Name: Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj metodę włączania niekanonicznych aminokwasów do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli. Technika ta umożliwia badania struktury i funkcji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.G. Worst i A. Ott dziękują za wsparcie finansowe ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach wspólnego centrum badawczego SFB 1027 oraz Uniwersytetu Kraju Saary. E.G. Worst, A. Ott i V. Noireaux dodatkowo dziękują za pomoc finansową ze strony Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). Autorzy dziękują Tobiasowi Baumannowi i Stefanowi Oehmowi (Instytut Chemii, Technische Universität Berlin) za krytyczną lekturę.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono łatwy w użyciu bezkomórkowy system ekspresji jako realną strategię włączania ncAA do białek specyficznych dla reszt. W tym celu surowy ekstrakt jest uzupełniany wektorowym DNA kodującym interesujące nas białko, bufor energetyczny i odpowiednie aminokwasy. Należy zauważyć, że podwielokrotna objętość ekstraktu surowego zależy od stężenia białka ekstraktu surowego34. Wydajność ekspresji bezkomórkowej jest zoptymalizowana w zależności od stężenia konstrukcji DNA wektora. Objętości składników bufora energetycznego zmieniają się w zależności od zoptymalizowanych stężeń glutaminianu Mg i K, aby umożliwić wysoką wydajność białka modelowego eksprymowanego bez ekspresji.
Wstępną ocenę eksperymentu inkorporacji można uzyskać, wykonując SDS-PAGE nieoczyszczonego, bezkomórkowego podłoża reakcyjnego. W celu bardziej szczegółowej analizy proponuje się spektroskopię mas HPLC-ESI jako sposób sprawdzenia pełnego, specyficznego dla reszty włączenia ncAA. Jako przygotowanie do tego ostatniego, stosuje się systemy kolumn wirowych, które umożliwiają oczyszczanie znacznika Hisa i wymianę z małymi objętościami, których używamy w tym protokole.
Łącznie ze spektroskopią mas HPLC-ESI, cały protokół można wykonać w ciągu 2 dni. Nie obejmuje on żadnych szczególnie krytycznych kroków. Jednak optymalizacja stężenia glutaminianu Mg i K, a także DNA wektora ma kluczowe znaczenie dla ekspresji wysokiej wydajności białka modelowego. Zdecydowanie zaleca się stosowanie wysoce wydajnego wektora ekspresyjnego pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. Elucja białek znakowanych Hisem jest zwykle spowodowana wysokim stężeniem imidazolu (> 150 mM) i innych soli, takich jak NaH2PO4 (> 300 mM) lub NaCl (> 50 mM), które generują wysoki szum tła w analizie spektroskopii mas49. Wymiana takich elucyjnych na odpowiedni bufor magazynujący białko stabilizuje białko modelowe i drastycznie redukuje szum tła podczas analizy spektroskopowej mas.
W rezultacie, Can zastępuje Arg we wszystkich sześciu pozycjach w białku modelowym. W systemie ekspresji nie można wykryć reszt Arg. Upraszcza to wprowadzanie analogów Arg specyficznych dla reszt w porównaniu z innymi systemami ekspresji, które wymagają dalszych strategii zubożania29,30. Przedstawione podejście bezkomórkowe omija nieodłączne ograniczenia podejść in vivo, które wynikają z toksyczności Can lub silnej zależności od sekwencji mRNA w strategiach produkcji pojedynczych białek24,31. W przeciwieństwie do stosowanego systemu in vitro, in vivo dochodzi do rozszczepienia puszki do homoseryny i hydroksyguanidyny31.
Jednak system bezkomórkowy zachowuje wystarczającą ilość Lys, aby konkurować z analogami, takimi jak Hyl. Analiza spektroskopii mas HPLC-ESI pokazuje, że białko modelowe zawiera zarówno kanoniczne, jak i niekanoniczne analogi w różnych proporcjach. Inkorporacja Lys specyficzna dla reszty jest ogólnie możliwa, ale w celu pełnej substytucji należy opracować dalsze strategie zubożenia lub specjalnie zaprojektowane aaRS i tRNA zoptymalizowane pod kątem rozpoznawania ncAA.
Osiągnęliśmy doskonałe wyniki w postaci białek modelowych eksprymowanych bez ekspresji komórek, dodając ncAA w tym samym stężeniu, co białka kanoniczne. Skuteczność inkorporacji zależy od charakteru ncAA, który ma być włączony. Jeszcze wyższe plony mogą być nadal możliwe do osiągnięcia poprzez optymalizację stężenia ncAA.
Przedstawione wyniki wskazują na możliwość zastosowania zastosowanego systemu do inkorporacji ncAA specyficznej dla reszt, o ile są one akceptowane przez kanoniczny endogenny system translacyjny. W celu włączenia specyficznych dla reszty specyficznych ncAA należy dodatkowo sprawdzić, czy reszty analogicznego cAA zakłócają układ ekspresji.
Bezkomórkowe systemy transkrypcyjno-translacyjne mogą być projektowane z różnych organizmów, aby reagować na różne wymagania54. Wszystkie mechanizmy transkrypcyjno-translacyjne E. coli przedstawionego tutaj systemu bezkomórkowego umożliwiają wykorzystanie bakteriofagów i promotorów E. coli i mogą działać równolegle lub kolejno w kaskadach55. Ogólna przydatność i użyteczność sprawiają, że metoda ta jest potężnym narzędziem do dalszych badań nad toksycznością aminokwasów i zastosowaniem terapeutycznym.

