Name: Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj metodę pomiaru fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej. Ta technika pozwala badać odpowiedź immunologiczną na ćwiczenia fizyczne i interwencje dietetyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Zackowi Shue, Caseyowi Johnowi i Lynn Cialdella-Kam za pomoc podczas optymalizacji tej procedury.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do oznaczania dwóch wskaźników funkcji granulocytów i monocytów. Zidentyfikowaliśmy kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tego testu. Jednym z takich etapów jest inkubacja w łaźni lodowej, która odbywa się bezpośrednio przed dodaniem bakterii. Dokładne schłodzenie wszystkich próbek zminimalizuje wpływ temperatury na fagocytozę i aktywność OB. Kolejnym krytycznym krokiem jest dodanie bakterii do każdej próbki. Stosunek bakterii do fagocytów wynoszący...

Test aktywności fagocytozy granulocytów i monocytów/wybuchu oksydacyjnego (OB) jest prostą, nieskomplikowaną techniką, która jest często używana do zbierania informacji o wrodzonej funkcji immunologicznej po długotrwałym i intensywnym wysiłku.1-4 Podczas badania odpowiedzi układu odpornościowego na bodziec, granulocyty i monocyty są szczególnie interesujące, ponieważ odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza i są pierwszymi komórkami odpornościowymi, które gromadzą się w miejscu infekcji. 5 Neutrofile, rodzaj granulocytów, są pierwszymi komórkami, które przemieszczają się do uszkodzonej tkanki mięśniowej po intensywnym wysiłku. 6 Fagocytoza i aktywność OB są najczęstszymi miarami funkcji granulocytów i monocytów,7 i są preferowane jako wskaźniki wrodzonej funkcji komórek odpornościowych ze względu na ich centralną rolę zarówno w procesie infekcji, jak i w procesie naprawy.
Test opisany w tym manuskrypcie wykorzystuje podstawowy cytometr przepływowy, aby zapewnić ilościowe określenie fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności OB w pełnej krwi. Zastosowanie krwi pełnej w tej technice jest korzystne, ponieważ pozwala na przeprowadzenie testu bez czasochłonnej procedury oczyszczania. Test ten można łatwo modyfikować, aby dostosować go do różnych projektów badawczych i możliwości laboratoryjnych. Na przykład Liao i in. zastosowali podobną technikę, aby wykazać, że aktywność neutrofili OB jest zwiększona, a fagocytoza neutrofili zmniejszona po urazowym uszkodzeniu mózgu. 8 W innym przykładzie McFarlin i in. opisali elegancką modyfikację tej techniki, która wykorzystuje CD66b sprzężoną z allofikocyjaniną (APC) i wysokowydajne tandemowe znakowanie CD45 sprzężonego z APC za pomocą cytometrii przepływowej opartej na obrazie w celu sklasyfikowania granulocytów pod względem ich fagocytozy i aktywności OB. 7,9
Nasza grupa badawcza używała różnych adaptacji tej techniki jako wskaźnika wrodzonej funkcji immunologicznej w populacjach z nadwagą, otyłością i atletyzmem przez prawie 20 lat. 10,11 Poniższy tekst dostarczy czytelnikowi instrukcji krok po kroku dotyczących wykonywania tego testu i podkreśli obszary, które czytelnik może dostosować do potrzeb swoich badań.

