Name: In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę badania przenikania nanoformułowanych cząsteczek przez barierę krew-mózg szczura przy użyciu ferrytyn obciążonych FITC. Model in vitro wspiera rozwój terapii neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia i Sacco Hospital (NanoMeDia Project) za finansowanie badań.

1. Ustanawianie modelu BBB
Uwaga: W celu ustalenia modelu BBB sugerujemy użycie dostępnych na rynku pierwotnych RBMEC i RCA. Wszystkie czynności muszą być wykonywane przy użyciu sterylnych odczynników i materiałów jednorazowego użytku, obsługiwanych w okapie z przepływem laminarnym. 
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Kolby do hodowli komórkowych pokryć poli-L-lizyną 100 μg/ml (1 godz. w temperaturze pokojowej) lub fibronektyną 50 μg/ml (1 godz. w temperaturze 37 °C) w celu ułatwienia przyłączenia odpowiednio RCA lub RBMEC. Następnie rozmrozić 1 x 106 RCA i 5 x 105 RBMEC w podłożu komórek śródbłonka, uzupełnionych 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% suplementem wzrostu komórek śródbłonka i 1% penicyliną/streptomycyną (sECM). Wysiewanie RCA w kolbie T175 w 20 ml sECM i RBMEC w kolbie T75 w 10 ml sECM. 
		Uwaga: Pasaże rozmrażania i wysiewu RCA i RBMEC muszą być dostosowane pod względem gęstości komórek i czasu w hodowli, zgodnie z liczbą warunków doświadczalnych, które mają być badane za pomocą modelu BBB. Zaczynając od 1 fiolki po 1 x 106 RCA i 1 fiolki po 5 x 105 RBMEC, możliwe jest uzyskanie do 20 wkładek łożyskowych BBB.</li>
		<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze przez około 6 dni, aż do około 80% konfluencji dla RCA i ponad 90% konfluencji dla RBMEC. Odłącz komórki za pomocą roztworu trypsyna-EDTA (trypsyna 1:250) na 5 minut (1 ml trypsyny dla kolb T75 i 2 ml dla kolb T175). Zatrzymać aktywność trypsyny za pomocą sECM (2:1), odwirować zawiesiny komórek w stężeniu 750 × g przez 5 minut i ponownie zawiesić granulki w 60 ml sECM.</li>
		<li>Podzielić RBMEC na 3 kolby T175 i hodować w sECM przez kolejne 3 dni przed wysiewem na płytki. Policz całkowitą liczbę żywych RCA, obserwując zawiesinę komórek rozcieńczoną w stosunku 1:1 błękitem trypanowym pod mikroskopem optycznym w komorze Burkera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew komórek na wkładki
	<ol>
		<li>Potraktuj jedną stronę membrany politereftalanu etylenu (PET) 6 przezroczystych wkładek wielodołkowych poli-L-lizyną 100 μg/ml, a drugą stronę fibronektyną 50 μg/ml, aby umożliwić przyłączenie RCA i BMEC. Z wkładkami należy obchodzić się pęsetą, aby uniknąć kontaktu z membraną PET.
		<ol>
			<li>Umieścić wkładki w płytce 6-dołkowej i dodać roztwór fibronektyny (minimum 500 μl) do górnej komory. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37 °C należy usunąć roztwór fibronektyny, zdjąć płytki wielodołkowe i położyć je do góry nogami na dnie płytki Petriegoo długości 150 cm 2, która jest tutaj używana jako sterylne podłoże dla już pokrytych wkładek.</li>
			<li>Delikatnie dodaj 800 μl poli-L-lizyny na spodzie wkładki (jak pokazano na rysunku 1A; określane jako wysiewanie RCA) i trzymaj roztwór na wkładkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Odessać roztwór i pozostawić wkładki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut. Wkładki są teraz gotowe do wysiewu komórek, ale mogą być również przechowywane w płytce wielodołkowej przez kilka dni w temperaturze 4 °C, przed przystąpieniem do budowy BBB. 
			Uwaga: Pamiętaj, aby co najmniej 3 powlekane wkładki były wolne od komórek, które mogą być używane jako kontrole w celu walidacji ustalenia BBB na podstawie pomiarów strumienia FD40.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wysiewaj RCA (35 000/cm2) na spodniej stronie wkładek pokrytych poli-L-lizyną, upuszczając 800 μl zawiesiny komórek na odwróconą wkładkę (rysunek 1A). Pozostaw zawiesinę RCA na wkładkach na 4 godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić sprawne przymocowanie komórek do membrany.</li>
		<li>Odessać pozostały roztwór, umieścić wkładki w studzienkach zawierających 2 ml sECM i utrzymywać płytkę wielodołkową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze, zmieniając sECM co 2 dni.</li>
		<li>Po 3 dniach, gdy RCA pokryją dolną powierzchnię wkładki, wysiewaj RBMEC na górną stronę wkładki, wykonując następujące czynności:
		<ol>
			<li>Odłączyć RBMEC od kolb T175 i policzyć całkowitą liczbę żywych komórek, jak podano w krokach 1.1.2 i 1.1.3.</li>
			<li>Wysiewaj RBMEC (60 000 / cm2) na górnej powierzchni wkładki w sECM (1 000 μl) (Rysunek 1B), pozostawiając 3 inserty tylko z astrocytami, które mają być użyte jako tło TEER. Umieścić płytkę wielodołkową w standardowych warunkach hodowli. Utrzymuj system do hodowli przez co najmniej 3 dni, zmieniając sECM w komorze wewnętrznej i dolnej co 2 dni.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Walidacja BBB
