Name: Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Poznaj metodę chemii mokrej do modyfikacji powierzchni PTFE w celu poprawy biokompatybilności polimerów medycznych. Technika wymaga minimalnego sprzętu i znajduje zastosowanie w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za pomoc Walterowi Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Moguncja, Niemcy.

1. Przygotowanie roztworu aktywującego naftalenowcy sodu i aktywacja powierzchniowa
Uwaga: Przeprowadzaj reakcje w dobrze wentylowanym dygestorium. Postępuj zgodnie z ogólnymi zasadami obchodzenia się z wysoce łatwopalnymi rozpuszczalnikami i metalami, takimi jak sód metaliczny. Naftalen ma bardzo nieprzyjemny zapach (naftalina), nawet w bardzo małych ilościach! Jeśli nie wskazano inaczej, reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Azydek sodu jest wysoce toksyczny! THF (99,9%, patrz Lista materiałów) przechowywano na około 20% (objętościowo) sicie molekularnym. Destyluj THF z zauważalną zawartością wody nad sodem. Tworzenie się naftalenidu sodu nie zachodzi, jeśli obecne są śladowe ilości wody.
<ol>
	<li>Do roztworu 1,4 g (10,9 mmol) naftalenu w 20 ml tetrahydrofuranu (THF, wysuszonego na sicie molekularnym 3 A) dodać 0,25 g (10,9 mmol) metalicznego sodu do zakręcanej szklanej butelki o pojemności 100 ml wyposażonej w mieszadło magnetyczne pokryte PTFE. 
	Uwaga: Rozpuszczanie można znacznie poprawić, krojąc sód na małe kawałki i skromne podgrzewanie (35 - 40 °C). Końcowy roztwór ma ciemny, lekko zielonkawy kolor i może być przechowywany w ściśle suchych warunkach.</li>
	<li>Z materiału foliowego o grubości 0,5 mm należy wykrawać krążki PTFE o średnicy 12 mm. Zaznacz jedną stronę (np. za pomocą stempla do stempla) i wyczyść izopropanolem.</li>
	<li>Próbki PTFE inkubować pojedynczo w roztworze aktywującym (krok 1.1) przez 1-2 minuty za pomocą kleszczy. Uwaga: Zmiana koloru z białego na ciemnobrązowy wskazuje na udane leczenie.</li>
	<li>Następnie spłukać dwukrotnie THF, a następnie izopropanolem. 
	Uwaga: Roztwór naftalenidu jest wyczerpany, gdy jego kolor zmieni się na wodnisty jasnobrązowy. Niewykorzystany roztwór naftalenidu (prawdopodobnie zawierający metaliczny sód) musi zostać rozłożony przez powolne dodawanie izopropanolu przed usunięciem.</li>
	<li>Próbki poddane działaniu substancji należy utlenić w nadtlenku wodoru (30%) zawierającym 20% (w/v) kwasu trichlorooctowego przez 3 godziny. Umyć wodą i wysuszyć. Powierzchnia ma teraz lekko brązowawy wygląd. Uwaga: Aktywacja i utlenianie powodują drastycznie zwiększenie zwilżalności powierzchni. Stwierdzenie to zostało szczegółowo zbadane wcześniej 14.</li>
	<li>Potraktuj utlenione krążki 50% (v/v) diizocyjanianem heksametylenu (HMDI) w suchym THF przez 2 godziny, spłucz THF i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Hydrolizuj próbki zawierające izocyjanian w wodzie przez 2 - 3 godziny i wysusz. Uwaga: Końcowa powierzchnia PTFE funkcjonalizowana aminami jest znacznie bardziej stabilna niż próbki zawierające izocyjanian i jest kompatybilna z wieloma standardowymi środkami sieciującymi w celu dalszego sprzężenia.</li>
</ol>
2. Unieruchomienie peptydów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 20% (v/v) eteru diglicydydylowego (diepsydylu) glikolu dietylenowego w 50 mM buforze węglanowym o pH 9.</li>
	<li>Umieść zaminowane krążki oznaczoną stroną do góry pojedynczo na płytce 24-dołkowej i dodaj 1,5 ml roztworu epoksydu. Zapewnić pełne pokrycie próbek. Inkubować przez 2 godziny i przemyć dwa razy wodą i raz buforem węglanowym.</li>
	<li>Dodać 50 μl peptydu 0,5 mg/ml (np. REDV) w 50 mM buforze węglanowym o pH 9 zawierającym 0,01% NaN3 na dno poszczególnych studzienek świeżej płytki 24-dołkowej i ostrożnie umieścić krążki funkcjonalizowane żywicą epoksydową do góry nogami (tj. oznaczoną stroną do dołu) na kropli roztworu peptydu. Upewnij się, że przestrzeń między dnem studzienki a dyskiem PTFE jest całkowicie zwilżona z powodu działania kapilarnego.</li>
	<li>Inkubować w mokrej komorze (np. w dowolnym zamykanym plastikowym pudełku ze szczelnie zamykającą się pokrywą) w wilgotnej atmosferze (umieszczając mokrą bibułkę na dnie) przez co najmniej 3 godziny lub przez noc. 
	Uwaga: Chociaż motyw REDV może być uważany za dobrze scharakteryzowany, zakodowana lub odwrócona sekwencja aminokwasów może być włączona jako dodatkowa kontrola ujemna.</li>
	<li>Umyć trzykrotnie wodą i sterylizować w 50% izopropanolu/wodzie przez co najmniej 30 minut. Przed wysiewem komórek próbki należy przepłukać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
</ol>
3. Sadzenie komórek
<ol>
	<li>Hodować HUVEC przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowych 17,18.</li>
	<li>Umieść próbki sprzężone z peptydami zmodyfikowaną stroną do góry w 24-dołkowych płytkach. Do kontroli należy używać nieobrobionych krążków PTFE.</li>
	<li>Wysiać 5 x 104 HUVEC w 2 ml pożywki na basenik i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
	<li>Wyjmij krążki, dokładnie spłucz, aby usunąć nieprzyłączone komórki i przenieś na świeżą płytkę 24-dołkową. Dodać 2 ml świeżej pożywki i inkubować przez żądany okres (np. 24 godziny, 1 W itd.). Zmieniaj podłoże co dwa dni.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml Calcein-AM w dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Po wyhodowaniu komórek usunąć pożywkę, przemyć PBS i dodać PBS zawierający 1 μl/ml barwnika Calcein-AM (np. 1 μl roztworu podstawowego na ml PBS). Delikatnie mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut w ciemności.</li>
	<li>Przemyć PBS i natychmiast wykonać mikrofotografie pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w standardowe filtry FITC (Ex 488 nm, Em 515 nm). Użyj 100-krotnego powiększenia. Wykonać potrójne próby zarówno z próbek niezmodyfikowanych, jak i poddanych działaniu substancji.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania ImageJ określ obszar skolonizowany przez komórki. Możesz też policzyć komórki ręcznie lub użyć ImageJ. Obie metody dostarczą podobnych informacji na temat przyczepiania i wzrostu komórek na odpowiednich powierzchniach.</li>
</ol>

