Name: Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu przy użyciu przejściowej ekspresji czynników transkrypcyjnych. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów różnicowania linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim prawem ochrony zwierząt i za zgodą lokalnych komitetów ds. opieki nad zwierzętami (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nadrenia Północna-Westfalia [numer identyfikacyjny zezwolenia: AZ 84-02.04.2013.A428]).
1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę 293T: Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 10% (v/v) FBS, L-glutamina (2 mM), pirogronian sodu (1 mM), penicylina/streptomycyna (1x).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę MEF: DMEM, 10% (v/v) FBS, L-glutamina (2 mM), 1x aminokwasy endogenne, penicylina/streptomycyna (1x).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę TS (bez FGF4/heparyny): Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 20% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), penicylina/streptomycyna (1x), L-glutamina (2 mM), pirogronian sodu (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę TS z FGF4/heparyną (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), penicylina/streptomycyna (1x), L-glutamina (2 mM), pirogronian sodu (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM), 25 ng/ml FGF4, 1 μg/ml heparyny. 
	Uwaga: FGF4 i heparyna są dodawane bezpośrednio do pożywki bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować TS-CM z FGF4/heparyną (TS-CM + F4H): 70% pożywki TS kondycjonowanej MEF + 30% świeżo przygotowanej pożywki TS + 25 ng/ml FGF4, 1 μg/ml heparyny. 
	Uwaga: FGF4 i heparyna są dodawane bezpośrednio do pożywki bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przygotowanie pożywki transfekcyjnej: Zaawansowany DMEM, 2% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), L-glutamina (2 mM), penicylina/streptomycyna (1x).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do produkcji wirusa: Zaawansowany DMEM, 5% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), L-glutamina (2 mM), penicylina/streptomycyna (1x).</li>
</ol>
2. Wyprowadzenie mysich fibroblastów embrionalnych
<ol>
	<li>Ustaw krycie w czasie przy użyciu samic wt 129S2SV i homozygotycznego samca myszy R26::rtTA (nazwa szczepu; Klasa B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7). Na E13.5 należy poświęcić myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i wyizolować pierwotne mysie fibroblasty zarodkowe (MEF) zgodnie ze standardowymi protokołami8. Następnie płytki komórek z jednego zarodka na szalce o średnicy 150 mm w pożywce MEF.</li>
	<li>Gdy pierwotne kultury MEF osiągną zbieżność na szalkach o średnicy 150 mm, umyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS i dodaj 4 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA. Inkubować naczynia przez 3 - 4 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji sprawdź, czy komórki oderwały się od naczynia za pomocą odwróconego mikroskopu (przy użyciu soczewki 10X). Dodać 5 ml pożywki MEF, aby zatrzymać trypsynizację i zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zbierz zawiesinę komórek z kilku naczyń i zbierz do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zawiesinę komórek wirować przez 3 minuty w temperaturze 200 x g i temperaturze 10 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w FBS zawierającym 10% (v/v) dimetylosulfotlenku. Zamroź MEF-y w podwielokrotnościach do dalszego wykorzystania. 
	Uwaga: Alternatywnie użyj podstawowych MEF-ów typu dzikiego; jednak dodatkowy wektor lentiwirusowy wyrażający rtTA musi być transdukowany razem z innymi wektorami lentiwirusowymi (na przykład przy użyciu plazmidu FUdeltaGW-rtTA opisanego przez Maherali i wsp. 9).</li>
	<li>Przygotowanie kondycjonowanego MEF TS pożywki 
	Uwaga: Przed eksperymentami konwersji należy przygotować pożywkę TS kondycjonowaną MEF (CM), która jest wymagana do subhodowli poszczególnych linii iTSC (opisanych w sekcji 6).
	<ol>
		<li>Talerz 1 x 107 mitotycznie inaktywowanych MEFów na 150 mm szalka w pożywce MEF na żądanej liczbie szalek. Dezaktywować MEF przez napromieniowanie γ dawką 9 Gy. 
		Uwaga: Wydajność z naczynia 150 mm wynosi około 60 ml CM.</li>
		<li>Następnego dnia po posianiu odessać i odrzucić pożywkę MEF oraz dodać 20 ml świeżo przygotowanej pożywki TS (bez FGF4/heparyny) do każdej szalki z mitotycznie inaktywowanymi MEF i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po inkubacji pożywki TS przez trzy dni na mitotycznych inaktywowanych MEF-ach, zebrać pożywkę w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przefiltrować medium przez filtr 0,2 μm i postępować zgodnie z ppkt 2.6.4. Zastąp CM 20 ml świeżej pożywki TS w celu przygotowania kolejnej partii CM. 