<ol>
	<li>Pomiar TEER
	<ol>
		<li>W 3 dniu kohodowli należy sprawdzić TEER, wkładając wkładki z łożyskiem BBB do odpowiedniej komory (która ma nasadkę i gdzie zarówno komora, jak i nasadka zawierają parę elektrod wykrywających napięcie i prąd), wypełnionej 4 ml sECM. Podłączyć do woltomierza / omomierza tkanki nabłonkowej.</li>
		<li>Wraz z pomiarami TEER systemów BBB ogniw, zapisz wartości TEER 3 wkładek zawierających RCA, które zostaną odjęte od wartości uzyskanych za pomocą BBB. Pomnóż otrzymane wartości TEER przez powierzchnię wkładki (4,2 cm2), aby wyrazić wyniki jako Ω x cm2.</li>
		<li>Od 3 dnia kohodowli należy codziennie mierzyć wskaźnik TEER. Uwaga: Po początkowym okresie, w którym TEER wzrasta, zarejestrowane wartości powinny pozostać stabilne przez co najmniej dwa kolejne dni (zwykle między 5. a 7. dniem kohodowli). W tym momencie BBB jest gotowy do drugiego etapu walidacji (sekcja 2.2) i/lub do eksperymentów trans-BBB. 
		Uwaga: Procedura opisana w ppkt 2.1 może być przeprowadzona na tych samych systemach BBB, które są przeznaczone do następujących doświadczeń przepuszczalności (sekcja 3). Pracuj w sterylnych warunkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strumień trans-BBB FITC-dekstranu 40 (FD40)
	<ol>
		<li>Zmierzyć strumień FD40 od górnej do dolnej komory modeli BBB w porównaniu z przepływem przez 3 puste wkładki (patrz uwaga do sekcji 1.2.1) zgodnie z następującymi krokami:
		<ol>
			<li>Dodać 1 mg/ml FD40 (rozcieńczonego w sECM) do górnej komory BBB, a po 1, 2 i 3 godzinach pobrać 200 μl sECM z dolnej komory i zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą spektrofluorymetru (λex 488 nm, λem 515 nm, szczelina 5).</li>
			<li>Wartości fluorescencji tła sECM należy uzyskać, mierząc 500 μl podłoża pierwotnego przy użyciu tych samych parametrów analitycznych. Odejmij fluorescencję tła sECM od wszystkich wartości fluorescencji FD40.</li>
			<li>Oznaczyć ilość przesiąkniętego FD40 przez porównanie obserwowanych wartości fluorescencji z krzywą kalibracyjną wytworzoną przy znanych stężeniach (tj. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 μg/ml) znacznika fluorescencyjnego rozpuszczonego w 500 μl sECM.</li>
			<li>Obliczyć współczynnik przepuszczalności pozornej (Papp) na podstawie średnich wartości strumienia zgodnie z: 
			Papp = J/AC 
			gdzie J jest strumieniem cząsteczki (mol/s), A jest obszarem przenikania (cm2), a C jest stężeniem cząsteczki w górnym przedziale (mole/cm3). 
			Uwaga: Trzy lub więcej systemów BBB, które osiągnęły odpowiednie wartości TEER, muszą być poświęcone wyłącznie tej procedurze walidacji i nie powinny być stosowane do następujących eksperymentów przepuszczalności (sekcja 3). Sterylność nie jest obowiązkowa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trans-BBB przenikania ferrytyn obciążonych FITC (FnN)
Uwaga: Rekombinowany wariant ludzkiej ferrytyny (Fn), wytwarzany przez Escherichia coli i łączony w nanoklacze (FnN) w celu enkapsulacji różnych cząsteczek fluorescencyjnych, jest dostępny w NanoBioLab prof. Prosperiego (Uniwersytet Milan-Bicocca, Włochy). FnN są ładowane FITC, zgodnie z wcześniej opisanym protokołem13, a stężenia zarówno Fn, jak i załadowanych cząsteczek są dokładnie określane. 
<ol>
	<li>Strumień Trans-BBB FITC i FITC-FnN
	<ol>
		<li>Zmierzyć strumień FITC-FnN od górnej do dolnej komory zwalidowanych modeli BBB (zwykle w 5-7 dniu kohodowli), w porównaniu z strumieniem wolnego barwnika po 7 i 24 godzinach inkubacji, zgodnie z następującymi krokami:
		<ol>
			<li>Dodać FITC-FnN (50 μg/ml FnN, 1,1 μM FITC) lub taką samą ilość wolnego FITC do górnej komory co najmniej 6 systemów BBB dla każdej postaci użytkowej, w celu pobrania 2 ml roztworu sECM z dolnej komory co najmniej 3 wkładek po 7 godzinach, a z dolnej komory pozostałych 3 wkładek po 24 godzinach.</li>
			<li>Zmierzyć intensywność fluorescencji 500 μl pobranych próbek za pomocą spektrofluorymetru (λex 488 nm, λem 515 nm, szczelina 5).</li>
			<li>Uzyskać fluorescencję tła sECM, mierząc 500 μl pożywki przy użyciu tych samych parametrów analitycznych. Odejmij fluorescencję tła sECM od wszystkich wartości fluorescencji FITC lub FITC-FnN.</li>
			<li>Oznaczyć stężenie przesiąkniętego FITC lub FITC-FnN, porównując uzyskane wartości fluorescencji z dwiema różnymi krzywymi kalibracyjnymi otrzymanymi przy znanych stężeniach (tj. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) wolnego lub nanoformulacji barwnika rozpuszczonego w 500 μl sECM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lokalizacja FITC-FnN w RBMEC
	<ol>