<ol><li>Doctor, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+prosthetic+materials+and+newer+meshes+for+hernia+repairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Minim.+Access+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs.</a> J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).</li>
<li>Zaghal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+totally+implantable+venous+access+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Update on totally implantable venous access devices.</a> Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).</li>
<li>Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Biol.+Th%22%5BJournal%5D)">Bioengineered blood vessels.</a> Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).</li>
<li>Wang, M. -J., Tsai, W. -B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+M-J+%22Biomaterials+in+Blood-Contacting+Devices%3A+Complications+and+Solutions%22">Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions</a>. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).</li>
<li>de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalization+of+biomaterials+for+accelerated+in+situ+endothelialization%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review.</a> Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).</li>
<li>Zdrahala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+caliber+vascular+grafts.+Part+I%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomat.+Appl%22%5BJournal%5D)">Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art.</a> J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).</li>
<li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+tissue+engineering%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular tissue engineering: the next generation.</a> Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).</li>
<li>Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+and+other+recognition+sequences+for+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Dev.+Bi%22%5BJournal%5D)">RGD and other recognition sequences for integrins.</a> Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).</li>
<li>Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+immobilization+on+polyethylene+terephthalate+surfaces+to+study+specific+endothelial+cell+adhesion%2C+spreading+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Sci.+Mater.+M%22%5BJournal%5D)">Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration.</a> J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).</li>
<li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+RGD+Modification+of+the+Inner+Pore+Surface+of+Polycaprolactone+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomat.+Sci..+Polym.+E%22%5BJournal%5D)">Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds.</a> J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).</li>
<li>Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adhesion+and+growth+of+vascular+endothelial+cells+on+bioactive+peptide+nanofiber+functionalized+stainless+steel+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface.</a> Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).</li>
<li>Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessel+replacement%3A+50+years+of+development+and+tissue+engineering+paradigms+in+vascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Res.+%2F+Academia+Scientiarum+Bohemoslovaca%22%5BJournal%5D)">Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery.</a> Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).</li>
<li>Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-based+biofunctionalization+of+vascular+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+UK%22%5BJournal%5D)">Plasma-based biofunctionalization of vascular implants.</a> Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).</li>
<li>Mikulikova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+on+photochemically+modified+polytetrafluoroethylene%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene.</a> Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).</li>
<li>Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet-chemical+approach+for+the+cell-adhesive+modification+of+polytetrafluoroethylene%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene.</a> Biomed. Mater. 6, 035007(2011).</li>
<li>Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+grafting+of+RGD-motif-containing+peptide+on+the+surface+of+polycaprolactone+films%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomat.+Sci..+Polym.+E%22%5BJournal%5D)">Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films.</a> J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).</li>
<li>Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+RGD+fluorosurfactant+polymer+modification+of+ePTFE+on+endothelial+cell+adhesion%2C+growth%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function.</a> Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).</li>
<li>Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+LL-37-grafted+titanium+surfaces+with+bactericidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity.</a> Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).</li>
<li>Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Plasma+Polymerized+Thin+Films+and+Attachment+of+Biomolecules+to+Influence+HUVEC-Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Process+Polym%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion.</a> Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczegółowy opis protokołu modyfikacji powierzchni PTFE składa się z następujących po sobie etapów, począwszy od eliminacji fluoru ze szkieletu polimeru, jak pokazano na rysunku 6. W rezultacie powstaje warstwa, która zawiera obfitą ilość sprzężonych podwójnych wiązań węgiel-węgiel zgodnie z ciemnobrązowawym kolorem, który rozwinął się po obróbce naftalenami. Standardowe utlenianie kwaśnym nadtlenkiem wodoru daje hydroksylowaną powierzchnię, której towarzyszy pojaśnienie do bladobrązowego koloru, co odzw...