		Uwaga: Mitotycznie inaktywowane MEF-y mogą być używane do przygotowania CM do trzech razy.</li>
		<li>Porcję 35 ml przefiltrowanego CM rozlać do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Po rozmrożeniu dodać 15 ml świeżo przygotowanej pożywki TS w celu uzyskania 70% TS-CM i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Produkcja wektorów lentiwirusowych w komórkach 293T
Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w przestrzeni laboratoryjnej z licencją na poziom bezpieczeństwa biologicznego 2.
<ol>
	<li>Przed eksperymentami konwersji należy przygotować wektory lentiwirusowe dla zależnej od doksycykliny (dox) nadekspresji Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 i mCherry. Dla każdego lentiwirusa należy kotransfekować komórki 293T przy użyciu odpowiedniego wektora przenoszącego lentiwirusa wraz z plazmidem pakującym i plazmidem otoczki eksprymującej VSV-G (informacje o plazmidzie znajdują się w tabeli materiałów). 
	Uwaga: Aby uzyskać przydatne informacje na temat produkcji wirusów, zapoznaj się z Gavrilescu et al.10. Chociaż opisuje produkcję retrowirusa, ogólne uwagi dotyczące jakości komórek 293T i plazmidowego DNA są również prawdziwe w przypadku produkcji lentiwirusa. 
	UWAGA: Podczas pracy z wektorami lentiwirusowymi należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa, a praca musi być wykonywana w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Pokryj pięć szalek o średnicy 100 mm roztworem poli-L-lizyny (100 μg/ml), przykrywając szalki 5 ml roztworu i delikatnie kołysząc, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający. Umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Po 30 minutach odessać roztwór powlekający i raz spłukać naczynia PBS.</li>
	<li>Płytka: 7 x 106 komórek 293T na szalkę w 10 ml pożywki z komórek 293T, obracać szalki, aby równomiernie rozprowadzić komórki i umieszczać szalki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego ranka zastąp pożywkę wzrostową 5 ml pożywki do transfekcji. Dodać 6 μl 1000-krotnego roztworu chlorochiny (25 mM) i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj mieszaninę transfekcyjną:
	<ol>
		<li>Dla każdego wektora lentiwirusowego należy przygotować dwie probówki reakcyjne o pojemności 5 ml, oznaczone jako A i B.</li>
		<li>Dodać 600 μl 2x buforowanej soli fizjologicznej HEPES (HBS) do probówki A.</li>
		<li>W probówce B wymieszać 61,5 μl roztworu CaCl2 (2 M) z 18,5 μg DNA lentiwektora i 9,25 μg psPAX2 i 9,25 μg pMD2.G. Dostosować objętość do 600 μl za pomocą sterylnej kultury klasyH2O.</li>
		<li>Dodaj roztwór z probówki B kroplami do probówki A podczas wirowania. Inkubować mieszaninę transfekcyjną przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać mieszaninę transfekcyjną bardzo ostrożnie kroplami do przygotowanych komórek 293T na szalce 100 mm. Po 5 do 6 godzinach usuń pożywkę i zastąp ją 10 ml pożywki do produkcji wirusa. Włożyć naczynia z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania i wymiany pożywki, ponieważ ogniwa 293T łatwo odłączają się od naczynia. Zmiana podłoża 5-6 godzin po transfekcji ma kluczowe znaczenie, ponieważ długotrwała ekspozycja na chlorochinę jest toksyczna dla komórek.</li>
	<li>Następnego ranka ostrożnie usunąć i wyrzucić pożywkę, a następnie zastąpić ją 7 ml pożywki do produkcji wirusa.</li>
	<li>Następnego ranka należy zebrać pierwszą partię pożywki zawierającej wirusa. Odessać pożywkę i zebrać w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Ponownie dodaj 7 ml pożywki do produkcji wirusa na komórki. Pożywkę zawierającą wirusa należy przechowywać w lodówce do czasu zebrania drugiej partii następnego dnia.</li>
	<li>Następnego ranka należy odessać drugą partię pożywki zawierającej wirusa, dodając ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej pierwszą partię. Komórki 293T można teraz wyrzucić. Przefiltrować pożywkę zawierającą wirusa przez filtr membranowy z octanu celulozy 0,45 μm bez środków powierzchniowo czynnych. Przefiltrowaną pożywkę zawierającą wirusy i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania. 
	Uwaga: Produkcja wirusa może być również prowadzona w naczyniach 6-dołkowych. Odpowiednio zmniejsz woluminy i numery komórek.</li>
</ol>
4. Transdukcja fibroblastów z 4 czynnikami i wektorem kontrolnym mCherry
Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
<ol>
	<li>Schematyczne przedstawienie zarysu eksperymentu znajduje się na rysunku 1. Rozmrozić jedną podwielokrotność pierwotnych rtTA-MEF i płytkę 3,33 x 105 komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki w całkowitej objętości 2 ml pożywki MEF. Przygotuj co najmniej 3 dołki i oznacz je 4 czynnikami (4F), mCherry i control. 
	Uwaga: Alternatywnie można użyć MEF typu dzikiego, gdy wektor lentiwirusowy wykazujący ekspresję rtTA zostanie dodany do koktajlu lentiwektorowego w kroku 4.2.</li>
	<li>Następnego dnia, po całkowitym odzyskaniu komórek po krioprezerwacji, zastąp pożywki MEF w trzech 6-dołkach odpowiednio 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) i 1 ml (kontrola) pożywki transdukcyjnej. Rozmrozić jedną podwielokrotność wirusa pLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -Ets i -mCherry w RT i dodać 100 μl każdego supernatantu zawierającego wirusa (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) do studzienki 4F. 
	Uwaga: W przypadku MEF typu dzikiego należy zmniejszyć objętość wstępnie poszczepionych pożywek o 100 μl i dodatkowo dodać 100 μl wirusa FUdeltaGW-rtTA zawierającego supernatant do mieszaniny 4F.</li>
	<li>Dodaj 100 μl pożywki zawierającej wirusa mCherry do studzienki oznaczonej mCherry. Dodać polibren do końcowego stężenia 8 μg/ml do każdej studzienki. Umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubować MEF-y O/N z supernatantem zawierającym wirusa. 
	Uwaga: W przypadku MEF typu dzikiego należy zmniejszyć objętość wstępnie poszytych pożywek o 100 μl i dodatkowo dodać 100 μl supernatantu zawierającego wirusa FUdeltaGW-rtTA.</li>
	<li>Następnego ranka ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą wirusa i przemyć trzykrotnie 2 ml PBS. Na koniec dodać 2 ml pożywki TS (bez FGF4/heparyny). 
	Uwaga: Transdukowane MEF-y mogą być bezpośrednio wykorzystywane do eksperymentów indukcyjnych iTSC lub zamrażane do dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
5. Konwersja fibroblastów na iTSC
Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w przestrzeni laboratoryjnej z licencją na poziom bezpieczeństwa biologicznego 2.
<ol>
	<li>Przemyć transdukowane MEF-y dwukrotnie 2 ml PBS i po dodaniu 0,5 ml roztworu trypsyny/EDTA inkubować je w inkubatorze przez 3 - 4 minuty. Sprawdź pod odwróconym mikroskopem, czy komórki są prawidłowo odłączone.
	<ol>
		<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 1 ml pożywki TS. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 200 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki TS. Użyj nietransdukowanej próbki kontrolnej, aby policzyć komórki.</li>
		<li>Płytka 4F-MEF, mCherry-MEF i nietransdukowane kontrolne MEF, każda o gęstości 2 x 10 5 komórek na 100 mm naczynie do hodowli komórkowej w 10 ml pożywki TS zawierającej 2 μg/ml dox (pożywka TS + FGF4/heparyna + dox).</li>
		<li>Alternatywnie, wykonaj transdyferencjację na mniejszych naczyniach. Talerz 3,6 x 103 komórki na cm2 na żądanej wielkości naczynia, odpowiednio skaluj objętość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia, za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (przy użyciu soczewki 10X i filtra odpowiedniego do wzbudzenia czerwonej fluorescencji) monitoruj ekspresję białka mCherry w celu oszacowania wydajności transdukcji. 