Kod genetyczny jest uniwersalny dla biosfery. Koduje zestaw 20 kanonicznych aminokwasów, który czasami jest rozszerzany przez selenocysteinę1 lub pirolizynę2. To rybosom tłumaczy kod genetyczny za pomocą tRNA na łańcuchy aminokwasów, które składają się w białka. Grupy funkcyjne aminokwasów kanonicznych, w połączeniu z modyfikacjami potranslacyjnymi, przyczyniają się do wyjątkowo szerokiego zakresu funkcji białek3,4. Zasadniczo, ograniczenia funkcjonalne wynikające z ograniczonego zestawu aminokwasów kanonicznych można przezwyciężyć poprzez włączenie kolejnych, niekanonicznych aminokwasów (ncAA), które umożliwiają nowe związki chemiczne i nowe funkcje3,4.
Istnieją dwa uzupełniające się podejścia do wprowadzania ncAA: inkorporacja specyficzna dla miejsca lub pozostałości. Pierwsza metoda wiąże się ze znacznymi trudnościami technicznymi, ponieważ kanoniczny zestaw syntetaz aminoacylo-tRNA (aaRS) i tRNA musi zostać rozszerzony przez ortogonalną parę aaRS-tRNA, która nie może wchodzić w interakcje z endogenną maszynerią translacyjną. Podejście to, oparte na starannej inżynierii, obejmuje ncAA jako mutacje jednopunktowe w pożądanych miejscach białkowych. Specyficzna dla miejsca inkorporacja ncAA jest genetycznie kodowana przez kodon, który nie jest przypisany do aminokwasu kanonicznego (cAA), zwykle kodonu stop5-9. Metoda ta pociąga za sobą zmiany funkcji w danym miejscu, a nie w całym białku10-13.
Przeciwnie, inkorporacja specyficzna dla reszt polega na błędnym rozpoznaniu niekanonicznego aminokwasu przez kanoniczną maszynerię translacyjną. Inkorporacja następuje z powodu braku specyficzności substratowej aaRS. Specyficzne dla reszt włączenie ncAA, zbudowane na pracy Cohena i współpracowników14, doprowadziło do ważnych zastosowań3,10, w tym bio-ortogonalnego znakowania15-17 białek lub wyjaśnienia struktury białek w krystalografii rentgenowskiej18.
Ponieważ naturalne aaRS zazwyczaj preferują swoje pokrewne aminokwasy od izostrukturalnego ncAA, efektywna inkorporacja specyficzna dla reszt in vivo zwykle wymaga auksotroficznego gospodarza ekspresji, który nie jest zdolny do syntezy kanonicznego analogu ncAA. Komórki gospodarza są hodowane w pożywce wzrostowej, która dostarcza tylko niskie stężenie analogicznego cAA. Jego wyczerpanie w połączeniu z następczą suplementacją ncAA zmusza gospodarza ekspresji do włączenia ncAA do białka modelowego w wielu, kanonicznie przepisanych miejscach. W przeciwieństwie do podejścia site-specific, ma to na ogół głęboki wpływ na całą strukturę białka, prowadząc do znacznych zmian właściwości fizycznych i chemicznych białek19,20. Jednak większość ncAA jest inhibitorami wzrostu gospodarzaekspresji 3, ponieważ są one włączane do wielu innych białek oprócz tych, które są przedmiotem zainteresowania podczas ekspresji genów rekombinowanych. To wyraźnie ogranicza podejście in vivo. Inkorporacja in vivo aminokwasów, które są toksyczne lub mają silny wpływ na strukturę białka, pozostaje szczególnie trudna. Jednak cząsteczki te są jednymi z najbardziej obiecujących w inżynierii białek o niezwykłych funkcjach.
Jednym z przykładów jest toksyczna, niekanoniczna, naturalnie występująca L-kanawanina (Can), analog L-argininy (Arg). Wpływa i blokuje szlaki reakcji regulatorowych i katalitycznych związanych z Arg, a jego obecność w żywej komórce może prowadzić do natychmiastowej śmierci3,21-23. Jego włączenie do białek w pozycjach argininy może zmniejszyć stabilność białka21-23. Ze względu na wynikającą z tego toksyczność, ekspresja białek zawierających kanawaninę w Escherichia coli (E. coli) i innych powszechnych gospodarzach ekspresji pozostaje wyzwaniem. Z tych powodów pełne włączenie in vivo Can we wszystkich pozycjach Arg zostało odpowiednio potwierdzone tylko raz24, przy użyciu opracowanego systemu produkcji pojedynczych białek. Jednak Can został zaproponowany jako środek przeciwnowotworowy25-27 oraz jako stymulator chorób autoimmunologicznych u ludzi28. Dodatkowo jest przedmiotem różnych badań nad jego właściwościami antymetabolicznymi, przeciwbakteryjnymi, przeciwgrzybiczymi i przeciwwirusowymi25. Właściwości te zwiększają zapotrzebowanie na skuteczne i łatwe do wykonania metody ekspresji białek zawierających puszkę do badań farmaceutycznych, medycznych i funkcjonalnych.
Chociaż wiele problemów związanych z produkcją in vivo można obejść za pomocą bezkomórkowych systemów ekspresji, podejścia specyficzne dla pozostałości in vitro zostały słabo zbadane. Odnotowano bezkomórkowe, specyficzne dla reszty włączenie analogu L-tryptofanu29 i wielu ncAA30. Metody te opierają się na wysoce wydajnej polimerazie RNA T7. Polimeraza RNA T7 pociąga za sobą transkrypcję podobną do bakteriofagów, zmniejszając w ten sposób funkcjonalność genetyczną w porównaniu z transkrypcją endogenną.
Ostatnio zgłoszono pełne włączenie Can do białka modelowego we wszystkich pozycjach Arg31, przy użyciu bezkomórkowego systemu ekspresji32. Niewielka modyfikacja tego samego systemu umożliwiła specyficzne dla miejsca włączenie różnych analogów pirolizyny do modelowego białka poprzez supresję kodonu stop33. Zastosowany system bezkomórkowy 31-33 oparty jest na systemie transkrypcji-translacji wszystkich E. coli. Niemniej jednak umożliwia ekspresję białek tak samo wydajnie, jak w obecnych systemach bakteriofagów (0,5 - 1 mg/ml białka rekombinowanego)32, zachowując przy tym wiele z pierwotnej modularności transkrypcji i translacji.
