Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego testu opartego na mikroskopii jest zidentyfikowanie czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję komórek HeLa przez Brucella. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji gospodarza z patogenem, takie jak identyfikacja białek gospodarza, które sprzyjają lub zapobiegają kolonizacji przez wewnątrzkomórkowy patogen Brucella. Główną zaletą tej techniki jest to, że półautomatyczny proces – od laboratorium weterynaryjnego po analizę obrazów – umożliwia wykorzystanie robotów i efektywne tworzenie eksperymentów o wysokiej przepustowości.

W ten sposób metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat interakcji Brucella z gospodarzem z wykorzystaniem przesiewowych badań siRNA. Większość protokołu można zastosować w innych strategiach przesiewowych, na przykład w przypadku bibliotek siRNA.

Po hodowli komórek HeLa i przygotowaniu płytek screeningowych z siRNA zgodnie z protokołem tekstowym, rozmroź czarną płytkę 384-dołkową poprzez wirowanie przy 300 ×g w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przygotuj medium do transfekcji, używając DMEM w temperaturze pokojowej bez FCS. Rozcieńcz odczyn do transfekcji w stosunku 1:200 i dokładnie wymieszaj przed użyciem.

Używając dozownika odczynników, dodaj 25 µL medium do transfekcji do każdej studni płytki 384-dołkowej i wymieszaj roztwory, poruszając płytką w przód i w tył. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby umożliwić tworzenie się kompleksów odczynnika do transfekcji siRNA. W międzyczasie przygotuj komórki HeLa, odsysając medium hodowlane i dodając 2,5 mL 0,05% trypsyny EDTA w PBS, aby raz przemyć subkonfluencyjne komórki w kolbie o powierzchni 75 cm².

Następnie dodaj 1,5 mililitra świeżej trypsyny i przenieś kolbę do temperatury 37 °C na dwie do trzech minut, aż komórki zmienią kształt na kulisty. Do resuspensji komórek użyj 10 mililitrów uprzednio ogrzanego dmem z 60% FCS. Następnie, za pomocą automatycznego licznika komórek, określ liczbę komórek przed przygotowaniem zawiesiny o stężeniu 10 000 komórek na mililitr w dmem z 16% FCS.

Do każdego dołka z odczynnikiem do transfekcji należy dodać 50 µL zawiesiny komórkowej, tak aby w każdym dołku znalazło się 500 komórek. Płytkę należy przesuwać w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Następnie pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut, aby komórki mogły osiąść. Użyj paraflemu do uszczelnienia płytki. Następnie inkubuj ją w wilgotnym inkubatorze na uprzednio podgrzanej aluminiowej płytce w temperaturze 37 °C przy 5% C02 przez 72 godziny.

Praca z patogenem klasy trzeciej B.abortus jest niebezpieczna i wymaga przestrzegania lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego, co obejmuje noszenie ochronnego kombinezonu, rękawic ochronnych, maski oraz gogli. Na jeden dzień przed infekcją, zaszczep wcześniej określoną ilość kultury startowej B.abortus w 50 mililitrach pożywki TSB KM. Procedurę należy przeprowadzić w butelce z nakrętką o pojemności 250 mililitrów.

Użyj parafilmu do uszczelnienia butelki i inkubuj bakterie przez noc w temperaturze 37°C przy 100 RPM na wytrząsarce do uzyskania gęstości optycznej OD₆₀₀ od 0,8 do 1,1. Zmierz gęstość optyczną OD₆₀₀ hodowli bakteryjnej. Następnie przygotuj medium infekcyjne, rozcieńczając hodowlę bakteryjną w DMEM z 10% FCS, aby uzyskać pożądaną wielokrotność infekcji (MOI).

Lub MOI. Używając automatycznego myjni do płytek, wymień medium do transfekcji na 50 µL medium do infekcji. Wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza umieść płytkę w koszyczku wirówki i wiruj płytkę 384-dołkową przy 400 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.

Następnie szczelnie zamknąć płytkę za pomocą parafilmu i inkubować ją na podgrzanej płycie aluminiowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery godziny. Po inkubacji, przy użyciu automatycznej myjki do płytek, przemyć komórki medium DMEM z 10% FCS zawierającym 100 µg/mL dentrimycyny lub GM w celu inaktywacji bakterii pozakomórkowych. Następnie ponownie zamknąć płytkę parafilmem i umieścić ją na podgrzanej płycie aluminiowej w inkubatorze na kolejne 40 godzin do przeprowadzenia analizy końcowej.

Aby utrwalić komórki, najpierw należy wypłukać studzienki za pomocą PBS. Następnie wymienić PBS na 50 µL 3,7% PFA w pH 7,4.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po inkubacji użyj 50 µL PBS, aby wymienić medium do fiksacji. Aby zabarwić próbki za pomocą automatycznej myjki do płytek, rozpocznij od zastosowania 50 µL 1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w celu permeabilizacji komórek.

Po trzykrotnym przemyciu komórek za pomocą PBS należy dodać 50 µL PBS z DAPI w stężeniu 1 µg/mL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie komórki należy trzykrotnie przemyć PBS, a następnie zabezpieczyć przed światłem. Przenieś płytkę do mikroskopu automatycznego.

Skonfiguruj parametry mikroskopu. Wybierz obiektyw 10-X. Następnie wybierz format płytki odpowiadający płytce 384-dołkowej.

Należy zebrać dane z dziewięciu pól na każdą studzienkę. Wybierz opcję Enable laser-based focusing. Następnie wykonaj ustawienie ostrości na płytce oraz na dnie studzienki.

Następnie ustaw pierwszy zidentyfikowany dołek jako dołek początkowy do wyszukiwania próbki oraz wszystkie miejsca dla autofokusa miejscowego. Następnie, w kanale DAPI, ręcznie dostosuj przesunięcie Z (Z offset) dla ostrości. Po tym naciśnij Find Sample, aby ustawić ostrość na dnie dołka.

Używając funkcji AutoExposure, uzyskaj dobrą szacunkową wartość czasu ekspozycji. Ręcznie skoryguj czas ekspozycji dla kanału DAPI, aby zapewnić szeroki zakres dynamiczny przy niskim poziomie prześwietlenia. Wykorzystaj ten czas ekspozycji do obrazowania kilku miejsc na całej płytce.

Następnie należy ręcznie dostosować czas ekspozycji, aż najjaśniejsze piksele osiągną około 80% maksymalnej jasności w obrębie poszczególnych obszarów. Powtórz kroki ustawiania ostrości i czasu ekspozycji odpowiednio dla wszystkich pozostałych kanałów. Następnie rozpocznij akwizycję całej płytki.

W analizie końcowej (end point assay) należy wykorzystać kanały DAPI i GFP do obrazowania całej płytki. Aby przeprowadzić analizę obrazów zabarwionych komórek w analizie końcowej, po obliczeniu modelu cieniowania, zgodnie z protokołem tekstowym w sekcji View output settings, należy wybrać folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy na wyniki. Następnie należy zdefiniować wspólny tekst w nazwach obrazów i załadować modele cieniowania.

Kliknij Start test mode i upewnij się, że ustawienia pauzy oraz wyświetlania dla wszystkich modułów są wyłączone. Włącz ustawienie pauzy i wyświetlania dla modułu dziewiątego ImageMath. Aktywny symbol pauzy pojawi się w kolorze żółtym.

Włączona funkcja wyświetlania będzie widoczna jako otwarte oko. Następnie kliknij Run, aby uruchomić analizę do modułu dziewiątego. W module dziewiątym dostosuj parametr multiply the second image by do wartości, która stłumi sygnał DAPI w Brucella, nie tłumiąc jednocześnie jąder komórkowych.

Aby przetestować wartości dla modułu, naciśnij Step. Kliknij prawym przyciskiem myszy na nowo otwartym obrazie i ustaw kontrast obrazu na log normalized. Powtórz kroki, aby powrócić do modułu dziewiątego.

Dostosuj parametr multiply the second image by i ponownie przejdź przez moduł, aż sygnał Brucella zostanie całkowicie stłumiony, a jednocześnie zminimalizowane zostaną czarne obszary wskazujące na nadmierne odjęcie. Wyznaczenie optymalnych parametrów dla niektórych modułów wymaga stopniowej optymalizacji. Niezwykle ważne jest wielokrotne przechodzenie przez moduły, próbowanie różnych wartości i obserwowanie ich wpływu na wyświetlany wynik.

Włącz funkcję pauzy i wyświetlania dla modułu 10. Zidentyfikuj obiekty podstawowe. Ustaw dolną granicę parametru progu na poziomie wystarczająco wysokim, aby jądra zostały wysegmentowane, a tło zignorowane.

Aby zidentyfikować odpowiednią wartość, przesuń kursor nad moduł, następnie kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram, w którym szczyt zazwyczaj wskazuje tło. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż do uzyskania prawidłowej segmentacji jąder, widocznej na obrazie wyjściowym. Celem potoku analizy obrazu jest zidentyfikowanie komórek zawierających replikujące się bakterie.

Osiąga się to poprzez ustawienie różnych progów dla sygnału patogenu w jądrze, obszarze okołojądrowym oraz w obrębie komórki Voronoia. Włącz funkcję pauzy i wyświetlania dla modułu 15. Przefiltruj obiekty, tak jak pokazano wcześniej, i naciśnij Run.

Ustaw wartość minimalną parametru na tyle wysoką, aby zachowano jedynie komórki z wyraźnie widoczną Brucella w jądrze, a wszystkie pozostałe zostały odfiltrowane. Aby określić odpowiednią wartość, uruchom moduł i wyświetl obraz wyjściowy. Zwiększaj wartość stopniowo, aż do momentu, gdy zostaną zachowane tylko komórki z wyraźnie widoczną Brucella w jądrze.

Po przefiltrowaniu komórek z bakteriami w obszarze okojądrowym i w obrębie komórki Voronoi w modułach 16 i 17 zgodnie z protokołem tekstowym, wyjdź z trybu testowego i odznacz wszystkie symbole oka obok modułów, aby upewnić się, że żaden z nich nie wyświetla obrazu przed uruchomieniem pełnej analizy. Na koniec naciśnij Analyze Images, aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy sprawdź powstałe obrazy w formacie PNG oraz arkusz CSV, aby upewnić się, że analiza przebiegła niezawodnie dla całej płytki.

Przeprowadzić analizę wnikania oraz ocenę infekcji zgodnie z protokołem tekstowym. Rycina ta przedstawia przykład analizy obrazu wykorzystywanej do automatycznej identyfikacji zainfekowanych komórek w końcowym punkcie analizy. Zidentyfikowano jądra komórek HeLa zabarwione DAPI.

Obliczono obszar okojądrowy o szerokości ośmiu pikseli otaczający jądro oraz ciało komórki w formie komórki Woronojego, poprzez rozszerzenie jądra o 25 pikseli. Komórkę uznano za zainfekowaną, jeśli sygnał patogenu przekroczył odpowiedni próg w przynajmniej jednym z tych obszarów.

Brucella wymaga reorganizacji aktynowej do skutecznego wniknięcia do komórek gospodarza. W związku z tym usunięcie ARP23 stanowi odpowiednią kontrolę pozytywną w badaniach przesiewowych siRNA. Usunięcie ARPC3 zmniejszyło liczbę komórek z proliferującymi bakteriami dwa dni po infekcji.

W porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi sekwencją scrambled. Zautomatyzowana analiza obrazu wykazała ilościowy spadek infekcji w komórkach HeLa z wyczerpanym ARPC3 w porównaniu z komórkami kontrolnymi na tym wykresie. Wyczerpanie ARPC3 spowodowało również redukcję infekcji Brucella w teście wnikania w porównaniu z komórkami kontrolnymi.

Wskazuje na to zmniejszona liczba wewnątrzkomórkowych Brucella zaznaczonych na żółto. W końcowej fazie ilościowe określenie stopnia infekcji za pomocą zautomatyzowanej analizy obrazu potwierdziło, że zarówno liczba zainfekowanych komórek, jak i liczba bakterii wewnątrzkomórkowych w tych komórkach uległy zmniejszeniu w wyniku deplecji ARPC3. Po opanowaniu techniki, niniejszy protokół pozwala na uzyskanie wyników analizy obrazu w ciągu półtora tygodnia od rozpoczęcia eksperymentu.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest dokładne przeanalizowanie wyników analizy obrazu, aby upewnić się, że wybrane parametry działają prawidłowo na całej płytce. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład podczas badania transportu określonego czynnika gospodarza wchodzącego w interakcję z Brucella.

Lub jak usunięcie genu wpływa na wewnątrzkomórkową dynamikę infekcji. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii infekcji do badania czynników gospodarza niezbędnych do zakażenia Brucella w teście z użyciem komórek HeLa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak identyfikować czynniki gospodarza, które sprzyjają lub zapobiegają skutecznej kolonizacji komórek HeLa przez wewnątrzkomórkowy patogen Brucella abortus.

Należy pamiętać, że praca z Brucella abortus może być niezwykle niebezpieczna i należy ściśle przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.