Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie komórek macierzystych trofoblastu indukowanych przez bonafide lub iTSC z mysich fibroblastów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych dotyczące natury bariery oddzielającej linię embrionalną od pozaembrionalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że ekspresja transgeniczna jest aktywowana tylko przejściowo, co ułatwia selekcję stabilnie przekształconych komórek.

W laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, przykryj pięć 100-mililitrowych naczyń pięcioma mililitrami roztworu poli-L-lizyny, delikatnie kołysząc płytkami, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie odessaj poli-L-lizynę i opłucz naczynia jeden raz PBS. Następnie umieść siedem razy od 10 do szóstych 293 limfocytów T na misce w 10 mililitrach pożywki z 293 limfocytów T, zakręć szalkami, aby równomiernie rozprowadzić komórki i włóż szalki z powrotem do inkubatora.

Następnego ranka zastąp pożywkę wzrostową pięcioma mililitrami pożywki do transfekcji. Następnie potraktuj kultury sześcioma mikrolitrami 1000-krotnego roztworu chlorochiny i umieść płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną, dla każdego wektora lentiwirusowego dodaj 600 mikrolitrów roztworu DNA lentiwektora do 600 mikrolitrów 2X buforowanej soli fizjologicznej HEPES podczas wirowania i inkubuj mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej.

Po 15 minutach bardzo ostrożnie dodaj mieszaninę kroplami do przygotowanych 293 limfocytów T i włóż szalki z powrotem do inkubatora. Po pięciu do sześciu godzinach zastąp pożywkę 10 mililitrami pożywki do produkcji wirusa i umieść płytki z powrotem w inkubatorze. Następnego ranka ostrożnie zastąp pożywkę siedmiomililitrową świeżą pożywką do produkcji wirusa do kolejnej nocnej inkubacji.

Następnie przenieś pożywkę z każdej płytki do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek i dodaj siedem mililitrów świeżej pożywki do produkcji wirusa na płytki w celu kolejnej nocnej inkubacji. Następnego ranka należy zebrać drugą partię pożywki zawierającej wirusa, łącząc supernatant z pierwszą partią wirusa i przecedzić pożywkę zawierającą wirusa przez filtr membranowy z octanu celulozy o wielkości 0,45 mikrona w celu przechowywania w 500 mikrolitrach Porcje w temperaturze minus 80. Aby przekształcić fibroblasty w indukowane komórki macierzyste trofoblastu, należy dwukrotnie przemyć transdukowane masowe fibroblasty embrionalne lub MEF dwoma mililitrami PBS.

Następnie odłącz komórki za pomocą 0,5 mililitra roztworu trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech do czterech minutach upewnij się, że komórki podniosły się z płytki pod odwróconym mikroskopem, a następnie aktywuj trypsynę jednym mililitrem pożywki TS. Przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj komórki.

Następnie ponownie zawiesić granulki w dwóch mililitrach pożywki TS i płytkę dwa razy po 10 do piątego czteroczynnikowego mCherry lub kontrolować niewydukowane MEF na 100-mililitrową szalkę w 10 mililitrach pożywki TS zawierającej czynnik wzrostu fibroblastów cztery i heparynę uzupełnioną doksycykliną do hodowli przez noc. Następnego dnia, pod mikroskopem epifluorescencyjnym, użyj ekspresji białka mCherry, aby oszacować wydajność transdukcji. Jeśli wydajność transdukcji wynosi około 100%, należy zwrócić kultury do inkubatora, zmieniając podłoże we wszystkich naczyniach co drugi dzień aż do 10 dnia.

Następnie nakarm komórki świeżą pożywką TS zawierającą czynnik wzrostu fibroblastów cztery i heparynę bez doksycykliny za pomocą odwróconego mikroskopu, aby monitorować pojawienie się transzróżnicowanych obszarów na szalce z czterema czynnikami przez okres do trzech tygodni. Identyfikacja obszarów transzróżnicowanych ma kluczowe znaczenie, ponieważ w tym momencie MEF-y nie przypominają morfologicznie komórek macierzystych trofoblastu. Szukaj gęsto spiętrzonych kolonii przylegających do gigantycznych komórek trofoblastu, które można zidentyfikować na podstawie wielkości komórki i dużego jądra.

Aby wyizolować poszczególne linie iTSC, najpierw przetrzyj odwrócony mikroskop 70% etanolem, aby zminimalizować ryzyko skażenia bakteryjnego. Następnie dodaj 40 mikrolitrów 05% trypsyny EDTA do 12 dołków dolnej płytki o średnicy 96 U i umieść płytkę na lodzie. Teraz odessaj pożywkę z naczynia transdyferencjacyjnego MEF czterech czynników i umyj komórki jednorazowo 10 mililitrami PBS.

Po umyciu dodaj 10 mililitrów świeżego PBS do komórek i umieść płytkę na odwróconym stoliku mikroskopu. Używając pipety o pojemności 100 mikrolitrów ustawionej na 40 mikrolitrów, okrąż każdą pojedynczą kolonię końcówką pipety i odessaj powstałą pływającą kolonię. Przenieś każdą kolonię do indywidualnych dołków na 96-dołkowej płytce, aż zostanie wybranych 12 kolonii.

Następnie inkubuj kolonie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Pod koniec inkubacji rozdzielić komórki za pomocą pipetowania i przenieść zawiesiny komórek do indywidualnych studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów kompletnego TS plus czynnik wzrostu fibroblastów i pożywkę heparynową do hodowli przez noc. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę świeżą, kompletną pożywką TS plus czynnikiem wzrostu fibroblastów i pożywką z heparyną w celu usunięcia martwych komórek i zwrócenia płytki do inkubatora.

Codzienne monitorowanie kultur pod kątem pojawienia się kolonii nabłonkowych z jasnymi granicami. Po zaobserwowaniu kolonii hoduj komórki przez okres do jednego tygodnia lub do momentu, gdy zlewają się w 70%. W hodowlach, w których aktywowana jest ekspresja transgenu czterech czynników, komórki szybko zmieniają morfologię.

Około 14 do 21 dnia pojawiają się wyraźne obszary transzróżnicowane. Te pierwotne kolonie nie mają typowej morfologii komórek macierzystych trofoblastu, jednak po ich subhodowli obserwuje się charakterystyczną morfologię nabłonka z ciasnymi krawędziami i jasnymi granicami, bardzo przypominającą prawdziwe komórki macierzyste trofoblastu. Gdy komórki macierzyste trofoblastu indukowane przez cztery czynniki pozostają dodatnie dla czynnika transkrypcyjnego trofoblastu, Cdx2 i Tfap2c, idea tych linii może być wykorzystana do kolejnych analiz in vitro lub InVivo.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak iniekcja wspomagana strumieniem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące potencjału chimeryzacyjnego generowanych iTSC. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się tą dziedziną lub wczesną segregacją linii do zbadania konwersji losu komórek embrionalnych i pozaembrionalnych u myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak bezpośrednio przekształcić nowe fibroblasty embrionalne w indukowane komórki macierzyste trofoblastu. Nie zapominaj, że praca z wektorami lentiwirusowymi może być niezwykle niebezpieczna i że zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie dwóch odpowiednich procedur roboczych na poziomie bezpieczeństwa biologicznego.