W tej pracy podano szczegółowy protokół, w jaki sposób można zrealizować specyficzne dla pozostałości włączenie ncAA, używając tego systemu całkowicie wolnego od komórek E. coli 32. Ponadto zaproponowano dalsze kroki w celu przygotowania eksprymowanych białek do odpowiedniej oceny za pomocą spektroskopii mas HPLC-ESI. Aby rozszerzyć właściwości tego bezkomórkowego systemu, praca ta nie tylko odnosi się do opublikowanego włączenia Can31, ale także przedstawia nowe dane związane z niekanonicznym analogiem L-lizyny L-hydroksy-lizyny.
Poniższy protokół do specyficznego dla pozostałości włączania ncAA jest adaptacją protokołu opublikowanego niedawno w JoVE34. Ten ostatni protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić wysoce wydajną ekspresję bezkomórkową ze standardowymi aminokwasami. Ponadto przedstawiono przygotowanie surowego ekstraktu bezkomórkowego, roztworu aminokwasów, podstawowego roztworu energetycznego oraz bufora energetycznego stosowanego w tym podejściu. Poniższy protokół koncentruje się na zmodyfikowanych krokach w porównaniu z poprzednim protokołem, aby umożliwić włączenie ncAA specyficznych dla pozostałości. Do przygotowania zaleca się stosowanie kalibrowanych pipet, końcówek do pipet o niskim poziomie wiązania oraz probówek do mikrowirówek. Poniżej używane są skróty IUPAC dla aminokwasów.

<table><tbody><tr><td>Okulary ochronne</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe (rozmiar S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany</td><td>Zjednoczone Z768960</td><td>Numery katalogowe inne rozmiary: Z768979 dla M, Z768987 dla L i Z768995 dla XL</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowaga Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Szwajcaria</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka (dł. 6 5/8 cala, stal nierdzewna, średnica pręta 0,09 cala)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>C9758</td><td>Toksyczność ostra: nosić osłony oczu, maskę przeciwpyłową, rękawice ochronne</td></tr><tr><td>Hydroksylizyna (mieszanina racemiczna)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice kriogeniczne (rozmiar S, wodoodporne)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany</td><td>Zjednoczone Z183490</td><td>Numery katalogowe inne rozmiary: Z183512 dla M, Z183520 dla L i Z183539 dla XL</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Niemcy</td><td>BR1401801</td><td>Aby samodzielnie przygotować roztwory podstawowe aminokwasów, postępuj zgodnie z tym protokołem35 i użyj zestawu aminokwasów stałych LAA21-1KT, L-proliny (81709-25G), L-cysteiny (30089-25G), L-histydyny (53319-25G) i L-lizyny (L5501-5G)&nbsp; (wszystkie z Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Stany</td><td>Zjednoczone 14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Stany Zjednoczone</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Stany Zjednoczone</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (z E. coli, wielkość opakowania 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>10109541001</td><td>Numer katalogowy opakowania 500 mg to 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (z drożdży )</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, USA</td><td>Plazmid #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% prefabrykowane żele Tris-Glycine (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 kursów)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Niemcy</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS bufor do biegania (10 x koncentrat, 5,000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Niemcy</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący SDS (2 x koncentrat, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Niemcy</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Niebarwiony marker białkowy, szeroki zakres (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1060091011</td><td>Działa toksycznie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu: nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Kwas octowy (99,8%)</td><td>VWR International, Darmstadt, Niemcy</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Niemcy</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Protein Miniprep kit</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Niemcy</td><td>P2002</td><td>Produkt dystrybuowany również przez Zymo Research Corporation, Irvine, USA&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, 99%</td><td>VWR International, Darmstadt, Niemcy</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>Mini kolumny wirujące CentriPure Z25</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Niemcy</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator 5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do ubijania koralików (mikrofiolki polipropylenowe)</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki, 0,1&nbsp; mm śr.</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli szczep</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Bradford BSA</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety, 1.5&nbsp; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do chromatografii mikro biospinowej</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Optyczne płyty denne Nunc 384-well</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany</td><td>Zjednoczone 232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, Stany Zjednoczone</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy roztwór</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy roztwór fosforanu potasu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (zestaw)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; L butelka wirówkowa</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; L Kolba Erlenmeyera</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-26XP</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>393127</td><td>Lub równoważna wirówka zdolna do wirowania butelek o pojemności 1 l.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Forma 480</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>480</td><td>Lub równoważna wytrząsarka zdolna do wstrząsania klatką piersiową o wymiarach 6 x 4 L .</td></tr><tr><td>Wirnik JLA-8.1000</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>363688</td><td>Lub równoważny rotor 5,000 x g do wirówki powyżej, zdolny do wirowania butelek o pojemności 1 l.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem Microfuge 22R</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>368831</td><td>Lub równoważna wirówka zdolna do odwirowania 2 ml probówek reakcyjnych.