		<li>Usunąć sECM z górnej komory systemów BBB, przemyć wkładki PBS i zamocować RBMEC na co najmniej dwóch wkładkach dla każdej grupy doświadczalnej, dodając 500 μl paraformaldehydu (4% w buforze fosforanowym soli fizjologicznej-PBS) do górnej komory przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj wkładki trzykrotnie PBS, aby usunąć pozostałości paraformaldehydu. 
		Uwaga: Od tego momentu bezpłodność nie jest konieczna.</li>
		<li>Wytnij odpowiednie kawałki membrany PET i przystąp do immunodekoracji komórek zgodnie z następującymi krokami:
		<ol>
			<li>Przepuszczalność RBMEC za pomocą 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut. Wykonać etap blokujący przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem zawierającym 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 2% surowicy koziej w PBS. Próbki inkubować z czynnikiem anty-Von Willebranda (VWF) w rozcieńczeniu 1:20 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Po trzykrotnym przemyciu PBS należy wystawić komórki na działanie 2% BSA, 2% roztworu surowicy koziej zawierającego odpowiednie przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:300 w celu ujawnienia anty-VWR i DAPI w rozcieńczeniu 1:1,500 w celu wykrycia jąder.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zamontuj wkładki na szkiełkach mikroskopowych za pomocą roztworu do mocowania zapobiegającego blaknięciu (jedna kropla na fragment wkładki), a następnie zamknij próbkę szkiełkiem nakrywkowym. Analizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu olejowej soczewki immersyjnej przy 40-krotnym powiększeniu, powiększeniu 1,5 i rozdzielczości 1,024 x 1,024 pikseli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+compounds+that+cross+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier.</a> BMC Neurol. 9 (1), 3(2009).</li>
<li>Löscher, W., Potschka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+brain+disease+and+the+role+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).</li>
<li>Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+quantum+dots+for+crossing+blood-brain+barrier+in+vitro+and+providing+therapy+of+HIV-associated+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy.</a> Front Pharmacol. 15 (4), 140(2013).</li>
<li>Masserini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+Brain+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for Brain Drug Delivery.</a> ISRN Biochem. , (2013).</li>
<li>Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomedicines+for+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Towards nanomedicines for neuroAIDS.</a> Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritins%3A+a+family+of+molecules+for+iron+storage%2C+antioxidation+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).</li>
<li>Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+denaturation%2Frenaturation-based+production+process+for+ferritin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles.</a> Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).</li>
<li>Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+on+endothelium+of+brain+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries.</a> Nature. 312, 162-163 (1984).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp.+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).</li>
<li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li>
<li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells.</a> J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).</li>
<li>Fiandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulation+of+antiretroviral+drugs+enhances+their+penetration+across+the+blood+brain+barrier+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice.</a> Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).</li>
<li>Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting-up+an+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+%28BBB%29%3A+a+focus+on+BBB+impermeability+and+receptor-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport.</a> J. Vis. Exp. , e51278(2014).</li>
<li>Perrière, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+for+molecular+analysis+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters.</a> Brain Res. 1150, 1-13 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda in vitro stanowi użyteczne, zwalidowane podejście do badania dostarczania cząsteczek fluorescencyjnych trans-BBB po nanopreparatyce z nanocząstkami. Tutaj używamy FnN, który jest dobrym kandydatem do badania translokacji cząsteczek ładunku przez barierę krew-mózg. FnN jest uważany za złoty nanowektor do dostarczania leków / środków trans-BBB, ponieważ jest specyficznie rozpoznawany przez receptor TfR1, który ulega ekspresji na błonie świetlnej BMEC i pośredniczy w wychwytywaniu nanocząstek z...