Różne polimery używane w medycynie, które zostały zatwierdzone od pewnego czasu, nie wykazują zwiększonej biokompatybilności, np. brak adhezji komórek, indukcja zwłóknienia i trombogeniczność, żeby wymienić tylko kilka. Interakcje między biomateriałem a systemem biologicznym zachodzą głównie na powierzchni implantu. W związku z tym badania skupiły się na modyfikacji powierzchni w celu stworzenia odpowiednich właściwości dla pożądanego zastosowania, pozostawiając nienaruszone właściwości materiałowe materiału. Politetrafluoroetylen (PTFE) jako fizjologicznie obojętny polimer jest stosowany w wielu dziedzinach medycyny, takich jak siatka chirurgiczna przepukliny 1, porty medyczne 2 i, co najważniejsze, przeszczepy naczyniowe 3.
Szczególnie w sytuacjach kontaktu z krwią, hydrofobowa natura PTFE powoduje niespecyficzną adsorpcję składników osocza, a w konsekwencji adhezję płytek krwi, co często prowadzi do zdarzeń zakrzepowych i niedrożności przeszczepu 4. Ponadto PTFE, podobnie jak większość polimerów, nie wspomaga adhezji i pokrycia komórkowego, co byłoby pożądaną cechą w celu wywołania tworzenia korzystnej warstwy komórek śródbłonka (EC) na wewnętrznej (świetlnej) powierzchni przeszczepu naczyniowego 5. Oczekuje się, że śródbłonek biomimetyczny będzie spełniał wiele funkcji swojego naturalnego odpowiednika, w szczególności właściwości przeciwzakrzepowe 6. Ogólna strategia modyfikacji biomimetycznej opiera się na koncepcji wyłącznego nadania materiałowi adhezji komórkowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonych właściwości materiałów masowych. Ponadto adhezja płytek krwi może być zmniejszona poprzez włączenie właściwości antyadhezyjnych (przeciwporostowych) 7. Opisano różne peptydy – głównie pochodzące z białek macierzy zewnątrzkomórkowej – które silnie zwiększają adhezję komórek poprzez wiązanie się z receptorami komórkowymi, należącymi do klasy integryn 8. Najbardziej znanym przykładem w tym zakresie jest peptyd Arg-Gly-Asp (RGD), który oddziałuje z większością typów komórek. Inne sekwencje aminokwasów są rozpoznawane przez integryny ulegające ekspresji wyłącznie na określonych komórkach. Na przykład stwierdzono, że Arg-Glu-Asp-Val (REDV) i Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) wiążą się z EC w określony sposób 9. Kowalencyjną immobilizację takich peptydów przeprowadzono na wielu materiałach z natury nieadhezyjnych, w tym metalach i polimerach 10,11.
Porowaty PTFE, a dokładniej ekspandowany PTFE (ePTFE) — wraz z politereftalanem etylenu (PET) - jest najważniejszym materiałem do produkcji przeszczepów naczyniowych 12. Ugruntowane techniki fizyczne dla odpowiednich zabiegów, takich jak modyfikacja plazmą 13 lub metody fotochemiczne 14, są utrudnione ze względu na fakt, że porowate i/lub rurkowe struktury nie są łatwe do uleczenia odpowiednio wewnątrz porów lub światła. Chemia mokra PTFE jest trudnym zadaniem ze względu na wysoce obojętny charakter polimeru zawierającego fluor, który jest odporny na większość ataków chemicznych 15.
W tym artykule opisujemy stosunkowo łatwą metodę dla strategii modyfikacji kowalencyjnej. Na powierzchni materiału stworzono grupy funkcyjne, które służą jako punkty zaczepienia dla dalszej koniugacji biologicznie aktywnych cząsteczek.

<table><tbody><tr><td>Folia PTFE 0,5 mm</td><td>Cadillac Plastic&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>peptyd REDV</td><td>Genecust</td><td>n/a</td><td>niestandardowa synteza >95% czystości</td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran (THF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulftlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>sito molekularne 3 i Aring;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208574</td><td></td></tr><tr><td>sodu metaliczny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483745</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>naftalen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147141</td><td></td></tr><tr><td>nadtlenek wodoru 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>eter diglicydylowy glikolu dietylenowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17741</td><td></td></tr><tr><td>diizocyjanian heksametylenu (HMDI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52650</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56496</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>płytki 24-dołkowe</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr ATR-FTIR Nicolet Magna-IR 850</td><td>&nbsp; Nicolet</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop fluorescencyjny Olympus X-70</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>komórki śródbłonka żyły poskromionej (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ePTFE przeszczep naczyniowy</td><td>Gore</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Nadawanie powierzchni materiałów właściwości adhezyjnych jest powszechną strategią w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Jest to szczególnie interesujące w przypadku już zatwierdzonych polimerów, które mają wieloletnie zastosowanie w medycynie, ponieważ materiały te są dobrze scharakteryzowane i można uniknąć problemów prawnych związanych z wprowadzaniem nowo zsyntetyzowanych polimerów. Politetrafluoroetylen (PTFE) jest jednym z najczęściej stosowanych materiałów do produkcji przeszczepów naczyniowych, ale polimer ten nie ma właściwości sprzyjających adhezji komórek. Endotelializacja, czyli całkowite pokrycie wewnętrznej powierzchni przeszczepów zlewającą się warstwą komórek śródbłonka, jest uważana za klucz do optymalnej wydajności, głównie poprzez zmniejszenie trombogenności sztucznego interfejsu.
To badanie bada wzrost komórek śródbłonka na PTFE modyfikowanym peptydami i porównuje te wyniki z wynikami uzyskanymi na niezmodyfikowanym substracie. Sprzężenie z peptydem adhezyjnym komórek śródbłonka Arg-Glu-Asp-Val (REDV) odbywa się poprzez aktywację polimeru zawierającego fluor za pomocą odczynnika naftalenidu sodu, po którym następują kolejne etapy koniugacji. Hodowla komórkowa odbywa się przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), a doskonały wzrost komórek na materiale immobilizowanym peptydem jest wykazywany przez okres dwóch tygodni.

Przebieg kluczowych etapów reakcji chemicznych monitorowano za pomocą spektroskopii IR (Rysunek 1). Wstępna aktywacja naftalenidem sodu generuje wiązania podwójne oraz — w niewielkim stopniu — grupy funkcyjne OH. Sygnał wskazujący na wiązania C=C znika po utlenianiu, w wyniku czego powstaje powierzchnia zawierająca niemal wyłącznie grupy hydroksylowe. Analiza kolejnych standardowych etapów konjugacji nie została tutaj przedstawiona. Zmiany barwy wynikające z aktywacji i u...

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie obróbki powierzchniowej opartej na chemii mokrej dla polimeru węglowego PTFE, czyli politetrafluoroetylenu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak sposób poprawy biozgodności polimerów medycznych. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że wymaga ona jedynie minimalnego wyposażenia oraz że metoda ta ma szersze zastosowanie w porównaniu z innymi sposobami.Przygotowanie roztworu naftalenidu sodu wymaga ściśle bezwodnych warunków. Podziel 0,25 g sodu metalicznego na małe kawałki, aby przyspieszyć rozpuszczanie. Dodaj sód metaliczny do roztworu 1,4 g naftalenu w 20 ml tetrahydrofuranu w szklanej butelce o pojemności 100 ml z nakrętką, wyposażonej w magnetyczny mieszadło z powłoką PTFE.Roztwór należy lekko podgrzać, aby dodatkowo wspomóc rozpuszczanie. Końcowy roztwór ma ciemny, lekko zielonkawy kolor i może być przechowywany w ściśle suchych warunkach. Z folii o grubości 0,5 mm należy wyciąć krążki z PTFE o średnicy 12 mm.Zaznacz jedną stronę i oczyść ją izopropanolem. Inkubuj poszczególne próbki PTFE w roztworze aktywującym przez jedną do dwóch minut, używając pęsety. Zmiana koloru z białego na ciemnobrązowy wskazuje na prawidłowy przebieg procesu.Następnie wypłukać dwukrotnie THF, a potem izopropanolu. Utlenić potraktowane próbki w 30% nadtlenku wodoru zawierającego 20% kwasu trichloroestowego przez trzy godziny. Przemyć wodą i wysuszyć.Powierzchnia ma teraz lekko brązowy wygląd. Poddaj utlenione dyski działaniu 50% HMDI w suchym THF przez dwie godziny. Następnie opłucz je THF i pozostaw do wyschnięcia.Na koniec poddaj próbki zawierające izocyjanian hydrolizie w wodzie przez dwie do trzech godzin, a następnie wysusz. Umieść każdy aminiowany dysk stroną oznakowaną do góry w poszczególnych studzienkach płytki 24-dołkowej. Dodaj 1,5 ml roztworu epoksydu, zapewniając pełne pokrycie próbek.Po inkubacji przez dwie godziny przemyć dwa razy wodą, a raz buforem węglanowym. Na dno poszczególnych studzienek nowej płytki 24-dołkowej nanieść 50 µL peptydy o stężeniu 0,5 mg/mL w 50 mM buforze węglanowym o pH 9, zawierającym 0,1% azotku sodu. Ostrożnie umieścić dyski funkcjonalizowane epoksydowo stroną aktywną do dołu na kroplach roztworu peptydy.Należy upewnić się, że przestrzeń między dnem dołka a dyskiem PTFE jest całkowicie zwilżona dzięki działaniu kapilarnemu. Inkubować płytkę przez co najmniej trzy godziny lub przez noc w wilgotnej komorze z uwilgotnioną atmosferą, uzyskaną poprzez umieszczenie mokrego ręcznika papierowego na dnie komory. Po inkubacji przemyć trzy razy wodą, a następnie wysterylizować w 50% roztworze izopropanolu w wodzie przez co najmniej 30 minut.Przed wysiewaniem komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, opłucz próbki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Wyniki kluczowych etapów reakcji chemicznej monitorowano za pomocą spektroskopii podczerwieni. Wstępna aktywacja za pomocą naftalamidu sodu generuje wiązania podwójne, a w mniejszym stopniu grupy hydroksylowe.Sygnał wskazujący na podwójne wiązania węgla znika po utlenianiu, w wyniku czego powstaje powierzchnia zawierająca niemal wyłącznie grupy hydroksylowe. Zmiana barwy wywołana aktywacją i utlenianiem jest zgodna z przewidywanymi reakcjami chemicznymi. Oczekuje się, że sprzężone układy wiązań podwójnych będą miały brązowy kolor, a utrata tych układów prowadzi do rozjaśnienia barwy.Dodatkowo, za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej zbadano możliwy wpływ aktywacji i utleniania na morfologię powierzchni. Praktycznie nie zaobserwowano żadnego szkodliwego efektu tej obróbki. Immobilizacja peptydu adhezyjnego komórek śródbłonka – argininy, glutaminy, kwasu aspartylowego i waliny – na powierzchni polimeru wspomaga wzrost komórek śródbłonka.Podczas gdy na niepoddanym obróbce materiale praktycznie nie dochodzi do adhezji i proliferacji komórek, modyfikacja ta silnie wspomaga kolonizację w okresie dwóch tygodni. W ramach przykładu zastosowania klinicznego modyfikację przeprowadzono w ten sam sposób na oryginalnym materiale z dostępnego komercyjnie przeszczepu wykonanego z rozszerzalnego PTFE, uzyskując podobne wyniki w okresie jednego tygodnia. Po opanowaniu techniki, procedura ta zajmuje około 12 godzin.Należy pamiętać, że procedura ta jest specyficzna dla PTFE. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat aktywacji powierzchni PTFE oraz sposobu unieruchamiania peptydów w kolejnych krokach. Zgodnie z tą procedurą, w podobny sposób można unieruchamiać inne cząsteczki, takie jak polisacharydy lub czynniki kordowe.Należy pamiętać, że praca z substancjami silnie toksycznymi i żrącymi jest niebezpieczna i wymaga zachowania standardowych środków ostrożności.