</td></tr><tr><td>Blok grzewczy HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Niemcy</td><td>24465</td><td>Lub równoważny blok grzewczy zdolny do podgrzewania próbek w probówkach reakcyjnych do 100 & stopni C.</td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf MiniSpin</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>5452000018</td><td>Lub równoważna wirówka zdolna do odwirowania 2 ml probówek reakcyjnych.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (średnica wytrząsarki orbitalnej 4 mm, 0 - 2,500 obr./min)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z654760</td><td>Lub równoważny wir.</td></tr><tr><td>Maszyna do płatkowania lodu Scotsman AF103</td><td>K&auml; lte-Berlin, Berlin, Niemcy</td><td>AF103</td><td>Lub równoważna maszyna do płatkowania lodu.</td></tr><tr><td>Mini inkubator cyfrowy MyTemp</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z763314</td><td>Lub równoważny inkubator zdolny do podgrzewania próbek w temperaturze 29 stopni C.</td></tr><tr><td>Komórka / komora do elektroforezy EcoCell</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Niemcy</td><td>AN12005</td><td>Lub równoważna komora do elektroforezy zdolna do wykonywania pionowej elektroforezy żelowej z użyciem powyższych prefabrykatów żelowych lub innych żeli.</td></tr><tr><td>Zasilacz Power-phor do komory / komory elektroforezy</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Niemcy</td><td>AN12001</td><td>Lub równoważny zasilacz zdolny do zasilania powyżej używanego ogniwa / komory do elektroforezy z zasilaniem</td></tr><tr><td>Zestaw startowy ergonomicznych, wysokowydajnych jednokanałowych pipetorów o zmiennej objętości Signature</td> firmy <td>VWR 1 VWR International, Darmstadt, Niemcy</td><td>613-5278</td><td>Lub równoważne mikropipety umożliwiające pipetowanie podobnych objętości z taką samą precyzją</td></tr><tr><td>Signature Ergonomiczne, wysokowydajne jednokanałowe pipety o zmiennej objętości VWR Zestaw startowy 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Niemcy</td><td>613-5279</td><td>Lub równoważne mikropipety umożliwiające pipetowanie podobnych objętości z taką samą precyzją</td></tr><tr><td>Końcówki Pipetman Diamond D10ST (0,1 - 10 &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, Stany</td><td>Zjednoczone F171101</td><td>Lub równoważne końcówki do pipet o niskim poziomie wiązania, umożliwiające pipetowanie podobnych objętości z taką samą precyzją</td></tr><tr><td>Końcówki Pipetman Diamond D200ST (2 - 200 &mikro; l)</td> <td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171301</td><td>Lub równoważne końcówki do pipet o niskim poziomie wiązania umożliwiające pipetowanie podobnych objętości z taką samą precyzją</td></tr><tr><td>Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1,000&nbsp; &mikro; l)</td><td>Gilson, Middleton, Stany Zjednoczone</td><td>F171501</td><td>lub równoważne końcówki do pipet o niskim poziomie wiązania umożliwiające pipetowanie podobnych objętości z taką samą precyzją</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml z nakrętkami (sterylne)</td><td>VWR International, Darmstadt, Niemcy</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml z nakrętkami (sterylne)</td><td>VWR International, Darmstadt, Niemcy</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe 14 ml (okrągłe dno, dwupozycyjny korek odpowietrzający, sterylne)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Discovery BIO Kolumna HPLC C5 o szerokich porach (3 i mikro; m wielkość cząstek, dł. x średnica wewnętrzna 10 cm x 2,1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna Agilent 1260</td><td>HPLC Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G1312B 6500</td><td></td></tr><tr><td>Series Dokładny-masywny kwadrupolowy czas przelotu (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Niemcy</td><td>415-101</td><td>Lub równoważny czytnik mikropłytek zdolny do pomiaru fluorescencji wyrażonego białka modelowego</td></tr><tr><td>pH-metr Hanna Checker</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany Zjednoczone</td><td>Z351091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dodatek eluentu kwasu mrówkowego do LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego escherichia coli

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Kanoniczny zestaw aminokwasów prowadzi do wyjątkowo szerokiego zakresu funkcjonalności białek. Niemniej jednak zestaw reszt nadal nakłada ograniczenia na potencjalne zastosowania białek. Włączenie aminokwasów niekanonicznych może rozszerzyć ten zakres. Istnieją dwa uzupełniające się podejścia do włączania aminokwasów niekanonicznych. W celu włączenia specyficznego dla miejsca, oprócz endogennych kanonicznych mechanizmów translacyjnych, należy zapewnić ortogonalną parę aminoacylo-tRNA-syntetazy-tRNA, która nie oddziałuje z parami kanonicznymi. W związku z tym wymagany jest również kodon, który nie jest przypisany do aminokwasu kanonicznego, zwykle kodonu stop. Ta ekspansja kodu genetycznego umożliwia włączenie niekanonicznego aminokwasu w pojedynczym, określonym miejscu w białku. Prezentowana praca opisuje inkorporację specyficzną dla reszt, w której kod genetyczny jest ponownie przypisywany w endogennym systemie translacyjnym. Maszyneria translacyjna akceptuje niekanoniczny aminokwas jako substytut do włączenia go w kanoniczne określone miejsca, tj. wszystkie wystąpienia kanonicznego aminokwasu w białku są zastępowane przez niekanoniczne. Włączenie aminokwasów niekanonicznych może zmienić strukturę białka, powodując znaczne modyfikacje właściwości fizycznych i chemicznych. Niekanoniczne analogi aminokwasów często działają jako inhibitory wzrostu komórek dla gospodarzy ekspresji, ponieważ modyfikują endogenne białka, ograniczając produkcję białek in vivo. Wprowadzanie in vivo toksycznych niekanonicznych aminokwasów do białek pozostaje szczególnie trudne. W tym artykule przedstawiono bezkomórkowe podejście do całkowitego zastąpienia L-argininy niekanonicznym aminokwasem L-kanawaniną. Pozwala to uniknąć nieodłącznych trudności związanych z ekspresją in vivo. Dodatkowo dołączony jest protokół przygotowania białek docelowych do analizy widma mas. Wykazano, że L-lizynę można zastąpić L-hydroksylizyną, choć z mniejszą skutecznością. W zasadzie każdy niekanoniczny analog aminokwasu może być włączony przy użyciu przedstawionej metody, o ile endogenny system translacji in vitro go rozpoznaje.

Niniejszy protokół opisuje bezkomórkową inkorporację ncAAs w konkretnych pozycjach reszt aminokwasowych w białkach modelowych. Proponuje on zastosowanie SDS-PAGE do wstępnej oceny eksperymentu inkorporacji oraz kolejne kroki w celu przygotowania białek modelowych do odpowiedniej analizy spektroskopowej metodą HPLC-ESI MS.
