Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wprowadzenie metod przygotowania nienaruszonych zwojów korzenia grzbietowego oraz przeprowadzenie zapisu klamry łatowej przy użyciu tego preparatu. Metoda ta umożliwia rejestrację pojedynczej komórki z nienaruszonych zwojów korzenia grzbietowego przy jednoczesnej stymulacji wchodzącego nerwu rdzeniowego lub wychodzącego korzenia grzbietowego. Takie podejście jest szczególnie przydatne podczas badania udziału pierwotnych neuronów czuciowych w bólu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że utrzymuje ona zarówno neurony, jak i sąsiednie satelitarne komórki glejowe. Dlatego ten preparat jest bliższy sytuacji in vivo. W tej procedurze, po znieczuleniu szczura, należy ogolić jego odcinek lędźwiowy.

Następnie naciąć skórę i tkankę podskórną wzdłuż linii środkowej. Następnie odłącz mięśnie okołordzeniowe od wyrostków kolczystych na poziomie od L1 do S2 za pomocą drobnej windy okostnej. Następnie przetnij wyrostki kolczyste od L1 do S2. Następnie wykonaj dwa poprzeczne nacięcia w odsłoniętym kręgosłupie w przybliżeniu L1 i S1 i usuń ten segment kręgosłupa en bloc.

Następnie szybko zanurz go w zimnym CSF na dwie do trzech minut. Następnie spłucz krew z usuniętego kręgosłupa i przenieś kręgosłup na szalkę Petriego z zimnym aCSF, a następnie użyj drobnego rongeur do usunięcia blaszek. Przetnij oponę twardą wzdłuż linii środkowej za pomocą mikronożyczek, aby odsłonić rdzeń kręgowy.

Następnie przenieś pozostały kręg z DRG na drugą szalkę Petriego wypełnioną zimnym aCSF. Zidentyfikuj DRG L4 i L5 na podstawie ich względnego położenia w stosunku do wyrostków poprzecznych i nerwu kulszowego. Następnie uwolnij DRG z otaczających tkanek łącznych i utrzymuj korzeń nerwowy i nerw rdzeniowy przyczepione do DRG.

Następnie przenieś DRG na trzecią szalkę Petriego w celu dalszej sekcji. Wytnij otwór, w którym korzenie grzbietowe i brzuszne łączą się z DRG i oddziel od niego korzeń brzuszny. Następnie użyj kleszczy z końcówkami, aby przytrzymać epineurium i użyj innych cienkich kleszczy, aby wytoczyć DRG z epineurium.

Kontynuuj usuwanie jak największej ilości epineurium, które jest przyczepione do DRG. Teraz przenieś DRG do komory nagrywającej. Upewnij się, że strona DRG, z której pochodzą korzenie nerwowe, jest skierowana w dół.

Następnie ustabilizuj DRG za pomocą kotwicy. Następnie perfaktoruj DRG z natlenionym aCSF przez plastikowe rurki połączone pompą perystaltyczną i pozwól komórkom odzyskać siły przez 30 minut. Po 30 minutach oceń jakość DRG pod optyką IR-DIC przy 40-krotnym powiększeniu za pomocą kamery CCD.

Indywidualnie podłączono dwie jednomililitrowe strzykawki do uchwytów na pipety za pomocą dwóch kawałków gumowej rurki o małej średnicy. Następnie umieść jedną szklaną pipetę wypełnioną kolagenazą w jednym z uchwytów na pipety, a pustą szklaną pipetę w drugim. Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść pipety tuż nad DRG.

Delikatnie zderzyj końcówki dwóch pipet ze sobą, aby powiększyć otwory końcówek pipet. Następnie przesuń pipetę wypełnioną kolagenazą blisko powierzchni DRG. Krótko przyłożyć nadciśnienie do pipety zawierającej kolagenazę przez rurkę łączącą uchwyt i strzykawkę, przesuwając tłok o około 0,5 mililitra.

Po 10 do 15 minutach, gdy zaobserwuje się resztki pozostałego epineurium, należy delikatnie podcisnąć pustą pipetę, aby odessać zanieczyszczenia. W ten sposób neurony i otaczające je satelitarne komórki glejowe będą wyraźnie odsłonięte i gotowe do rejestracji plam. W tej procedurze umieść roztwór elektrody na lodzie, aby zapobiec degradacji.

Następnie napełnij szklaną pipetę z plastrem przefiltrowanym roztworem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść pipetę w uchwycie na pipety stopnia głównego. Delikatnie wycisnąć pipetę za pomocą pięciomililitrowej strzykawki, przesuwając tłok o około jeden mililitr przed opuszczeniem pipety do roztworu do kąpieli.

Następnie wybierz tryb V-Clamp na wzmacniaczu i otwórz interfejs testu membranowego w oprogramowaniu. Pod mikroskopem przesuń pipetę bliżej docelowego neuronu. Następnie zastosuj dodatnie ciśnienie z pipety, aby przejść przez satelitarną warstwę komórek glejowych, aż do zaobserwowania nagłego powiększenia przestrzeni między neuronem a otaczającą warstwą satelitarnych komórek glejowych.

Następnie przesuwaj pipetę w kierunku neuronu, aż zaobserwuje się wgłębienie w neuronie. W naszym preparacie neurony są otoczone satelitarnymi komórkami glejowymi. Dlatego, aby przeniknąć do warstw komórek glejowych i dotrzeć do pojedynczych neuronów, pipeta rejestrująca jest utrzymywana pod wysokim dodatnim ciśnieniem.

Następnie zmniejsz nadciśnienie. Osiągnij uszczelnienie giga-omowe z delikatnym ssaniem. Aby uzyskać konfigurację zapisu całej komórki, należy przeniknąć przez błonę komórkową neuronu za pomocą krótkiego, ale silnego ssania.

Alternatywnie, użyj funkcji zap na amplifier, gdy stosowane jest ssanie. Po ustaleniu trybu całego ogniwa skompensuj pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową, obracając pokrętła kompensacji pojemności i rezystancji na wzmacniaczu. Następnie zamknij okno testu membrany.

Wybierz I-Clamp Normal Mode, obracając pokrętło trybu na amplifier. Następnie kliknij Otwórz protokół w oprogramowaniu. Wybierz i załaduj protokół pomiaru reobazy i kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie.

Aby zbadać pobudliwość neuronów, zmierz rezystancję wejściową i reozasadę, wstrzykując stopniowaną serię prądów depolaryzujących w krokach co 100 pikoamperów. Następnie ponownie kliknij Otwórz protokół i wybierz protokół pomiaru progu membrany. Następnie wstrzyknij do neuronu 500-milisekundowy prąd depolaryzujący rampy.

Aby zarejestrować prądy indukowane ligandem, napełnij pipetę określonymi agonistami. Sprawdź pipetę, aby upewnić się, że w środku nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie umieść pipetę w uchwycie na pipety, który jest podłączony do systemu dozowania leku.

Użyj manipulatora, aby przesunąć pipetę na odległość do 15 mikrometrów od neuronu. Ustaw ciśnienie w systemie dozowania leku na jeden PSI, a czas trwania na jedną sekundę. Następnie przełącz tryb nagrywania na napięcie cęgi przy 70 miliwoltach.

Na krótko przyłóż ciśnienie za pomocą systemu dozowania leku, aby zarejestrować prąd indukowany lekiem. Na tym rysunku reozasada została zmierzona poprzez wstrzyknięcie serii prądów do neuronu DRG. Najmniejsze natężenie prądu, które może indukować potencjał czynnościowy, definiuje się jako reozasadę, jak wskazuje strzałka.

Reozasada dla tego neuronu wynosi 300 pikoamperów. Próg membrany mierzono poprzez wstrzyknięcie prądu narastającego. Potencjał definiuje się jako próg błonowy, gdy wywoływany jest potencjał czynnościowy.

Próg błonowy dla tego neuronu wynosi 11,9 miliwolta. Na tym rysunku prądy były indukowane przez zaciągnięcie się glutaminianem lub AITC przez jedną sekundę. Obaj agoniści indukowali prądy wewnętrzne, co sugeruje obecność receptorów glutaminianu i receptorów TRPA-1 na małych neuronach DRG.

Po opanowaniu tej techniki można zakończyć w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o usunięciu epineurium i utrzymaniu wysokiego ciśnienia w pipecie rejestrującej. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić rejestrację patch clamp na satelitarnych komórkach glejowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak receptory i kanały w satelitarnych komórkach glejowych.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się bólem do zbadania udziału zwojów korzenia grzbietowego w nocycepcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować całe zwoje korzenia grzbietowego, a następnie jak załatać zacisk z pojedynczych komórek na tych całych zwojach korzenia grzbietowego.