	Uwaga: Wydajność transdukcji powinna być bliska 100%. Jeśli zwiększona śmierć komórki jest widoczna po indukcji transgenu, oznacza to, że miano wirusa było zbyt wysokie. Transdukcję należy powtórzyć ze zmniejszoną ilością pożywki zawierającej wirusa.</li>
	<li>Od teraz zmieniaj podłoże na wszystkich naczyniach co drugi dzień aż do 10 dnia po poszyciu. Następnie nakarm komórki pożywką TS bez dox (pożywka TS + FGF4/heparyna).</li>
	<li>Używanie monitora z odwróconym mikroskopem w celu wykrycia "obszarów transzróżnicowanych" (patrz rysunek 2B i C) na szalce 4F przez okres do 3 tygodni. Takie kolonie nie powinny być widoczne na dwóch szalkach kontrolnych (mCherry-MEFs i nietransdukowane MEF).</li>
</ol>
6. Izolacja poszczególnych linii iTSC
Uwaga: Dla kroku 6.3 kaptur do hodowli tkankowej nie jest wymagany. Zaleca się przetarcie odwróconego mikroskopu 70% etanolem, aby zminimalizować ryzyko skażenia bakteryjnego. Poszczególne kolonie iTSC można izolować między 21 a 28 dniem transdyferencjacji.
<ol>
	<li>Dodaj 40 μl 0,05% roztworu trypsyny/EDTA do 12 dołków naczynia z dnem 96 U i umieść naczynie na lodzie.</li>
	<li>Przed izolacją kolonii odessać pożywkę na szalce transdyferencyjnej 4F-MEF. Umyj komórki raz 10 ml PBS. Ponownie dodaj 10 ml PBS i umieść naczynie pod odwróconym mikroskopem.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 100 μl ustawionej na 40 μl podnieś pojedyncze kolonie, okrążając je końcówką pipety i zasysając pływającą kolonię. Przenieś komórki po jednej kolonii do jednego dołka przygotowanej 96-dołkowej płytki. Po wybraniu 12 rodzin należy umieścić 96-dołkowe naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Dysocjuj komórki, pipetując w górę iw dół przez kilka razy i przenieś zawiesinę komórek do jednego dołka 24-dołkowego naczynia z przygotowanymi 500 μl pożywki TS-CM (30% świeżej pożywki TS + 70% CM + FGF4/heparyna).</li>
	<li>Następnego dnia zastąp pożywkę świeżą pożywką TS-CM, aby usunąć martwe komórki. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
	<li>Monitoruj pojawienie się kolonii nabłonka z jasnymi granicami (patrz rysunek 2). Gdy pojawią się kolonie, hoduj do 70% zlewania się lub przez okres do jednego tygodnia i stopniowo rozwijaj się na większych naczyniach. Od tej pory komórki hodowlane są prawdziwymi TSC, zgodnie ze standardowymi protokołami w pożywkach zawierających surowicę lub w pożywkach niezawierających surowicy, zdefiniowanych pożywkach 3,5,11.</li>
</ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół transdyferencjacji oparty na 4 czynnikach (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) oferuje niezawodną metodę generowania wiernie przekształconych iTSC z mysich fibroblastów embrionalnych. Co więcej, metoda ta ma również zastosowanie w przypadku pourodzeniowych fibroblastów ogonowych, chociaż ze spadkiem skuteczności w porównaniu z fibroblastami embrionalnymi 3. Ogólnie rzecz biorąc, jakość pierwotnych fibroblastów jest krytycznym czynnikiem wpływającym na wynik transdyferencjacji i należy zach...

Niedawno, badanie porównujące kilka podejść do konwersji embrionalnych komórek macierzystych myszy na trofoblasty ujawniło, że we wszystkich analizowanych systemach konwersja linii pozostała niekompletna. Zamiast indukowanych komórek macierzystych trofoblastu (iTSC) wytworzone zostały tzw. komórki macierzyste trofoblastu, które zachowują pamięć o losie komórki pochodzenia1. W tym przypadku zastosowaliśmy inne podejście do generowania iTSC. Podobnie jak w przypadku bezpośredniej indukcji pluripotencjalnych komórek macierzystych z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) 2, iTSC zostały bezpośrednio przekształcone ze zróżnicowanej tkanki somatycznej. Po pierwsze, zidentyfikowaliśmy 12 potencjalnych czynników indukujących los TSC w przypadku nadekspresji w MEF. Później czynniki Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2 zostały zidentyfikowane jako niezbędne i wystarczające do indukcji iTSC 3. W tym samym czasie inna grupa niezależnie stwierdziła, że Tfap2c, Gata3 i Eomes są wystarczające do przekształcenia MEF w iTSC. Jednak w tym badaniu czas wymagany do ekspresji transgenu jest znacznie dłuższy w porównaniu z naszym badaniem, co wskazuje na inną kinetykę konwersji, gdy Ets2 jest nieobecny w koktajlu transdyferencyjnym 4.
Konwencjonalna płodowa surowica bydlęca (FBS) zawierająca hodowlę indukowanych i pochodzących z blastocyst komórek macierzystych trofoblastu opiera się na obecności czynników wydzielanych przez MEF-y inaktywowane wzrostem 5,6. Podczas indukcji iTSC czynniki te są dostarczane przez MEF, które nie mają pełnej kombinacji transgenów i nie podlegają transdyferencjacji. Jednak po subhodowli poszczególnych kolonii iTSC wymagają one pożywki, która została wstępnie uwarunkowana przez MEF inaktywowane wzrostem. Od tego momentu iTSC mogą być hodowane i traktowane jak TSC pochodzące z blastocyst zgodnie ze standardowymi protokołami. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do Tanaka i wsp. 5, rutynowo hodujemy TSC i iTSC bez żelatynizacji naczyń do hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Hyklalat doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>Rozpuścić w sterylnym PBS, przygotować roztwór podstawowy 2 mg/ml. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Sól difosforanu chlorochiny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Przygotować 25 mM roztwór podstawowy w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Polybrene (bromek heksadimetryny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 8 mg/ml w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ludzki rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>Rozpuścić w sterylnym 0,1% BSA w PBS, przygotować 25 i mikro; g/ml roztworu podstawowego. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml przez rozpuszczenie w sterylnym PBS. Przechowuj porcje w temperaturze -80&deg; C</td></tr><tr><td>ProFection System transfekcji ssaków</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, bez glutaminy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnych</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO), klasa hodowli komórkowych</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-GATA3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Myszy B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td><td>JAX Myszy</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Komórki macierzyste trofoblastu (TSC) powstają w wyniku pierwszej decyzji o losie komórki w rozwoju ssaków. Mogą być hodowane in vitro, zachowując zdolność do samoodnawiania się i różnicowania we wszystkie podtypy linii trofoblastu, co odpowiada populacji komórek macierzystych in vivo, które dały początek płodowej części łożyska. W związku z tym TSC stanowią unikalny model do badania rozwoju łożyska oraz decyzji o losie komórek zarodkowych i pozaembrionalnych in vitro. Począwszy od stadium blastocysty, wyraźna bariera epigenetyczna składająca się z metylacji DNA i modyfikacji histonów ściśle oddziela obie linie. Tutaj opisujemy protokół pełnego pokonania tej bariery rodowej poprzez przejściową nadmierną ekspresję kluczowych regulatorów trofoblastu Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2 w mysich fibroblastach embrionalnych. Indukowane komórki macierzyste trofoblastu są zdolne do samoodnawiania się i są prawie identyczne z komórkami macierzystymi trofoblastu pochodzącymi z blastocyst pod względem morfologii, ekspresji genów markerowych i wzorca metylacji. Funkcjonalne testy in vitro i in vivo potwierdzają, że komórki te są zdolne do różnicowania się wzdłuż linii trofoblastu, generując poliploidalne gigantyczne komórki trofoblastu i chimeryzując łożysko po wstrzyknięciu do blastocyst. Indukcja komórek macierzystych trofoblastu z tkanki somatycznej otwiera nowe możliwości badania cech genetycznych i epigenetycznych tej linii pozaembrionalnej i oferuje możliwość generowania linii komórek macierzystych trofoblastu bez niszczenia odpowiedniego zarodka.

Na szalce, na której aktywowano ekspresję transgenu 4F, komórki szybko zmieniają morfologię (porównaj Rycina 2A i B). Około 14. dnia pojawiają się wyraźne obszary transdiferencjacji (podano dwa przykłady w Rycina 2B i C). Pierwotne kolonie te nie wykazują typowej morfologii TSC; jednak po ich pasażowaniu pojawia się charakterystyczna morfologia nabłonkowa z ciasno przylegającymi krawędziami i wyraźnymi granicami, wysoce przypominająca prawdziwe TSC (<stro...

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie autentycznych indukowanych trofoblastycznych komórek macierzystych (iTSCs) z fibroblastów mysich. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych dotyczące natury bariery oddzielającej linię embrionalną od pozazarodkowej. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że ekspresja transgeniczna jest aktywowana jedynie przejściowo, co ułatwia selekcję stabilnie przekształconych komórek.W laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej, pokryj pięć szalek 100 ml pięcioma mililitrami roztworu poli-L-lizyny, delikatnie kołysząc płytkami, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający. Umieść szalki w inkubatorze w temperaturze 37°C na 30 minut, następnie odessij poli-L-lizynę i przepłucz szalki jednokrotnie roztworem PBS. Następnie wysiej 7 × 10⁶ komórek 293T na szalkę w 10 ml pożywki dla komórek 293T, zakręć szalkami, aby równomiernie rozprowadzić komórki, i zwróć szalki do inkubatora.Następnego ranka należy zastąpić pożywkę wzrostową pięcioma mililitrami pożywki do transfekcji. Następnie kultury należy potraktować sześcioma mikrolitrami 1000X roztworu zapasu chlorochiny i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Aby przygotować mieszaninę do transfekcji, dla każdego wektora lentiwirusowego należy dodawać kroplowo 600 mikrolitrów roztworu DNA Lentivector do 600 mikrolitrów 2X soli w buforze HEPES podczas wstrząsania w wirówce, a następnie inkubować mieszaninę do transfekcji w temperaturze pokojowej.Po 15 minutach bardzo ostrożnie dodaj mieszaninę kroplami do przygotowanych komórek 293 T, a następnie umieść szalki z powrotem w inkubatorze. Po pięciu do sześciu godzinach wymień medium na 10 milliliters medium do produkcji wirusa i ponownie umieść płytki w inkubatorze. Następnego ranka ostrożnie wymień medium na siedem milliliters świeżego medium do produkcji wirusa i inkubuj przez kolejną noc.Następnie przenieś pożywkę z każdej płytki do osobnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml i dodaj siedem ml świeżej pożywki do produkcji wirusa na płytki w celu kolejnej inkubacji przez noc. Następnego ranka zbierz drugą partię pożywki zawierającej wirusa, łącząc nadsącz z pierwszą partią wirusa, a następnie przefiltruj pożywkę zawierającą wirusa przez membranowy filtr z octanu celulozy wolny od surfaktantów o wielkości porów 0,45 μm i przechowuj w alikwotach po 500 μl w temperaturze -80 °C. Aby przekształcić fibroblasty w indukowane komórki macierzyste trofoblastu, przemyj transdukowane embrionalne fibroblasty mysie lub MEF dwukrotnie dwiema ml PBS.Następnie odseparuj komórki, dodając 0,5 ml roztworu Trypsyny EDTA w temperaturze 37°C. Po trzech do czterech minutach potwierdź pod mikroskopem odwróconym, że komórki oddzieliły się od płytki, a następnie zneutralizuj działanie trypsyny, dodając 1 ml pożywki TS. Przenieś zawiesiny komórkowe do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwiruj komórki.Następnie osady ponownie zawiesić w dwóch mililitrach medium TS i wysiać do szalek o średnicy 100 mm w ilości 2 x 10⁵ MEF-ów (wyrażających mCherry lub kontrolnych, nietransdukowanych) na 10 ml medium TS zawierającego czynnik wzrostu fibroblastów 4 oraz heparynę, z dodatkiem doksycykliny, i inkubować przez noc. Następnego dnia, przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego, ocenić wydajność transdukcji na podstawie ekspresji białka mCherry. Jeśli wydajność transdukcji wynosi około 100%, przenieść hodowle z powrotem do inkubatora, wymieniając medium we wszystkich szalkach co drugi dzień aż do 10. dnia.Następnie zasilaj komórki świeżą pożywką TS zawierającą czynnik wzrostu fibroblastów 4 oraz heparynę, bez doksycykliny, używając mikroskopu odwróconego do monitorowania pojawiania się obszarów transdifferencjowanych na szalce z czterema czynnikami przez okres do trzech tygodni. Identyfikacja obszarów transdifferencjowanych jest kluczowa, ponieważ na tym etapie MEF nie przypominają morfologicznie komórek macierzystych trofoblastu. Należy szukać gęsto upakowanych kolonii sąsiadujących z olbrzymimi komórkami trofoblastu, które rozpoznaje się po wielkości komórek i dużym jądrze.Aby wyizolować poszczególne linie iTSC, najpierw przetrzyj mikroskop odwrócony 70% etanolem, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji bakteryjnej. Następnie dodaj 40 µL 0,5% Trypsyny EDTA do 12 dołków płytki 96-dołkowej z płaskim dnem i umieść płytkę na lodzie. Teraz odessij medium z naczynia z transdyferencjacją MEF czterech czynników i wypłucz komórki jednokrotnie 10 mL PBS.Po przemyciu dodaj do komórek 10 mililitrów świeżego PBS i umieść płytkę na stole mikroskopu odwróconego. Używając pipety 100 mikrolitrowej ustawionej na 40 mikrolitrów, okrąż końcówką pipety każdą pojedynczą kolonię i odessać powstałą pływającą kolonię. Przenieś każdą kolonię do oddzielnych studzienek płytki 96-dołkowej, aż do momentu pobrania 12 kolonii.Następnie inkubować kolonie w temperaturze 37°C przez pięć minut. Po zakończeniu inkubacji rozdzielić komórki poprzez pipetowanie i przenieść zawiesiny komórkowe do poszczególnych studzienek płytki 24-dołkowej zawierającej 500 µL pełnej pożywki TS z dodatkiem czynnika wzrostu fibroblastów i heparyny w celu hodowli przez noc. Następnego dnia wymienić pożywkę na świeżą pełną pożywkę TS z dodatkiem czynnika wzrostu fibroblastów i heparyny, aby usunąć martwe komórki, a następnie ponownie umieścić płytkę w inkubatorze.Należy codziennie monitorować hodowle pod kątem pojawienia się kolonii nabłonkowych o wyraźnych granicach. Po zaobserwowaniu kolonii hodować komórki do jednego tygodnia lub do momentu osiągnięcia 70% konfluencji. W hodowlach, w których aktywowana jest ekspresja transgenu czterech czynników, komórki szybko zmieniają morfologię.Około 14–21 dnia pojawiają się wyraźne obszary transdyferencjacji. Kolonie pierwotne te nie wykazują typowej morfologii komórek macierzystych trofoblastu, jednak po ich pasażowaniu obserwuje się charakterystyczną morfologię nabłonkową z ciasnymi krawędziami i jasnymi granicami, wysoce przypominającą rzeczywiste komórki macierzyste trofoblastu. Jeśli komórki macierzyste trofoblastu indukowane czterema czynnikami pozostają pozytywne pod kątem czynników transkrypcyjnych trofoblastu Cdx2 i Tfap2c, linie te mogą być wykorzystane do późniejszych analiz in vitro lub in vivo.Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu sześciu tygodni, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procesu. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak wstrzykiwanie wspomagane strumieniem powietrza (blast assisted injection), aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące potencjału chimeryzacji wygenerowanych iTSC.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak bezpośrednio przekształcić nowe fibroblasty embrionalne w indukowane komórki macierzyste trofoblastu. Prosimy pamiętać, że praca z wektorami lentiwirusowymi może być niezwykle niebezpieczna i należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie procedur pracy odpowiednich dla drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.

protocol-for-direct-conversion-murine-embryonic-fibroblasts-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie prezentujemy izolację blastocyst myszy oraz wyprowadzenie komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Opisujemy również warunki utrzymania właściwości macierzystych komórek, a także indukcję ich różnicowania w hodowli.

Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Tutaj prezentujemy nasz protokół wytwarzania indukowanych erytroidalnych progenitorów (iEPs) z dorosłych fibroblastów myszy za pomocą bezpośredniego przeprogramowania linii (DLR) sterowanego czynnikiem transkrypcyjnym.

Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Ten protokół opisuje technikę oceny zmian w unaczynieniu matki podczas ciąży u myszy. Za pomocą metod stereologicznych ocenia się ilościowo przebudowę dziesiętnych tętnic spiralnych, a wyniki potwierdza się jakościowo za pomocą immunohistochemii.

Ocena przebudowy naczyń krwionośnych matki w czasie ciąży w macicy myszy

Poznaj metodę konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu przy użyciu przejściowej ekspresji czynników transkrypcyjnych. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów różnicowania linii komórkowych.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Przeglądaj więcej filmów