W niniejszym rozdziale przedstawiono reprezentatywne wyniki bezkomórkowej, specyficznej dla reszt inkorporacji analogu Arg, Can, a także analogu Lys, L-hydroksylizyny (Hyl). Różne roztwory aminokwasów, bufor energetyczny, wektor DNA kodujący białko modelowe oraz reakcje bezkomórkowe przygotowano zgodnie z powyższym opisem. Referencyjna reakcja bezkomórkowa została uzupełniona roztworem aminokwasów składającym się z 20 cAA. Dla każdego eksperymentu przygotowano negatywną kontrolną reakcję bezkomórkową, uzupełnioną roztworem aminokwasów pozbawionym kanonicznego analogu rozważanego ncAA. W każdym podejściu jedna reakcja bezkomórkowa służy do ekspresji białka modelowego w obecności roztworu aminokwasów, w którym cAA zastąpiono analogiem niekanonicznym. Oczyszczanie za pomocą His-tag, wymianę buforu oraz analizę spektrometrią mas HPLC-ESI przeprowadzono zgodnie z opisanym powyżej protokołem.
Białkiem modelowym jest deGFP32 z His-tagiem na C-końcu, będące skróconą wersją EGFP53. Jego sekwencja aminokwasowa w zapisie jednoliterowym znajduje się w (Supplemental Material 2). Białko modelowe zawiera odpowiednio 6 pozycji Arg i 18 pozycji Lys. Wektorem ekspresyjnym jest pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500.
W przypadku pełnej inkorporacji ncAA można założyć, że reakcja kontrolna negatywna nie wykazuje ekspresji deGFP, ponieważ brakuje jednego z 20 cAA. Przeciwnie, deGFP musi być wykrywalne w dwóch pozostałych reakcjach: natywnej w referencyjnej reakcji bezkomórkowej oraz zmodyfikowanego białka w reakcji bezkomórkowej z dodatkiem ncAA.
Rycina 1A przedstawia wstępną ocenę eksperymentu włączania Can metodą SDS-PAGE. Referencyjna reakcja bezkomórkowa wykazuje najwyższy poziom ekspresji deGFP. W reakcji bezkomórkowej z dodatkiem Can deGFP jest wyrażane w nieco niższym stężeniu. W kontroli negatywnej nie stwierdzono ekspresji deGFP. Wynik SDS-PAGE jest dobrym wskaźnikiem pomyślnego włączenia Can do białka docelowego deGFP.
Aby udowodnić postawioną hipotezę o całkowitym wbudowaniu Can do deGFP, obie oczyszczone białka modelowe, przedstawione na Rysunku 1B, poddano analizie za pomocą spektrometrii mas HPLC-ESI. Na Rysunku 1C przedstawiono zdekonwolucyjne widma mas oczyszczonych cząsteczek deGFP. Zdekonwolucyjna masa deGFP wyrażonego w referencyjnej reakcji bezkomórkowej wynosi 26 192,8 Da. W przypadku deGFP wyrażonego w reakcji bezkomórkowej zawierającej Can pojawia się masa 26 202,5 Da. Spodziewane masy dla natywnego deGFP6Arg oraz zmodyfikowanego deGFP6Can, w którym Arg został w pełni zastąpiony przez Can, wynoszą odpowiednio 26 193 Da i 26 204 Da. Różnica masy wynosząca 1,5 Da dla deGFP6Can mieści się w granicach błędu dekonwolucji widma. Tym samym potwierdzono pełne wbudowanie Can do deGFP we wszystkich 6 pozycjach Arg.
Dwa piki o zredukowanej intensywności odpowiadają natywnemu deGFP6Arg oraz zmodyfikowanemu deGFP6Can, które nie osiągnęły dojrzałej formy fluoroforu. Fluorofor jest generowany autokatalitycznie poprzez eliminację cząsteczki H2O, a następnie utlenianie. Jeśli ten proces nie zajdzie, prowadzi to do zwiększenia masy o 20 Da.
<img alt="Wyniki oczyszczania białka; SDS-PAGE, analiza deGFP metodą spektrometrii mas; prążki markerów kDa." src="/files/ftp_upload/54273/54273fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ocena eksperymentu wbudowy Can za pomocą SDS-PAGE oraz spektroskopia mas HPLC-ESI cząsteczek deGFP wyrażonych w systemie bezkomórkowym i oczyszczonych. (A) Wstępna ocena eksperymentu wbudowy Can z wykorzystaniem SDS-PAGE. Od lewej do prawej: standard białkowy, referencyjna reakcja bezkomórkowa, kontrola negatywna oraz reakcja bezkomórkowa z zastosowaniem Can zamiast Arg. (B) SDS-PAGE po oczyszczaniu za pomocą His-tag i wymianie buforu wyrażonych cząsteczek deGFP. Od lewej do prawej: standard białkowy, oczyszczone deGFP z reakcji referencyjnej, oczyszczone deGFP z reakcji zawierającej Can. (C) Potwierdzenie pełnej wbudowy Can metodą spektroskopii mas HPLC-ESI. Przewidywane masy natywnego deGFP oraz zmodyfikowanego deGFP z pełnym zastąpieniem Arg przez Can wynoszą odpowiednio 26 193 Da i 26 204 Da. Każde widmo zostało znormalizowane do najwyższej intensywności (liczba zliczeń). Położenia piku wskazano w Da. W celach wizualizacji ścieżki żelu zostały wyodrębnione z obrazów żelu, połączone, przekonwertowane na format skali szarości, a ich rozmiar został zoptymalizowany, natomiast kontrast i jasność zwiększone. Oryginalne ścieżki żelu przedstawiono w Materiałach Uzupełniających 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina 2A przedstawia wstępną ocenę eksperymentu włączania Hyl za pomocą SDS-PAGE. W reakcji bezkomórkowej z dodatkiem Hyl ekspresjonowane jest deGFP. W przeciwieństwie do pierwszego eksperymentu, w reakcji kontrolnej negatywnej można zaobserwować słabą prążek deGFP. Może to wynikać z obecności reszt Lys w mieszaninach reakcyjnych bezkomórkowych. Umożliwia to słabą ekspresję deGFP w reakcji kontrolnej negatywnej, do której nie dodano ani Lys, ani Hyl.
