Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie mokrej chemicznej obróbki powierzchni dla kwiatowego polimeru węglowego politetrafluoroetylenu lub PTFE. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak poprawa biokompatybilności polimerów medycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymagana jest tylko minimalna ilość sprzętu, a metoda ma bardziej ogólne zastosowanie w porównaniu z innymi metodami.

Przygotowanie roztworu naftalenidu sodu wymaga ściśle higienicznych warunków. Pokrój 0,25 grama metalicznego sodu na małe kawałki, aby zwiększyć rozpuszczanie. Dodaj metaliczny sód do roztworu 1,4 grama nafteliny w 20 mililitrach tetrahydrofuranu w zakręcanej szklanej butelce o pojemności 100 mililitrów, wyposażonej w mieszadło magnetyczne pokryte PTFE.

Skromnie podgrzej roztwór, aby jeszcze bardziej zwiększyć rozpuszczanie. Końcowy roztwór ma ciemny, lekko zielonkawy kolor i może być przechowywany w ściśle suchych warunkach. Wykrawać krążki PTFE o średnicy 12 milimetrów z materiału foliowego o grubości 0,5 milimetra.

Zaznacz jedną stronę i wyczyść izopropanol. Próbki PTFE należy inkubować pojedynczo w roztworze aktywującym przez jedną do dwóch minut za pomocą kleszczy. Zmiana koloru z białego na ciemnobrązowy wskazuje na udane leczenie.

Następnie spłucz dwukrotnie THF, a następnie izopropanolem. Próbki poddane działaniu substancji należy utleniać w 30% nadtlenku wodoru, zawierającym 20% kwasu trichlorooctowego przez trzy godziny. Umyć wodą i wysuszyć.

Powierzchnia ma teraz lekko brązowawy wygląd. Potraktuj utlenione dyski 50% HMDI w suchym THF przez dwie godziny. Następnie spłucz THF i pozostaw do wyschnięcia.

Na koniec hydrolizuj próbki zawierające izocyjanian w wodzie przez dwie do trzech godzin i wysusz. Umieść każdy aminowany dysk zaznaczoną stroną do góry w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki. Dodaj 1,5 mililitra roztworu epoksydu, zapewniając pełne pokrycie próbek.

Po inkubacji przez dwie godziny przemyć dwa razy wodą, a raz buforem węglanowym. Na dno poszczególnych studzienek świeżej 24-dołkowej płytki dodaj 50 mikrolitrów 0,5 miligrama na mililitr peptydu i 50-milimolowy bufor węglanowy o pH dziewięć, zawierający 0,1% azydku sodu. Ostrożnie umieść dyski funkcjonalizowane żywicą epoksydową do góry nogami na kroplach roztworu peptydów.

Upewnij się, że przestrzeń między dnem studzienki a krążkiem PTFE jest całkowicie zwilżona z powodu działania kapilarnego. Inkubować płytkę przez co najmniej trzy godziny lub przez noc w mokrej komorze z wilgotną atmosferą, uzyskaną poprzez umieszczenie mokrej bibułki na dnie komory. Po inkubacji przemyć trzykrotnie wodą i sterylizować w 50% wodzie izopropanolowej przez co najmniej 30 minut.

Przed wysiewem komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, próbki należy przepłukać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem. Wyniki kluczowych etapów reakcji chemicznej monitorowano za pomocą spektroskopii w podczerwieni. Początkowa aktywacja naftalamidem sodu generuje wiązania podwójne, a w mniejszym stopniu funkcje hydroksylowe.

Sygnał wskazujący na podwójne wiązania węglowe znika po utlenieniu, dając powierzchnię zawierającą prawie wyłącznie grupy hydroksylowe. Zmiany koloru spowodowane aktywacją i utlenianiem są zgodne z oczekiwaną chemią. Oczekuje się, że sprzężone systemy podwójnych wiązań będą brązowawe, a utrata systemów podwójnych wiązań powoduje rozjaśnienie.

Ponadto zbadano możliwy wpływ aktywacji i utleniania na morfologię powierzchni za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Nie zaobserwowano praktycznie żadnego szkodliwego wpływu leczenia. Unieruchomienie peptydu adheptydowego komórek śródbłonka, argininy, glutaminy, waliny kwasu asparaginowego, na powierzchni polimeru, wspomaga wzrost komórek śródbłonka.

Podczas gdy na materiale niepoddanym działaniu substancji praktycznie nie dochodzi do adhezji i proliferacji komórek, modyfikacja silnie wspiera kolonizację przez okres dwóch tygodni. Na przykładzie zastosowania klinicznego modyfikację przeprowadzono identycznie na oryginalnym materiale z dostępnego na rynku przeszczepu wykonanego z ekspandowanego PTFE, uzyskując podobne wyniki w okresie jednego tygodnia. Po opanowaniu tej techniki zajmuje to około 12 godzin.

Należy pamiętać, że ta procedura jest specyficzna dla PTFE. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak aktywować PTFE na powierzchni i jak unieruchomić peptydy w kolejnych krokach. Po tej procedurze inne cząsteczki, takie jak polisacharydy lub czynniki pępowinowe, mogą zostać unieruchomione w podobny sposób.

Należy pamiętać, że praca z wysoce toksycznymi i chemikaliami jest niebezpieczna i należy podjąć standardowe środki ostrożności.