wet-chemistry-peptide-immobilization-on-polytetrafluoroethylene-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Nanoskalowane powierzchnie wysp morskich złożone z termoczułych kopolimerów blokowych zostały wytworzone metodą Langmuira-Schaefera do kontrolowania spontanicznej adhezji i odklejania komórek. Uwidoczniono zarówno przygotowanie powierzchni, jak i adhezję i odklejanie się komórek na powierzchni.

Przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej

Elektroforeza kapilarna bez roztworu jest szybką, tanią i solidną metodą analityczną, która umożliwia ilościowe monitorowanie reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym. Jego przydatność do szybkiej, wygodnej i precyzyjnej analizy została tutaj zademonstrowana poprzez analizę szczepienia peptydów kowalencyjnych na foliach chitozanu w celu poprawy adhezji komórek.

Elektroforeza kapilarna do monitorowania szczepienia peptydów na warstwach chitozanu w czasie rzeczywistym

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Prezentowany tutaj jest protokół dołączania peptydu CD47 (pepCD47) do metalowych stentów za pomocą chemii polibisfosfonianów. Funkcjonalizacja stentów metalowych za pomocą pepCD47 zapobiega przyłączaniu się i aktywacji komórek zapalnych, poprawiając w ten sposób ich biokompatybilność.

Łagodzenie przyczepiania się komórek krwiopochodnych do metalowych implantów poprzez immobilizację peptydów pochodzących z CD47

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Ten protokół opisuje syntezę cyklicznych peptydów penetrujących komórki z aromatycznymi wiązaniami krzyżowymi oraz ocenę ich przepuszczalności przez bariery biologiczne.

Budowa cyklicznych peptydów penetrujących komórki w celu zwiększenia penetracji barier biologicznych

Ten protokół ma na celu ocenę biofunkcjonalnych, samoorganizujących się peptydów pod kątem adhezji komórek, morfologii organoidów i ekspresji genów poprzez barwienie immunologiczne. Wykorzystamy linię komórkową raka jelita grubego, aby zapewnić opłacalny sposób pozyskiwania organoidów do intensywnych testów.

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Poznaj metodę chemii mokrej do modyfikacji powierzchni PTFE w celu poprawy biokompatybilności polimerów medycznych. Technika wymaga minimalnego sprzętu i znajduje zastosowanie w inżynierii tkankowej.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Przeglądaj więcej filmów