W celu przeprowadzenia spektrometrii mas HPLC-ESI, cząsteczki deGFP z reakcji bezkomórkowej z dodatkiem Hyl są oczyszczane, a następnie dokonuje się wymiany buforu (Rycina 2B).
<img alt="Elektroforeza żelowa SDS-PAGE, ekspresja białek, porównanie oczyszczania, detekcja deGFP, 66-27 kDa." src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ocena eksperymentu wbudowania Hyl metodą SDS-PAGE. (A) Od lewej do prawej: bezkomórkowa reakcja kontrolna ujemna, bezkomórkowa reakcja zawierająca Hyl oraz standard białkowy. (B) SDS-PAGE po oczyszczaniu z użyciem znacznika His oraz wymianie buforu dla wyekspresowanych cząsteczek deGFP. Od lewej do prawej: oczyszczone deGFP z reakcji zawierającej Hyl oraz standard białkowy. W celach wizualizacyjnych ścieżki żelu zostały wycięte z obrazów żelu, połączone, przekonwertowane na format skali szarości, zoptymalizowane pod względem rozmiaru oraz z poprawionym kontrastem i jasnością. Oryginalne ścieżki żelu przedstawiono w Materiałach Uzupełniających 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek 3 przedstawia zdekonwolucjonowane widmo masowe oczyszczonych cząsteczek deGFP. Rysunek 3A potwierdza hipotezę o obecności reszt Lys w reakcjach bezkomórkowych. Dominujący pik widma odpowiada natywnemu deGFP (oczekiwana masa: 26 193 Da). Ponownie można wykryć cząsteczki deGFP o masie wyższej o 20 Da, w których nie rozwinął się fluorofor. Reszty Lys są preferencyjnie ładowane na tRNALys przez lysylo-tRNA-syntetazę, co prowadzi do wysokiego poziomu ekspresji natywnego deGFP18Lys.
Różnica masy między Hyl a Lys wynosi 16 Da. Ze względu na obecność Hyl, który konkuruje z resztami Lys, powstają wszystkie możliwe gatunki deGFP (deGFP18Hyl, deGFP17Hly+1Lys, …, deGFP16Hyl+2Lys) (Rycina 3B). Należy przyznać, że pik deGFP1Hyl+17Lys nakłada się na pik natywnego deGFP, który nie wytworzył fluoroforu (Rycina 3A), a masa niektórych pików różni się od masy oczekiwanej o więcej niż 2 Da. Różnice te można przypisać wysokiemu poziomowi szumów wynikającemu z niskiej zawartości gatunków deGFP. Niemniej jednak Hyl jest ogólnie włączany przez system bezkomórkowy. Konieczne są dalsze ulepszenia w celu wyeliminowania reszt Lys w reakcjach bezkomórkowych.
<img alt="Analiza danych spektrometrii masowej; wykres stosunku masy do ładunku względem znormalizowanej intensywności (kDa)." src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Spektroskopia masowa HPLC-ESI oczyszczonych cząsteczek deGFP z reakcji bezkomórkowej zawierającej Hyl. (A) Wykryto głównie natywną formę deGFP18Lys (oczekiwane masy: z fluoroforem 26 193 Da, bez dojrzałego fluoroforu 26 213 Da). (B) Powiększenie ujawnia istnienie wszystkich możliwych form deGFP (deGFP18Hyl, deGFP17Hly+1Lys, deGFP16Hyl+2Lys, …, deGFP1Hyl+17Lys). Ich oczekiwane masy wynoszą 26 193 Da + N x 16 Da (N = 1, …, 18). Widmo zostało znormalizowane do najwyższej intensywności (liczba zliczeń). Położenia pików podano w Da. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przygotowania ekstraktu surowego i reakcji bezkomórkowej wraz z tabelą składu buforu energetycznego." src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1">
Materiał uzupełniający 1. Szablon obliczeń. W sekcji 2 przygotowanie master mixu buforu energetycznego przedstawiono na przykładzie alikwotów ekstraktu surowego o objętości 30 µl oraz optymalnych stężeń Mg i glutaminianu K wynoszących odpowiednio 3 mM i 30 mM. Przykład ten prowadzi do uzyskania objętości master mixu wystarczającej na 3 alikwoty buforu energetycznego. W sekcji 3 przygotowanie reakcji bezkomórkowej przedstawiono na przykładzie roztworu zapasowego DNA o stężeniu 90 nM, co prowadzi do uzyskania optymalnego stężenia wektorowego DNA wynoszącego 10 nM w reakcji bezkomórkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
W celu zapewnienia odpowiedniej identyfikowalności, zastosowanie szablonu obliczeń zilustrowano poprzez wprowadzenie następujących typowych wartości, które różnią się od powyższego przykładu: objętość ekstraktu surowego: 28 µl, optymalne stężenie Mg-glutaminianu: 2 mM, optymalne stężenie K-glutaminianu: 40 mM, liczba pożądanych alikwotów buforu: 100, optymalne stężenie wektora w reakcji bezkomórkowej: 8 nM, stężenie roztworu zapasu wektora DNA: 150 nM.
Najpierw wprowadź 28 µl jako objętość ekstraktu surowego w pomarańczowym polu pierwszej sekcji szablonu. Następnie, w drugiej sekcji szablonu, wprowadź 2 mM i 40 mM jako optymalne stężenia glutaminianu Mg i K w pomarańczowych polach. Biorąc pod uwagę optymalne stężenia Mg i K, obliczana jest składnia 15 µl buforu energetycznego, a także odpowiadająca mu, przeskalowana alikwota 16 µl. Poniżej wprowadź odpowiednio 100 jako pożądaną liczbę alikwotów buforu energetycznego (16 µl). Szablon dostosowuje objętości różnych składników buforu dla 1 700 µl master mixu w następujący sposób: 204 µl roztworu stokowego 100 mM glutaminianu Mg, 136 µl roztworu stokowego 3 M glutaminianu K, 728,73 µl 14x roztworu energetycznego, 510 µl 40% PEG-8000 oraz 121,27 µl sterylnej ddH2O. Na koniec, w trzeciej sekcji szablonu, wprowadź 8 nM i 150 nM jako optymalne stężenie wektora w reakcji bezkomórkowej oraz odpowiednio stężenie roztworu stokowego DNA wektora. Szablon dostosowuje objętości różnych komponentów, które należy dodać do 28 µl ekstraktu surowego, aby ukończyć przygotowanie 90 µl reakcji bezkomórkowej, w następujący sposób: 15 µl buforu energetycznego, 15 µl jednego z 3 roztworów aminokwasów o różnym składzie, 4,80 µl roztworu DNA wektora (150 nM) oraz 27,20 µl sterylnej ddH2O.
<img alt="Schemat dopasowania sekwencji białek z zakodowanymi kolorami aminokwasów do analizy porównawczej." src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Materiał uzupełniający 2. Jednoliterowa sekwencja aminokwasowa białka modelowego deGFP. To białko modelowe zawiera 6 pozycji Arg i 18 pozycji Lys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy białek; prążki żelowe przy markerach kDa; analiza masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Materiał uzupełniający 3. Pełne i niemodyfikowane ścieżki żelu odpowiadające zdjęciom żeli przedstawionym na rysunkach 1 i 2. Ścieżki żelu przedstawione na poszczególnych podrysunkach zostały wycięte z tego samego żelu poliakryloamidowego SDS. Na rysunku 1 i 2 ścieżki te zostały połączone w celach prezentacyjnych. Masy cząsteczkowe prążków standardu białkowego są zaznaczone obok rysunków. (A.1) Nieprzycięte ścieżki żelu z rysunku 1A. Od lewej do prawej: standard białkowy, referencyjna reakcja bezkomórkowa, kontrola negatywna i reakcja bezkomórkowa dostarczająca Can zamiast Arg. (A.2) Nieprzycięte ścieżki żelu z rysunku 1B. Od lewej do prawej: standard białkowy, oczyszczone deGFP z reakcji referencyjnej, oczyszczone deGFP z reakcji zawierającej Can. (B.1) Nieprzycięte ścieżki żelu z rysunku 2A. Od lewej do prawej: kontrolna negatywna reakcja bezkomórkowa, reakcja bezkomórkowa zawierająca Hyl oraz standard białkowy. (B.2) Nieprzycięte ścieżki żelu z rysunku 2B. Od lewej do prawej: oczyszczone deGFP z reakcji zawierającej Hyl oraz standard białkowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest specyficzne względem reszt wbudowanie analogów niekanonicznych aminokwasów do białek modelowych z wykorzystaniem systemu ekspresji bezkomórkowej oraz przeprowadzenie analizy końcowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach medycyny, farmacji i biologii strukturalnej, takie jak rola niekanonicznych aminokwasów w strukturze białek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wbudowania toksycznych aminokwasów do białek modelowych w warunkach bez udziału żywego gospodarza. Aby rozpocząć eksperyment, należy przygotować w temperaturze pokojowej pełne roztwory stokowe 20 aminokwasów kanonicznych (CAA) oraz wcześniej przygotowany roztwór stokowy niekanonicznego aminokwasu (ncAA). Po rozmrożeniu roztworów należy je często wierzchołkować (vortex), aby rozpuścić wytrącone aminokwasy, a następnie umieścić je na lodzie. Następnie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml należy przenieść 1,4 ml sterylnej wody dwukrotnie destylowanej i umieścić ją na lodzie. Należy dodać po 175 µL każdego roztworu stokowego aminokwasów, jeden po drugim, dokładnie wierzchołkując probówkę po każdym dodaniu i ponownie umieszczając roztwór na lodzie. Po dodaniu wszystkich aminokwasów probówkę należy dokładnie wierzchołkować. Probówkę inkubuje się do momentu, aż roztwór stanie się możliwie jak najklarowniejszy. Roztwór mieszaniny głównej (master mix) aminokwasów należy podzielić na trzy równe objętości po 1,35 ml do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i przechowywać je na lodzie. Do pierwszej porcji należy dodać 50 µL roztworu stokowego 168 mM CAA, który jest analogiem ncAA, aby przygotować roztwór aminokwasów zawierający wszystkie 20 CAA. Roztwór należy dokładnie wierzchołkować, a następnie ponownie umieścić probówkę na lodzie. Roztwór należy podzielić na aliquoty w probówkach reakcyjnych i oznaczyć je jako plus CAA. Alikwoty należy zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Następnie do drugiej porcji mieszaniny głównej aminokwasów należy dodać 50 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej, aby przygotować mieszaninę zawierającą 19 CAA; roztwór należy dokładnie wierzchołkować, a następnie umieścić na lodzie. Roztwór należy podzielić na alikwoty i oznaczyć probówki jako minus CAA. Na koniec do ostatnich 1,35 ml należy dodać 50 µL roztworu stokowego 168 mM ncAA, aby przygotować mieszaninę zawierającą 19 CAA oraz ncAA. Mieszaninę należy dokładnie wierzchołkować i ponownie umieścić na lodzie. Probówki należy podzielić na alikwoty, oznaczyć i zamrozić. Na lodzie