<table><tbody><tr><td>Probówki 12 x 75 mm, z nasadką</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Potrzebne będą 2 probówki na próbkę ("H" i "F") oraz 3 probówki na partię (do kontroli testów; "F", "H" i "Tylko krew").</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka do butelki 0,2 i mikro; m filtr z octanu celulozy (pojemność 500 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, proszek</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy (bezwodny, testowany na kulturach komórkowych, testowany na kulturach komórkowych roślin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyl sulftlenek (DMSO) Bezwodne</td><td>technologie życia</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Szczep drewna bez białka A) BioParticles, koniugat fluoresceiny (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Szczep drewna bez białka A) BioParticles, nieoznakowany</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>4,0 ml vacutainer zawierający 7,2 mg K2EDTA, suszony rozpyłowo</td><td></td><td>VWR</td><td>BD367861 Na próbkę potrzebna będzie 1 probówka do pobierania krwi K2EDTA.</td></tr><tr><td>Vacutainer o pojemności 4,0 ml zawierający 68 jednostek USP Heparyna litowa, powlekana natryskowo</td><td>VWR</td><td>BD367884</td><td>Na próbkę potrzebna będzie 1 probówka do pobierania krwi z heparyną litową.</td></tr><tr><td>REDLICA Ac&middot; T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>i.e., analizator hematologiczny</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Płukanie</td><td>redlic Beckman 8547167</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Kalibrator Cal Beckman</td><td>Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Diluent</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Końcówki do pipet o przedłużonej długości</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Izolowana miska na lód</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Do kąpieli w lodowatej wodzie.</td></tr><tr><td>Otwarty metalowy stojak na probówki</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza TQ-Prep</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e., zautomatyzowana stacja robocza do przygotowywania lizy komórek</td></tr><tr><td>System odczynników ImmunoPrep</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e., system odczynników RBC lyse/WBC fix</td></tr><tr><td>System cytometrii przepływowej Cytomics FC500 MCL z oprogramowaniem CXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check Fluorospheres&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>i.e., weryfikacja osiowania i płynności fluorosfery</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td><td>FlowJo FlowJo</td><td></td><td>i.e., oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>i.e., program do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego</td></tr></tbody></table>

pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Test fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego (OB) może być wykorzystany do badania wrodzonego układu odpornościowego. Niniejszy manuskrypt zawiera niezbędną metodologię do dodania tego testu do arsenału immunologii próbnej. Pierwszym krokiem w tym teście jest przygotowanie dwóch podwielokrotności ("H" i "F") krwi pełnej (heparyny). Następnie do podwielokrotności H dodaje się dihydroethidium i obie podwielokrotności inkubuje się w ciepłej łaźni wodnej, a następnie w zimnej kąpieli wodnej. Następnie do podwielokrotności H dodaje się Staphylococcus aureus (S. aureus), a do podwielokrotności F dodaje się Staphylococcus aureus znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (bakterie: fagocyt = 8:1), a obie podwielokrotności inkubuje się w ciepłej łaźni wodnej, a następnie w kąpieli w zimnej wodzie. Następnie do każdej podwielokrotności dodaje się błękit trypanowy w celu wygaszenia fluorescencji zewnątrzkomórkowej, a komórki przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie czerwone krwinki są poddawane lizie, a białe krwinki są utrwalane. Na koniec stosuje się cytometr przepływowy i odpowiednie oprogramowanie analityczne do pomiaru fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności OB. Ten test jest stosowany od ponad 20 lat. Po ciężkim i długotrwałym wysiłku sportowcy doświadczają znacznego, ale przejściowego wzrostu fagocytozy i przedłużonego spadku aktywności OB. Wzrost fagocytozy po wysiłku jest skorelowany ze stanem zapalnym. W przeciwieństwie do osób o normalnej masie ciała, fagocytoza granulocytów i monocytów jest przewlekle podwyższona u uczestników z nadwagą i otyłością i jest umiarkowanie skorelowana z białkiem C-reaktywnym. Podsumowując, ten test oparty na cytometrii przepływowej mierzy fagocytozę i aktywność OB fagocytów i może być stosowany jako dodatkowa miara stanu zapalnego wywołanego wysiłkiem fizycznym i otyłością.

Przedłużony i intensywny wysiłek fizyczny wywiera głęboki wpływ na funkcje odporności wrodzonej, w tym na funkcję komórek naturalnych zabójców (NK), odpowiedź makrofagów opartą na cytokinach w reakcji na infekcję wirusową oraz fagocytozę i aktywność oksydacyjną (OB) granulocytów i monocytów. Liczne badania wskazują, że fagocytoza granulocytów i monocytów znacząco wzrasta po wysiłku, co odzwierciedla stan zapalny wywołany uszkodzeniem mięśni i zapotrzebowaniem metabolicznym. Przeciwnie, ak...

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody pomiaru fagocytozy monocytów i granulocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego w próbkach ludzkiej krwi.

Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Ogólnym celem niniejszego testu jest pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności wyrzutu oksydacyjnego w krwi pełnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak wpływ konkretnej interwencji dietetycznej na odpowiedź immunologiczną na wysiłek fizyczny. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty i przejrzysty test, który można łatwo zmodyfikować w zależności od dostępnych zasobów laboratoryjnych oraz zainteresowań badawczych.Przez ostatnie dwie dekady stosowaliśmy ten pomiar funkcji odporności wrodzonej w wielu naszych badaniach nad wysiłkiem fizycznym; część tych danych przedstawimy później w filmie. Przed rozpoczęciem procedury należy użyć analizatora hematologicznego w celu wykonania morfologii krwi z rozmazem leukocytarnym próbek krwi, zgodnie z instrukcjami producenta. Należy odnotować liczbę białych krwinek w komórkach na mililitr oraz wartości procentowe neutrofili i monocytów dla próbek.Następnie, dla każdej próbki doświadczalnej i kontrolnej, należy użyć wydłużonego końcówki do pipety, aby przenieść 100 µL każdej próbki krwi pełnej z probówki do pobierania krwi z heparyną litową na dno odpowiednio oznakowanej probówki 12 x 75 mm. Po przeniesieniu całej krwi, do probówek oznaczonych czerwonym tuszem i literą H, w tym do probówki kontrolnej HE, należy dodać 10 µL roztworu roboczego HE. Należy zdjąć nakrętki z probówek.Krótko wymieszaj próbki na wirówce typu vortex, a następnie przenieś probówki do kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w otwartym metalowym statywie, delikatnie wstrząsając je co pięć minut. Po 15 minutach szybko przenieś statyw wraz z probówkami do kąpieli w lodowatej wodzie na 12 minut, ponownie delikatnie wstrząsając co pięć minut. Po zakończeniu inkubacji dodaj odpowiednią objętość nieoznakowanej roztworu roboczego S.aureus do probówek oznakowanych czerwonym tuszem i literą H, w tym do probówki kontrolnej HE.Krótko wymieszaj probówki na wortexie z zamkniętymi nakrętkami. Następnie do probówek oznaczonych czarnym tuszem i literą F, w tym do probówki kontrolnej FITC, dodaj odpowiednią objętość roboczego roztworu S.aureus znakowanego FITC i krótko wymieszaj próbki na wortexie. Następnie inkubuj wszystkie probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 20 minut, wstrząsając je co pięć minut, a następnie schładzaj przez jedną minutę w wodzie z lodem.Po pozostawieniu próbek w temperaturze pokojowej, należy użyć pipety wielokanałowej do dodania 100 µL lodowatego roztworu zatrzymującego do wszystkich probówek, a następnie wymieszać próbki w wstrząsarce typu vortex. Próbki należy ponownie umieścić w łaźni z lodem. Po jednej minucie, za pomocą pipety wielokanałowej, należy dodać 1 mm lodowatego PBS do każdej z probówek.Następnie wymieszaj zawartość probówek w wirówce wortexowej i dodaj do próbek kolejne 2 ml PBS. Teraz odwiruj komórki i odessij supernatant. Za pomocą pipety wielokrotnej dodaj do probówek 50 µl schłodzonego w lodzie FBS.Po wymieszaniu w wortexie przenieś wszystkie probówki do karuzeli. Użyj zautomatyzowanej stacji do przygotowania lizy komórkowej, aby poddać lizie erytrocyty i utrwalić leukocyty zgodnie z instrukcjami producenta. Aby przeanalizować wyniki testu za pomocą cytometrii przepływowej, uruchom oprogramowanie do akwizycji systemu cytometrii przepływowej i utwórz nowy protokół.Wybierz FITC dla parametru FL1 w teście fagocytozy oraz HE dla parametru FL2 w teście aktywności wybuchu oksydacyjnego. Utwórz wykres kropkowy rozproszenia światła przedniego względem bocznego (forward versus side scatter), histogram FL1 oraz histogram FL2. Następnie wyznacz obszary wielobokowe dla populacji białych krwinek, granulocytów i monocytów na wykresie rozproszenia światła przedniego względem bocznego oraz wyznacz obszary liniowe na histogramach.Następnie należy przeanalizować próbkę kontrolną negatywną (tylko krew), a po niej próbki kontrolne pozytywne HE i FITC, sprawdzając histogramy i w razie potrzeby regulując napięcia fotopowielaczy dla kanałów FITC i PE. Następnie rozpocząć akwizycję danych dla próbek kontrolnych. Po 15-minutowym okresie stabilizacji należy załadować próbki badawcze do karuzeli zgodnie z kolejnością na liście roboczej i rozpocząć analizę próbek badawczych.Aby ocenić aktywność fagocytarną próbek, należy najpierw zgromadzić wszystkie pliki danych w trybie listy dla próbek znakowanych F oraz próbek kontrolnych w jednym folderze, a następnie przeciągnąć te pliki do obszaru próbek w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej. Kliknąć dwukrotnie próbkę kontrolną i użyć selektora bramki wielokąta, aby ustawić bramkę dla całkowitej populacji białych krwinek, dbając o to, by objęła ona wszystkie komórki znajdujące się na krawędziach wykresu. Nazwać tę bramkę WBC.Kliknij dwukrotnie bramkę WBC i użyj eliptycznego selektora bramek, aby ustawić bramkę limfocytów. Oznacz odpowiednio bramkę i przesuń procentowe dane bramki na bok, aby komórki były dobrze widoczne. Następnie użyj poligonowego selektora bramek, aby ustawić bramkę granulocytów oraz bramkę monocytów.Oznacz odpowiednio każdą bramkę i przeciągnij procentowe dane bramek na bok. Dwukrotnie kliknij próbkę kontrolną FITC, a następnie bramkę granulocytów i użyj rozwijanych menu, aby ustawić oś X na FL1, a oś Y na rozproszenie boczne (side scatter), czyli SS. Użyj kwadratowego selektora bramek, aby ustawić bramkę negatywną dla fagocytozy oraz bramkę pozytywną dla fagocytozy. Zaznacz bramkę pozytywną dla fagocytozy w populacji granulocytów.Następnie kliknij Workspace i Add Statistic. Zaznacz Geometric Mean oraz FL1, aby wyznaczyć intensywność fluorescencji granulocytów dodatnich pod kątem fagocytozy, i kliknij Add. Następnie wybierz frequency of parent statistic i kliknij Add, aby wyznaczyć procent granulocytów dodatnich pod kątem fagocytozy.Aby zastosować te ustawienia do wszystkich próbek badania, zaznacz wszystkie bramki i statystyki utworzone w próbce kontrolnej FITC, a następnie przeciągnij je do obszaru All Samples w panelu grup. Zapisz pracę jako plik WSP w tym samym folderze, w którym znajduje się folder z danymi w trybie list (list mode data). Teraz kliknij pierwszą próbkę eksperymentalną w zestawie danych i upewnij się, że bramka dla białych krwinek odpowiednio obejmuje rozkład komórek w każdej z próbek, dostosowując w razie potrzeby krawędzie bramki.Teraz kliknij bramkę dla białych krwinek w pierwszej próbce eksperymentalnej i potwierdź, że bramki dla granulocytów, monocytów i limfocytów pasują do rozkładu komórek w każdej z próbek, dostosowując bramki w razie potrzeby. Po zapisaniu pliku kliknij ikonę edytora tabel i przeciągnij każdą interesującą statystykę do tabeli. Kliknij Create Table, aby wyświetlić dane w formacie arkusza kalkulacyjnego, a następnie zapisz pracę jako plik XLSX.Następnie powtórz analizę dla próbek aktywności wyrzutu oksydacyjnego znakowanych H oraz plików danych w trybie listy kontrolnej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Jak pokazano w tym reprezentatywnym eksperymencie, fagocytoza S.aureus pośredniczona przez granulocyty wzrasta bezpośrednio po 75-kilometrowym przejeździe na rowerze oraz po 1,5 godziny, a następnie wraca do normy następnego ranka. Aktywność wyrzutu oksydacyjnego granulocytów jest obniżona przez co najmniej 21 godzin po aktywności na tym poziomie.Ponadto, w przeprowadzonej analizie grupy 106 kobiet z nadwagą lub otyłością zaobserwowano umiarkowaną korelację między fagocytozą granulocytów a poziomem białka C-reaktywnego w surowicy, co wskazuje, że wysoka fagocytoza granulocytów i monocytów u osób w stanie spoczynku może świadczyć o ogólnoustrojowym stanie zapalnym. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można przeanalizować około 30 próbek w ciągu siedmiu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest całkowite schłodzenie próbek przed dodaniem bakterii, aby zminimalizować niewyjaśnioną zmienność między próbkami.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak oznaczanie ilości cytokin, aby określić wpływ interwencji na odpowiedź zapalną. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii do badania wpływu różnych zmian stylu życia oraz funkcji odporności wrodzonej u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat pomiaru fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego za pomocą cytometru przepływowego.Należy pamiętać, że praca z ludzką krwią może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).

measuring-granulocyte-monocyte-phagocytosis-oxidative-burst-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę ilościowego oznaczania fagocytozy patogennych zarodników grzybów znakowanych FITC przez ludzkie leukocyty. Zarodniki fagocytozowane są odróżniane od zarodników przylegających do komórek poprzez barwienie przeciwstawne, a następnie analizę cytometryczną przepływową.

Ilościowy pomiar fagocytozy zarodników grzybów metodą cytometrii przepływowej przez ludzkie fagocyty

Ten film demonstruje test potwierdzający aktywność fagocytarną komórek w ludzkiej krwi za pomocą cytometrii przepływowej. Granulocyty i monocyty potwierdzają swoją aktywność fagocytarną, wykazując zieloną i czerwoną fluorescencję, potwierdzającą odpowiednio obecność pochłoniętych bakterii i aktywność wybuchu oksydacyjnego.

Test do oceny fagocytozy i aktywności oksydacyjnej w granulocytach i monocytach

Ten film prezentuje jednowarstwowy test monocytów wykorzystujący pierwotne monocyty z krwi obwodowej do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ z opsonizowanymi przeciwciałami poli D czerwonych krwinek R2R2.

Test do badania fagocytozy sterowanej receptorem fcγ w monowarstwach monocytów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesny pomiar fagocytozy bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Cytometria przepływowa oparta na obrazie pozwoliła na zidentyfikowanie trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, z których każdy różnił się względną zdolnością funkcjonalną.

Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Test monocytów (MMA) to test in vitro, który wykorzystuje izolowane pierwotne monocyty uzyskane z pełnej krwi obwodowej ssaków do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR).

Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Haemophilus influenzae wywołuje stan zapalny w drogach oddechowych. W tym artykule skupimy się na zastosowaniu cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej do określenia odpowiedzi immunologicznej fagocytów i limfocytów w odpowiedzi na tę bakterię.

Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae

Opracowaliśmy ulepszenia i zaktualizowane metody dla istniejącego testu monocytytowo-monowarstwowego (MMA), w którym makrofagi są używane do lepszego przewidywania klinicznego znaczenia alloprzeciwciał krwinek czerwonych w medycynie transfuzjologicznej i immunologii. Ten test nazywa się testem monocytów-makrofagów (M-MA).

Przewidywanie znaczenia przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym za pomocą testu monocytów-makrofagów

Praca ta opisuje ustandaryzowany protokół in vitro służący do ilościowego określenia i porównania wskaźników fagocytozy ksenogenicznych (ludzkich) i allogenicznych (szczurów) czerwonych krwinek przez izolowane makrofagi szczurów.

Ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro

Poznaj metodę pomiaru fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej. Ta technika pozwala badać odpowiedź immunologiczną na ćwiczenia fizyczne i interwencje dietetyczne.

Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

Przeglądaj więcej filmów