Odporność chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN) (np. raka, epilepsji, depresji, schizofrenii i zaburzeń neurologicznych związanych z HIV) na terapie farmakologiczne wynika z różnych mechanizmów, w tym z uciążliwego przenikania leków przez barierę krew-mózg (BBB). Bariera krew-mózg to granica, która izoluje tkanki mózgowe od substancji krążących we krwi. W obrębie tej bariery znajduje się warstwa komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC), wspierana przez perycyty i astrocyty na końcach, jest odpowiedzialna za wysoką selektywność bariery krew-mózg w stosunku do leków rozpuszczalnych w wodzie o masie cząsteczkowej większej niż 400 Da1. Inny mechanizm oporności związany z lekami jest związany z obecnością na BMEC transporterów wypływu leków (glikoproteiny P i białek oporności wielolekowej), które współpracują w celu zmniejszenia penetracji leku do OUN i ułatwienia jego wytłaczania z mózgu2.
W ciągu ostatniej dekady opracowano wiele podejść nanotechnologicznych, aby sprostać klinicznemu i biologicznemu wyzwaniu dostarczania leków przez BBB3-6. W tym kontekście nanosfery ferrytynowe (FnN) stanowią całkowicie innowacyjne i obiecujące rozwiązanie. FnN to kule o długości 12 nm zawierające 24 samoorganizujące się monomery ferrytyny (Fn), które są ułożone w pustą sferyczną strukturę o średnicy wewnętrznej 8 nm. Podjednostki ferrytyny można rozmontować przy kwaśnym pH i ponownie złożyć w sposób z pamięcią kształtu, doprowadzając pH do neutralności, co pozwala na zamknięcie różnych cząsteczek organicznych. W związku z tym FnN stanowi interesujący model dla rozwoju wielofunkcyjnych systemów dostarczania leków7,8. Co więcej, FnN może wchodzić w interakcje z BMEC dzięki specyficznemu rozpoznawaniu receptora transferyny (TfR) 1, który ulega ekspresji na błonie świetlnej tych komórek9.
Do tej pory opracowano różne modele BBB in vitro w celu wyjaśnienia przepuszczalności trans-BBB dla różnych leków, toksyczności w stosunku do BBB, czy interakcji cząsteczek z transporterami wypływu. Rzeczywiście, modele te są uważane za ważne podejścia in vitro do szybkiego badania przesiewowego aktywnych cząsteczek przed przystąpieniem do badań in vivo. Modele te składają się z pojedynczej warstwy śródbłonka BMEC lub współhodowanych BMEC i astrocytów (rzadziej perycytów), uzyskanych z linii komórkowych zwierzęcych (szczurów, myszy, świń i bydła) lub ludzkich10,11,12. Rezystancja elektryczna transśródbłonka (TEER) i pozorna przepuszczalność (Papp) znaczników o określonej masie cząsteczkowej stanowią dwa krytyczne parametry, które są wykorzystywane do określenia jakości modelu in vitro. W tym miejscu opisujemy zastosowanie modelu BBB in vitro, opartego na wspólnej hodowli szczurzych BMEC (RBMEC) i szczurzych astrocytów korowych (RCA) w celu zbadania przenikania trans-BBB do nanokage ferrytyny kapsułkujących izotiocyjanian fluoresceiny (FITC).