należy rozmrozić trzy alikwoty po 30 µL ekstraktu surowego (jeden plus CAA, jeden minus CAA i jeden ncAA), trzy alikwoty buforu energetycznego oraz roztwór DNA wektora. Sterylną wodę dwukrotnie destylowaną należy umieścić na lodzie. Następnie dodaje się 15 µL buforu energetycznego, pipetując go w górę i w dół, a następnie delikatnie wierzchołkując roztwór w celu wymieszania. Do 30 µL ekstraktu surowego dodaje się 15 µL alikwotu roztworu aminokwasów plus CAA, 10 µL roztworu DNA wektora o stężeniu 90 nM oraz 20 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej. Kontrolę negatywną przygotowuje się poprzez dodanie do 30 µL ekstraktu surowego 15 µL buforu energetycznego, 15 µL minus CAA, 10 µL roztworu DNA wektora o stężeniu 90 nM oraz 20 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej. Reakcję z ncAA przeprowadza się, łącząc 15 µL buforu energetycznego, 15 µL plus ncAA, 10 µL roztworu DNA wektora o stężeniu 90 nM oraz 20 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej z 30 µL ekstraktu surowego. Następnie wszystkie probówki należy inkubować. Na 10 minut przed przeprowadzeniem SDS-PAGE, 1 µL każdej z lepkich reakcji bezkomórkowych należy rozcieńczyć w 4 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej w probówkach reakcyjnych. Należy dokładnie wierzchołkować, a następnie krótko wirować ciecze w miniwirówce. Do 5 µL rozcieńczonej reakcji bezkomórkowej dodaje się 5 µL buforu do nakładania 2X. Należy dokładnie wierzchołkować i wirować ciecze w miniwirówce. Probówki reakcyjne należy umieścić w bloku grzewczym, upewniając się, że nakrętki są prawidłowo zamknięte. W tym czasie bufor do elektroforezy należy przelać do komory elektroforetycznej. Po podgrzaniu ciecz należy odwirować w miniwirówce. Po wirowaniu probówki należy krótko wierzchołkować i powtórzyć wirowanie. Do studzienek należy nanieść 15 µL standardu białkowego i po 10 µL każdej próbki, a następnie rozpocząć elektroforezę. Żel należy ostrożnie wyjąć z kasety i utrwalić przez 30 minut. Następnie żel przenosi się do roztworu barwiącego na 60 minut. Po barwieniu żel przenosi się do roztworu odbarwiającego na 60 do 120 minut. Należy zmieszać równe objętości buforu wiążącego His i reakcji bezkomórkowej, pipetując mieszaninę w górę i w dół. Następnie probówkę należy delikatnie wierzchołkować. Następnie należy złożyć system kolumnowy. Roztwór stokowy żelu powinowactwa do His należy dokładnie wierzchołkować, aż żywica żelowa zostanie całkowicie rozpuszczona. Używając końcówki do pipety 1 ml, należy przenieść 250 µL żywicy żelowej do kolumny. Kolumnę wiruje się przez 5 do 10 sekund przy 13 000–15 000 ×g. Należy upewnić się, że żywica żelowa została całkowicie odciśnięta, a następnie przenieść od 150 do 300 µL mieszaniny reakcji bezkomórkowej z buforem wiążącym His do kolumny. Kolumnę należy odwirować. Przesącz należy odrzucić, a kolumnę umieścić z powrotem w probówce zbiorczej. Dodaje się 250 µL buforu płuczącego His, a następnie opukiwać i delikatnie wierzchołkować kolumnę, aby resuspenderować żywicę żelową. Probówkę z kolumną należy odwirować. Probówkę zbiorczą należy odrzucić i umieścić kolumnę w nowej standardowej probówce reakcyjnej 1,5 ml. Dodaje się 150 µL buforu elucyjnego i resuspenderuje żywicę żelową poprzez opukiwanie i delikatne wierzchołkowanie. Następnie kolumnę odwiruje się, aby rozcieńczyć oczyszczone białko w buforze elucyjnym. Najpierw należy zdjąć dolną zatyczkę z kolumny do wirowania do filtracji żelowej, a następnie zdjąć górną zatyczkę. Kolumnę umieszcza się w probówce do płukania 2 ml i wiruje, aby usunąć bufor do przechowywania żelu. Przesącz należy odrzucić, następnie dodać do 400 µL buforu do przechowywania białka i odwirować kolumnę. Krok ten należy powtórzyć raz, tak aby cały bufor do przechowywania białka został załadowany do żelu. Kolumnę umieszcza się w świeżej probówce zbiorczej i ostrożnie dodaje do 100 µL roztworu oczyszczonego białka modelowego bezpośrednio na środek złoża żelowego. Kolumnę należy odwirować. Po wymianie buforu całe 100 µL roztworu białka modelowego należy przenieść do otwartej probówki i umieścić w wirującym koncentratorze próżniowym. Należy zamknąć pokrywę koncentratora i rozpocząć rotację w temperaturze 30 °C. Ten obraz SDS-PAGE pokazuje pomyślne wbudowanie L-kanawaniny (Can) do białka docelowego deGFP; referencyjna reakcja bezkomórkowa wykazuje najwyższy poziom ekspresji deGFP. Reakcja z Can daje nieco niższą koncentrację deGFP, natomiast w kontroli negatywnej nie wykryto ekspresji deGFP. Analizę SDS-PAGE przeprowadzono po oczyszczaniu za pomocą znacznika His i wymianie buforu cząsteczek wyekspresowanego deGFP. HPLC

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Tutaj prezentujemy metodę ekspresji acetylowanych białek histonowych za pomocą ekspansji kodu genetycznego i składania odtworzonych nukleosomów in vitro.

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Ten protokół opisuje metodę odwróconej emulsji używaną do hermetyzacji systemu ekspresji bezkomórkowej (CFE) w gigantycznym pęcherzyku jednowarstwowym (GUV) w celu zbadania syntezy i włączenia modelowego białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej.

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę włączania niekanonicznych aminokwasów do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli. Technika ta umożliwia badania struktury i funkcji białek.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów