Name: Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Naucz się techniki patch clamp na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura. Ta metoda zachowuje mikrośrodowisko neuronów i komórek glejowych, umożliwiając dokładne badania elektrofizjologiczne mechanizmów bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Badań nad Bezbolesnymi za wsparcie pracy. Prace te były również wspierane przez granty NIH R01 NS080921-01 i R21 NS079897-01A1.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury dotyczące utrzymania i użytkowania zwierząt doświadczalnych były zgodne z przepisami Komitetów UCSF ds. Badań nad Zwierzętami i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi przepisów NIH dotyczących użytkowania i opieki nad zwierzętami (Publikacja 85 - 23, poprawiona w 1996 roku). Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF zatwierdził protokoły zastosowane w tym badaniu.
1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i potraw
<ol>
	<li>Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF).
	<ol>
		<li>Przygotować 500 ml 10 x roztworu o niskiej zawartości kationów i 500 ml 10 x roztworu wodorowęglanu (patrz tabela 1 i 2 w celu przygotowania roztworu). Przechowywać w temperaturze 4 oC i zużyć w ciągu jednego miesiąca.</li>
		<li>Przygotować 600 ml świeżego aCSF, mieszając 60 ml 10 x roztworu o niskiej zawartości kationów z 60 ml roztworu wodorowęglanu, a następnie dodać 480 ml wody dejonizowanej, aby osiągnąć końcową objętość 600 ml. Pęcherzyk aCSF karbogenem (95%O2 i 5% CO2) przez co najmniej 10 minut przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciągnij pipetę krosową ze szkła kapilarnego.
	<ol>
		<li>Umieść cienkościenne szkło kapilarne w ściągaczu do pipet, aby przygotować pipety rejestrujące. 
		Uwaga: W naszym laboratorium w celu uzyskania idealnego kształtu pipety stosuje się następujące parametry ustawień ściągacza: ciepło (510), prędkość (32). Idealny kształt pipety do nienaruszonego zapisu DRG powinien charakteryzować się stopniowym, smukłym stożkiem i małym kątem stożka, a najlepiej można to osiągnąć metodą prób i błędów.</li>
		<li>Upewnij się, że rezystancja pipety wynosi 3-5 MΩ po napełnieniu roztworami wewnętrznymi (patrz Tabela 3 dotycząca przygotowania roztworu). Zapoznaj się z przewodnikiem Axon, aby zapoznać się ze szczegółową metodą pomiaru oporu pipety 18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 1 mg kolagenazy do 400 μl aCSF, aby uzyskać końcowe stężenie 13 jednostek/ml. Następnie napełnij każdą szklaną pipetę około 20 μl roztworu kolagenazy. Napełnione pipety należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 oC i zużyć w ciągu trzech tygodni.</li>
	<li>Przygotować 200 ml zimnego płynu CSF (około 4 oC). Aby szybko schłodzić aCSF, umieść go w zlewce, zamknij folią spożywczą i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 oC na około 20 minut, aż zacznie zamarzać. Umieść zlewkę w łaźni lodowej i bąbelkuj karbogenem przez 10 minut. Pozostałe 400 ml aCSF przepłukać karbogenem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas gdy płyn CSF stygnie, odetnij koniec plastikowej jednorazowej pipety transferowej, aby powiększyć otwór do średnicy 5 mm (zostanie on użyty do przeniesienia DRG). Zbierz następujące narzędzia chirurgiczne: skalpel (#15), proste i zakrzywione nożyczki Mayo, rongeur z cienką końcówką 2 mm, kleszczyki Adson (ząbkowane), nożyczki do tęczówki, nożyczki sprężynowe i dwa cienkie kleszcze. Wlej natleniony zimny aCSF do 3 szklanych szalek Petriego (średnica zewnętrzna: 10 cm).</li>
</ol>
2. Sekcja DRG
<ol>
	<li>Znieczulić szczura (200-220 g) pentobarbitalem sodu (100 mg/kg, i.p.) i potwierdzić, że poziom znieczulenia jest odpowiedni, testując odruch pedałowania i odruch mrugania oczami.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że szczur jest znieczulony, ogol odcinek lędźwiowy i naciąć skórę i tkankę podskórną wzdłuż linii środkowej. Odłącz mięśnie przykręgosłupowe od wyrostków kolczystych na poziomie L1-S2 za pomocą drobnego podnośnika okostnej.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych nożyczek, aby przeciąć wyrostki kolczyste od L1 do S2. Użyj prostych nożyczek Mayo, aby wykonać poprzeczne nacięcia w odsłoniętym kręgosłupie w pobliżu L1 i S1 i usuń ten segment kręgosłupa en bloc i szybko zanurz go w zimnym aCSF (przygotowanym w kroku 1.5) na 2-3 minuty. Po usunięciu DRG odcinka lędźwiowego eutanazja jest przeprowadzana przez obustronną torakotomię, podczas gdy szczur jest nadal pod głębokim znieczuleniem pentobarbitalnym. </li>
	<li>Spłukać krew z usuniętego kręgosłupa i przyczepionej tkanki i przenieść na szalkę Petriego z zimnym aCSF. Użyj drobnego rongeur, aby usunąć blaszki. Przetnij oponę twardą wzdłuż linii środkowej za pomocą mikronożyczek, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Delikatnie podnieś rdzeń kręgowy i przetnij korzenie nerwowe w miejscu ich wejścia do rdzenia kręgowego za pomocą nożyczek do tęczówki, a następnie usuń rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Przenieś pozostały kręg za pomocą DRG na drugą szalkę Petriego wypełnioną zimnym CSF. Zidentyfikuj DRG L4 i L5 na podstawie ich względnego położenia w stosunku do wyrostków poprzecznych i nerwu kulszowego. 
	Uwaga: Utrzymanie nerwu kulszowego w stanie nienaruszonym pomoże zidentyfikować L4 i L5 DRG (nerw kulszowy pochodzi z nerwów rdzeniowych L4-6).</li>
	<li>Użyj kleszczyków Dumont i nożyczek Noyes, aby uwolnić DRG z otaczających tkanek łącznych. Utrzymuj korzeń nerwowy i nerw rdzeniowy przyczepione do DRG.</li>
	<li>Użyj pipety transferowej, aby przesunąć DRG do trzeciej płytki Petriego w celu dalszej sekcji.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń jak najwięcej epineurium otaczającego DRG.
	<ol>
		<li>Użyj nożyczek sprężynowych Noyes, aby wyciąć otwór, w którym korzenie grzbietowe i brzuszne łączą się z DRG i oddzielić korzeń brzuszny od DRG. Użyj kleszczy Dumont #5 z końcówkami, aby przytrzymać epineurium, i użyj innych cienkich kleszczy, aby zwinąć DRG z epineurium.</li>
		<li>Kontynuuj usuwanie jak największej ilości epineurium przyczepionego do DRG za pomocą cienkich kleszczy. 
		Uwaga: Dobrze rozcięty DRG jest ważny, aby uzyskać dobre trawienie w następnym kroku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trawienie DRG
<ol>
	<li>Przenieść DRG do komory rejestracyjnej. Upewnij się, że strona DRG, z której pochodzą korzenie nerwowe, jest skierowana w dół. 
	Uwaga: W ten sposób większość neuronów jest dostępna.</li>
	<li>Użyj kotwicy, aby ustabilizować DRG. Perfuzja DRG z natlenionym aCSF z szybkością 0,5 ml/min przez plastikowe rurki połączone z pompą perystaltyczną, którą umieszcza się na stole obok urządzenia rejestrującego.</li>
	<li>Odczekaj 30 minut, aby komórki mogły się zregenerować. Oceń jakość DRG w optyce kontrastu różnicowego interfejsu podczerwieni (IR-DIC) przy 40-krotnym powiększeniu obiektywu za pomocą kamery CCD. 
	Uwaga: Dobry DRG zwykle zawiera wiele okrągłych, dobrze skontrastowanych neuronów otoczonych satelitarnymi komórkami glejowymi na swojej powierzchni.</li>
	<li>Strawić niewielki obszar powierzchni DRG. 
	Uwaga: Pipety ze szklanymi łatkami są umieszczone w uchwytach na pipety, które są małymi złączkami, które umożliwiają przymocowanie rurki do szklanej pipety z hermetycznym uszczelnieniem.
	<ol>
		<li>Oddzielnie podłączyć dwie strzykawki o pojemności 1 ml do uchwytów na pipety za pomocą dwóch kawałków gumowej rurki o małej średnicy. Włóż jedną szklaną pipetę wypełnioną kolagenazą do jednego z uchwytów na pipety, a pustą szklaną pipetę do drugiego.</li>
		<li>Użyj mikromanipulatora, aby ustawić pipety tuż nad DRG. Następnie, pod mikroskopem, należy delikatnie zderzyć końcówki dwóch pipet ze sobą, aby powiększyć otwory końcówek pipet (najlepiej o średnicy 5-10 μm).</li>
		<li>Przesunąć pipetę wypełnioną enzymem blisko powierzchni DRG i na krótko przyłożyć nadciśnienie do pipety zawierającej kolagenazę przez rurkę łączącą uchwyt i strzykawkę, przesuwając tłok o około 0,5 ml. 
		Uwaga: Pod ciśnieniem przepływ enzymu z pipety nieznacznie powiększy przestrzeń między neuronami DRG, co może służyć jako znak do aplikacji enzymu.</li>
		<li>Po 10 do 15 minutach, gdy zaobserwuje się resztki pozostałego epineurium, należy delikatnie podcisnąć pustą pipetę, aby odessać zanieczyszczenia. 
		Uwaga: W ten sposób neurony i otaczające je satelitarne komórki glejowe będą wyraźnie odsłonięte i gotowe do rejestracji łaty.</li>
		<li>Wyrzuć dwie pipety do pojemnika na ostre przedmioty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nagrania z zaciskiem krosowym
<ol>
	<li>Umieść roztwór elektrody (patrz Tabela 3) na lodzie, aby zapobiec degradacji. Napełnij szklaną pipetę z plastrem przefiltrowanym roztworem wewnątrzkomórkowym (filtr strzykawkowy, wielkość porów: 0,2 μm) i umieść pipetę w uchwycie na pipety w głowicy pomiarowej. Delikatnie wycisnąć pipetę przez strzykawkę o pojemności 5 ml, przesuwając tłok o około 1 ml przed opuszczeniem pipety do roztworu do kąpieli. 
	Uwaga: Zapobiega to zablokowaniu pipety.</li>
	<li>Wybierz tryb "V-clamp", obracając pokrętło trybu na amplifier, a następnie otwórz interfejs "Test membrany" w oprogramowaniu. Przesunąć pipetę bliżej docelowego neuronu pod kontrolą mikroskopu. 
	Uwaga: W nienaruszonym preparacie DRG cienka warstwa satelitarnych komórek glejowych otacza każdy neuron.</li>
	<li>Użyj dodatniego ciśnienia z pipety, aby przejść przez satelitarną warstwę komórek glejowych, aż do momentu zaobserwowania nagłego powiększenia przestrzeni między neuronem a otaczającą warstwą satelitarnych komórek glejowych. Przesuwaj pipetę w kierunku neuronu, aż zaobserwujesz "wgłębienie" w neuronie. 
	Uwaga: W porównaniu z zapisami z odłączonych neuronów, dodatnie ciśnienie musi być nieco większe, co pomoże przeniknąć do warstwy komórek glejowych satelity i zwiększy szanse na pomyślne łatanie.</li>
	<li>Zmniejsz nadciśnienie. Następnie uzyskaj uszczelnienie giga omów z delikatnym ssaniem. 
	Uwaga: Dzięki tej metodzie wskaźnik powodzenia nagrywania wynosi co najmniej 70%.</li>
	<li>Uzyskaj konfigurację nagrywania całej komórki, jak opisano wcześniej19.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, przeniknąć przez błonę komórkową neuronu poprzez krótkie, ale silne ssanie. Alternatywnie, użyj funkcji "zap" na amplifier, gdy stosowane jest ssanie.</li>
		<li>Po ustaleniu trybu całego ogniwa skompensuj pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową (Rs), obracając pokrętła kompensacji pojemności i rezystancji na amplifier. 
		Uwaga: Rs wynosi zwykle 5-20 MΩ.</li>
		<li>Porzuć komórkę, jeśli Rs jest początkowo większe niż 30 MΩ lub Rs zmienia się o więcej niż 20% podczas nagrywania. Zmierz również spoczynkowy potencjał błony; porzucić ogniwo, jeśli spoczynkowy potencjał błonowy jest większy niż -50 mV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij okno "Test membranowy". Wybierz tryb "I-clamp normal", obracając pokrętło trybu na amplifier.</li>
	<li>Kliknij "otwórz protokół" w oprogramowaniu, wybierz i załaduj protokół do pomiaru reobazy. Kliknij "nagraj", aby rozpocząć nagrywanie. Zmierz rezystancję wejściową i reozasadę, aby zbadać pobudliwość neuronów, wstrzykując stopniowaną serię prądów depolaryzujących w krokach co 100 pA.
	<ol>
		<li>Kliknij ponownie "otwórz protokół" i wybierz protokół pomiaru progu membranowego. Prąd depolaryzujący o długości 500 ms (2000 pA/s) zostanie wstrzyknięty do neuronu.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do akwizycji i analizy danych (np. Clampfit), aby przeanalizować zarejestrowane ścieżki zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj oprogramowania, aby obliczyć rezystancję wejściową (Rin) na podstawie relacji I-V w stanie ustalonym podczas dostarczanych prądów hiperpolaryzacyjnych. Przesuń kursor, aby zmierzyć wartość progu reozasady i membrany. 
		Uwaga: Amplituda prądu wymagana do indukowania AP jest zdefiniowana jako reozasada, a najniższe napięcie do indukowania AP jest zdefiniowane jako próg membranowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz prądy indukowane ligandem.
	<ol>
		<li>Napełnij pipetę specyficznymi agonistami. 
		Uwaga: W bieżącym raporcie użyliśmy glutaminianu 100 μM i 100 μM AITC do indukcji prądów, w których pośredniczą odpowiednio receptory glutaminianu i receptory TRPA1.</li>
		<li>Sprawdź pipetę, aby upewnić się, że w środku nie ma pęcherzyków powietrza. Umieść pipetę w uchwycie na pipety. Połączyć uchwyt pipety z rurką podłączoną do systemu dozowania leku.</li>
		<li>Użyj manipulatora, aby przesunąć pipetę w odległości nie większej niż 50 μm od neuronu. Ustaw ciśnienie w systemie dozowania leku na 1 psi, a czas trwania na 1 sek. Przełącz tryb nagrywania na napięcie cęgi i clamp na -70 mV. Krótko przyłóż ciśnienie za pomocą systemu dozowania leku, aby zarejestrować prąd indukowany lekiem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139, 267-284 (2009).</li>
<li>Caterina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluN2B+N-methyl-D-aspartate+receptor+and+excitatory+amino+acid+transporter+3+are+upregulated+in+primary+sensory+neurons+after+7+days+of+morphine+administration+in+rats%3A+implication+for+opiate-induced+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia.</a> Pain. 157, 147-158 (2016).</li>
<li>Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+response+to+glutamate+in+small+diameter+dorsal+root+ganglion+neurons+after+sciatic+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury.</a> PloS one. 9, 95491(2014).</li>
<li>Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+neurogenic+inflammation+by+blocking+the+effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).</li>
<li>Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+TNF-alpha+receptor+type+1+upregulation+in+glia+and+neurons+after+peripheral+nerve+injury%3A+studies+in+murine+DRG+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord.</a> Spine. 29, 1082-1088 (2004).</li>
<li>Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channels%2C+excitability+of+primary+sensory+neurons%2C+and+the+molecular+basis+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+nerve%22%5BJournal%5D)">Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain.</a> Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).</li>
<li>Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitability+of+sensory+neurons+in+rats+with+cutaneous+hyperalgesia+produced+by+chronic+compression+of+the+dorsal+root+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion.</a> J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).</li>
<li>Dib-Hajj, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+sodium+channel+expression+in+DRG+neurons+in+the+chronic+constriction+injury+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain.</a> Pain. 83, 591-600 (1999).</li>
<li>Cummins, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+persistent+tetrodotoxin-resistant+sodium+current+in+SNS-null+and+wild-type+small+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons.</a> J Neurosci. 19, RC43(1999).</li>
<li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).</li>
<li>Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+phenotype+plasticity+in+cultured+dissociated+adult+rat+dorsal+root+ganglia%3A+an+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study.</a> J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells%3A+more+than+just+%27rings+around+the+neuron%27%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'.</a> Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).</li>
<li>Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+GABA%28B%29+receptors+potentiates+inward+rectifying+potassium+currents+in+satellite+glial+cells+from+rat+trigeminal+ganglia%3A+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis.</a> Neuroscience. 288, 51-58 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+functional+properties+of+satellite+glial+cells+in+compressed+spinal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia.</a> Glia. 57, 1588-1599 (2009).</li>
<li>Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+compression+of+mouse+dorsal+root+ganglion+alters+voltage-gated+sodium+and+potassium+currents+in+medium-sized+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).</li>
<li>Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Na%2B+and+K%2B+currents+in+small+mouse+dorsal+root+ganglion+neurons+after+ganglion+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression.</a> J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Axon+Guide%22">The Axon Guide</a>. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).</li>
<li>Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp+and+current-clamp+recordings+from+mammalian+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons.</a> Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).</li>
<li>Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+the+intact+dorsal+root+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion.</a> J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).</li>
<li>Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+TTX-resistant+voltage-gated+sodium+channels+Nav1.8+%28SNS%29+and+Nav1.9+%28SNS2%29+in+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons.</a> J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).</li>
<li>Funakoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+TRPV1-expressing+sensory+nerves+in+peripheral+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs.</a> Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).</li>
<li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li>
<li>Yagi, J., Sumino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+a+hyperpolarization-activated+current+by+clonidine+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).</li>
<li>Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+and+functional+characterization+of+primary+somatic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons.</a> J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).</li>
<li>Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+the+trigeminal+ganglion+as+a+determinant+of+orofacial+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podajemy metodę przygotowania całych DRG do badań z użyciem zacisków krosowych. Istnieje kilka kluczowych elementów przygotowania idealnego okazu. Po pierwsze, ważne jest, aby wypreparować DRG z przyczepionymi korzeniami grzbietowymi. Następnie epineurium należy ostrożnie usunąć, unikając uszkodzenia neuronów. Wreszcie, aby odsłonić neurony i otaczające je satelitarne komórki glejowe, konieczne jest strawienie pozostałej tkanki łącznej. Nienaruszone DRG od dorosłych szczurów przygotowane metodą opisaną tutaj zachowają do...

Czucie jest niezbędne dla przetrwania i dobrego samopoczucia organizmu. Przekazywanie bodźców jest zależne od ścieżek czuciowych rozpoczynających się na obwodowych zakończeniach aksonów z pierwotnych neuronów czuciowych. Pierwotne neurony czuciowe, z wyjątkiem jądra śródmózgowia nerwu trójdzielnego, znajdują się w zwojach nerwu trójdzielnego i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Służą jako strażnicy informacji sensorycznej 1. Na błonie okołokarialnej, podobnie jak na końcach centralnych i obwodowych, neurony DRG wyrażają receptory i kanały jonowe, takie jak receptory glutaminianu, receptory alfa TNF, nadrodzina kanałów kationowych 1 o potencjale przejściowym (TRPV1), kanały sodowe itp. 2-7. Zapisy patch clamp błony okołokarialnej pozwalają zrozumieć funkcjonalne zmiany wielu z tych receptorów i kanałów w całym neuronie.
Technika nagrywania patch clamp jest potężnym narzędziem do badania aktywności kanałów lub receptorów i przeprowadzono wiele badań przy zastosowaniu tej techniki na neuronach DRG 8-10. W większości badań DRG jest usuwany poprzez przecięcie korzonków grzbietowych i nerwu rdzeniowego w pobliżu zwoju. Po zmieleniu ganglion jest następnie umieszczany w enzymach trawiennych, które powodują dysocjację neuronów DRG, które mogą być następnie rejestrowane natychmiast lub hodowane przez kilka dni przed nagraniem. Niestety, dysocjacja neuronów DRG wiąże się z konieczną aksotomią w pobliżu perikarya. Po dysocjacji i akskotomii neurony DRG ulegają zmianom fenotypowym, a także zmianom pobudliwości błony 11,12. Utrata kontaktu między perikarya poszczególnych neuronów a satelitarnymi komórkami glejowymi, które normalnie je otaczają, prawdopodobnie przyczynia się do tych zmian 13. Wzajemne oddziaływanie między neuronami a komórkami glejowymi satelitarnymi jest niezbędne zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w adaptacji do stanów patologicznych, takich jak te, które prowadzą do nieuleczalnego bólu 14,15. Wyzwaniem byłoby zbadanie interakcji między neuronami a satelitarnymi komórkami glejowymi przy użyciu zdysocjowanego preparatu DRG.
Nienaruszone DRG, z drugiej strony, zapewniają warunki bliższe in vivo. W ciągu ostatnich kilku lat nasze laboratorium, a także kilka innych grup, używało nienaruszonych DRG od dorosłych szczurów do badania zmian pierwotnych neuronów czuciowych w różnych stanach związanych z przewlekłym bólem 3-5,11,15-17. Chociaż techniki stosowane w tych badaniach są w pewnym stopniu ugruntowane, opis krok po kroku nie został jeszcze opublikowany. W niniejszym manuskrypcie opisujemy wygodny i szybki sposób przygotowania nienaruszonych DRG oraz ich wykorzystanie do nagrań z zaciskiem krosowym.

<table><tbody><tr>Strzykawka <td>pentobarbital sodium</td><td>vortech Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml, 5 ml.</td></tr><tr><td>skalpel</td><td>Rozmiar BD</td><td></td><td>: 15</td></tr><tr><td>Nożyczki proste Mayo</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki Mayo</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14011-15</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia naukowe</td><td>Rongeur</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zębate Adson</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Noyes</td><td>Fine Science Tools</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do kości</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td>Specjalne do cięcia kości.</td></tr><tr><td>Kleszcze: Dumont, Dumoxel Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>Mają cienkie końcówki, które nie wymagają ostrzenia przy pierwszym zakupie.</td></tr><tr><td>elewator okostnej</td><td>Sklar</td><td>97-0530</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>WILD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>marki Fisher</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (10 cm)</td><td>Szalka Petriego ze szkła Pyrex</td><td></td><td>pozwala uniknąć uszkodzenia końcówek cienkich kleszczyków</td></tr><tr><td>Kolagenaza (Liberase TM)</td><td>Roche</td><td>05-401-119-001</td><td>rozpuścić w stężeniu 13 j./ml, podwielokrotność w szklanej pipecie. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>filtr</td><td>Thermo scientific</td><td>7232520</td><td>Filtruj wewnętrzne roztwory do nagrywania zacisku krosowego, aby uniknąć zatkania.</td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Anchor</td><td>Havard</td><td>aparat 64-0250</td><td>stabilizuje DRG, aby uniknąć dryftu.</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Mikroskop 1440D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Mikromanipulator</td> Mikromanipulator <td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>MPC200</td><td></td></tr><tr><td> system dozowania</td><td>Zawór ogólny</td><td>System szybkiego podawania leków</td><td>Picrospitzer II</td></tr><tr><td>Carbogen (95% O2, 5% CO2)</td><td>Lokalny dostawca</td><td></td><td></td> gazów medycznych</tr></tbody></table>

nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Badania nad klamrami z neuronów zwojów korzenia grzbietowego (DRG) poszerzyły naszą wiedzę na temat obwodowego układu nerwowego. Obecnie większość nagrań przeprowadzana jest na zdysocjowanych neuronach DRG, co jest standardem dla większości laboratoriów. Właściwości neuronalne mogą jednak zostać zmienione przez uszkodzenie aksonów wynikające z trawienia enzymatycznego używanego do pozyskiwania zdysocjowanych neuronów. Co więcej, zdysocjowane preparaty neuronów nie mogą w pełni reprezentować mikrośrodowiska DRG, ponieważ utrata kontaktu z satelitarnymi komórkami glejowymi, które otaczają pierwotne neurony czuciowe, jest nieuniknioną konsekwencją tej metody. Aby przezwyciężyć ograniczenia w stosowaniu konwencjonalnych zdysocjowanych neuronów DRG do nagrań patch clamp, w niniejszym raporcie opisujemy metodę przygotowania nienaruszonych DRG i przeprowadzenia nagrań patch clamp na poszczególnych pierwotnych neuronach czuciowych ex vivo. Takie podejście pozwala na szybkie i proste przygotowanie nienaruszonych DRG, naśladując warunki in vivo poprzez utrzymywanie neuronów DRG w powiązaniu z otaczającymi je satelitarnymi komórkami glejowymi i błoną podstawną. Co więcej, metoda ta pozwala uniknąć uszkodzeń aksonów w wyniku manipulacji i trawienia enzymatycznego, np. podczas dysocjacji DRG. Ten preparat ex vivo może być dodatkowo stosowany do badania interakcji między pierwotnymi neuronami czuciowymi a satelitarnymi komórkami glejowymi.

Rysunek 1 przedstawia proces przygotowania nienaruszonych zwojów korzeni grzbietowych (DRG) do rejestracji metodą patch-clamp. Rysunek 1A pokazuje odsłonięcie i lokalizację zwojów po laminektomii. Rysunek 1B przedstawia zwoje DRG L3, L4 i L5 z przytwierdzonymi korzeniami nerwowymi po usunięciu rdzenia kręgowego. Następnie zwoje DRG L4 i L5 są ostrożnie preparowane i uwalniane z kręgów. W kolejnym kroku usuwa się epineurium, czyli przezroc...

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest przedstawienie metod przygotowania nienaruszonych zwojów korzeni grzbietowych oraz przeprowadzenie rejestracji metodą patch clamp z wykorzystaniem tego preparatu. Metoda ta umożliwia rejestrację z pojedynczej komórki w nienaruszonych zwojach korzeni grzbietowych podczas stymulacji wchodzącego nerwu rdzeniowego lub wychodzącego korzenia grzbietowego. Podejście to jest szczególnie przydatne podczas badania roli pierwotnych neuronów sensorycznych w odczuwaniu bólu.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zachowanie zarówno neuronów, jak i sąsiadujących satelitarnych komórek glejowych. Dzięki temu preparat ten bardziej przypomina sytuację in vivo. W tej procedurze, po znieczuleniu szczura, należy ogolić jego obszar lędźwiowy.Następnie nacinamy skórę i tkankę podskórną wzdłuż linii środkowej. Potem, używając cienkiego elewatora okostnowego, odrywamy mięśnie przykręgosłupowe od wyrostków kolczystych na poziomie od L1 do S2. Następnie odcinamy wyrostki kolczyste od L1 do S2. W dalszej kolejności wykonujemy dwa cięcia poprzeczne w odsłoniętej kolumnie kręgowej, mniej więcej na poziomie L1 i S1, a następnie usuwamy ten segment kolumny

patch-clamp-recordings-on-intact-dorsal-root-ganglia-from-adult-rats

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Inhibicyjne presynaptyczne GABAergiczne jest potężnym mechanizmem hamującym w rdzeniu kręgowym, ważnym dla integracji sygnałów motorycznych i czuciowych w sieciach rdzenia kręgowego. Podstawową pierwotną depolaryzację aferentną można zmierzyć poprzez rejestrację potencjałów korzenia grzbietowego (DRP). Tutaj demonstrujemy metodę rejestracji in vivo DRP u myszy.

Pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Naucz się techniki patch clamp na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura. Ta metoda zachowuje mikrośrodowisko neuronów i komórek glejowych, umożliwiając dokładne badania elektrofizjologiczne mechanizmów bólu.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Przeglądaj więcej filmów