<table><tbody><tr><td>Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu szczura&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10308</td><td>wyizolowany z tkanki mózgowej szczura Sprague Dawley, kriokonserwowany przy pierwszym pasażu i dostarczony zamrożone</td></tr><tr><td>astrocyty korowe&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10202</td><td>wyizolowany z 2-dniowej tkanki mózgowej szczura, kriokonserwowany podczas pierwszego pasażu i dostarczony w stanie zamrożonym.</td></tr><tr><td>Zestaw Endothelial Cell Medium</td><td>Innoprot</td><td>P60104</td><td>ECM (500 ml) i płodowa surowica bovin (25 ml), suplement na wzrost komórek śródbłonka (5 ml) i penicylina/streptomycyna (5 ml). Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA bez Phenol Red</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920D</td><td>Warm w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran 40 000</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>chronić przed światłem</td></tr><tr><td>paraformaldehydu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>rozcieńczenia w kapturze chemicznym</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Dulbecco sól fizjologiczna bez Ca i Mg</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>kozie surowica&nbsp;</td><td>EuroClone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>mysie monoklonalne przeciwciało anty-Von Willebranda Dako</td><td></td><td>M0616</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 546-sprzężone przeciwko mysim IgG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11003</td><td>chroni przed światłem</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>chroni przed światłem</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>ten sam roztwór można stosować kilkakrotnie</td></tr><tr><td>fibronektyna z osocza bydlęcego&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>to samo rozwiązanie może być używane kilkakrotnie</td></tr><tr><td>Wkłady z politereftalanu etylenu (PET)</td><td>Falcon</td><td>F3090</td><td>Przezroczyste membrany z politereftalanu etylenu (PET); powierzchnia: 4,2 cm2; wielkość porów 0,4 i mikro; m/powierzchnia</td></tr><tr><td>Kolba T75 Primo TC</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>T175 Kolba Primo TC</td><td>EuroClone</td><td>ET7181</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Napięcie tkanki nabłonkowej/omomierz&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments Niemcy</td> Puchar <td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Endohm-24SNAP</td><td>World Precision Instruments Niemcy</td><td>ENDOHM-24SNAP</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny/fluorescencyjny z kamerą</td><td>Moduł kamery Leica Microsystems</td><td>DM IL LED FLUO/ ICC50 W</td><td>&nbsp; Mikroskop odwrócony do żywych komórek z kamerą&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorymetr</td><td>Jasco</td><td>FP-8000</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro przenikanie ferrytyn obciążonych fitc przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu, wspierane przez perycyty i astrocyty, są odpowiedzialne za niską przenikalność dużych leków rozpuszczalnych w wodzie przez barierę krew-mózg (BBB), powodując trudności w skutecznych terapiach farmakologicznych. W ostatnich latach różne strategie promowania celowania w mózg miały na celu poprawę dostarczania i aktywności leków w tym miejscu, w tym innowacyjne nanosystemy do dostarczania leków przez barierę krew-mózg. W tym kontekście podejście in vitro oparte na uproszczonym modelu komórkowym bariery krew-mózg stanowi użyteczne narzędzie do badania wpływu nanopreparatów na przenikanie cząsteczek przez barierę krew-krwi. W badaniu tym opisano rozwój dwuwarstwowej bariery krew-mózg, składającej się ze współhodowanych, komercyjnie dostępnych pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu szczura i astrocytów. Opisano również wieloparametryczne podejście do walidacji modelu, oparte na pomiarze przezśródbłonkowego oporu elektrycznego i pozornej przepuszczalności dekstranu o dużej masie cząsteczkowej. Jako dowód słuszności koncepcji zastosowania tego modelu BBB do badania wpływu różnych nanopreparatów na translokację cząsteczek fluorescencyjnych przez barierę, opisujemy zastosowanie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), załadowanego do nanocząstek ferrytyny. Zdolność ferrytyn do poprawy przenikania trans-BBB przez FITC wykazano za pomocą pomiarów strumienia i analiz mikroskopii konfokalnej. Wyniki sugerują, że jest to użyteczny system do walidacji nanosystemów pod kątem dostarczania leków przez barierę krew-mózg.

Podczas tworzenia modelu BME można monitorować przyleganie i wzrost komórek na wkładkach za pomocą mikroskopu świetlnego, dzięki przezroczystości membran PET. Komórki RCA, wysiane z gęstością 35 000 komórek/cm2, efektywnie przylegają do dolnej strony wkładki po 4 h inkubacji w temperaturze pokojowej (Rycina 2A) i w ciągu 3 dni narastają, pokrywając powierzchnię membrany i przyjmując morfologię wrzecionowatą (Rycina 2B). Komórki RBMEC, wysiane z...

Opisano i zweryfikowano metodę tworzenia modelu in vitro bariery krew-mózg opartej na wspólnej hodowli komórek mikronaczyniowych śródbłonka i astrocytów mózgu szczura. System ten okazał się przydatnym narzędziem do badania wpływu nanoformulacji na przenikanie przez barierę cząsteczek fluorescencyjnych.

In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis zwalidowanego podejścia do badania transportu nanoformułowanych cząsteczek fluorescencyjnych przez barierę krew-mózg, z wykorzystaniem nanoklatek ferrytynowych załadowanych FITC jako dowodu koncepcji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie oporności chorób ośrodkowego układu nerwowego na terapie farmakologiczne, wynikającej z niskiej przenikalności leków przez barierę krew-mózg. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykazania zdolności nanoformułacji do poprawy przenikania enkapsulowanych cząsteczek przez BBB z wykorzystaniem podejścia opartego na pojedynczym modelu BBB.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zaburzeń o skutkach neurologicznych, ponieważ pozwala ona przezwyciężyć wysoką selektywność bariery krew-mózg dla większości leków. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat wydajności nanoklatek ferrytynowych jako systemu dostarczania leków przez BBB. Została ona zastosowana z FITC, ale może być również wykorzystana z innymi cząsteczkami karagenianu lub innym rodzajem organicznych bądź nieorganicznych nanocząstek.Rozpocznij od powlekania kolb do hodowli komórkowej Poly L Lysi

in-vitro-permeation-fitc-loaded-ferritins-across-rat-blood-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Ten film demonstruje metodę badania przenikania przez model bariery krew-mózg (BBB) in vitro przy użyciu astrocytów i komórek śródbłonka na wkładce membranowej, z wolnym FITC i ferrytyną obciążoną FITC. FITC-ferrytyna wiązała się z receptorami na komórkach śródbłonka i przenikała przez barierę błonową do dolnej komory, podczas gdy wolna FITC wykazywała ograniczoną przenikalność i pozostawała w górnej komorze.

Badanie przenikania FITC i FITC-ferrytyny przez model bariery krew-mózg in vitro

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

W tym badaniu prezentujemy łatwą i efektywną procedurę oceny uszkodzenia bariery krew-mózg w stanach neurodegeneracyjnych. Aby osiągnąć nasz cel, wstrzyknęliśmy albuminę o wysokiej masie cząsteczkowej izotiocyjanianu fluoresceiny znakowanej (FITC) do żyły szyjnej myszy i oceniliśmy jej wyciek do miąższu mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Ten protokół ilustruje test transcytozy komórek śródbłonka in vitro jako model do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka poprzez pomiar zdolności ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki do transportu peroksydazy chrzanowej przez komórki w procesach transportu transkomórkowego, w których pośredniczą kaweole.

Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Poznaj metodę badania przenikania nanoformułowanych cząsteczek przez barierę krew-mózg szczura przy użyciu ferrytyn obciążonych FITC. Model in vitro wspiera rozwój terapii neurologicznych.

In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów