkowych z użyciem siRNA-medializowanego STING knockdown, aby zbadać rolę wykrywania DNA cytosolowego w wewnątrzkomórkowej replikacji bakterii oraz wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Wysokoprzepustowe obrazowanie wewnątrzkomórkowego zakażenia brucella abortus w komórkach nabłonka gospodarza

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Poznaj wysokoprzepustowe testy mikroskopowe do identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek HeLa Brucellą. Ta metoda wykorzystuje ekranowanie siRNA i automatyczną analizę obrazu.

Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą (Wideo) | JoVE Journal

Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Przeglądaj więcej filmów