Przygotowanie utrwalonych w formalinie rdzeni tkankowych zatopionych w parafinie do ekstrakcji RNA i DNA

Ogólnym celem tej procedury jest sekwencyjna ekstrakcja RNA i DNA z archiwalnych rdzeni tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie. Jest to protokół pobierania rdzeni tkankowych, z których będziemy ekstrahować zarówno RNA, jak i DNA. Główną zaletą tego protokołu jest to, że poprawia on wydajność RNA i DNA z precyzyjnie docelowych regionów w bloku tkankowym.

Procedura ta jest w dużej mierze opracowana w archiwalnych tkankach raka gruczołu krokowego. Może być również stosowany do innych rodzajów tkanek archiwalnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy rdzeniowania tkanek nie są powszechnie stosowane w laboratoriach badawczych.

Większość laboratoriów badawczych używa zamiast tego przekrojów poprzecznych, co powoduje szybsze wyczerpywanie tkanek i dodaje do próbki znaczną niejednorodność. Zacznij od przejrzenia szkiełka mikroskopowego i obrysowania obszaru zainteresowania za pomocą markera permanentnego z drobnym punktem. Następnie wytnij odcinek filmu parafinowego wystarczająco duży, aby pokryć obszar zainteresowania na szkiełku mikroskopowym.

Następnie mocno przyłóż folię do szkiełka, owijając folię na krawędziach, aby się nie ślizgała. Za pomocą markera permanentnego z drobnym punktem obrysuj całą tkankę i obszar zainteresowania w tkance. Następnie usuń folię ze szkiełka i przenieś ją do odpowiedniego bloku tkanki.

Zorientuj folię, odwracając ją lub obracając tak, aby kontur całej tkanki odpowiadał obserwowanemu kształtowi tkanki w bloku. Mocno dociśnij odcinek folii do powierzchni bloku, aby zapobiec poślizgowi. Za pomocą końcówki markera permanentnego wykonaj płytkie, ale widoczne wgłębienia wzdłuż konturu obszaru zainteresowania, a następnie usuń film.

Następnie oczyść stempel receptorowy z zestawu stemple 0,6 milimetra, zanurzając końcówkę w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej jeden mililitr wybielacza i kilkakrotnie przesuwając stempel w górę iw dół. Powtórz mycie z tubką zawierającą 70 procent etanolu, a następnie wodą. Teraz wciśnij oczyszczony stempel w obszar zainteresowania na głębokość trzech milimetrów i wycofaj.

Uwolnij rdzeń do nisko wiążącej mikroprobówki wirówkowej, wypychając ją z stempla za pomocą rysika. Dodaj jeden mililitr ksylenu do probówek do mikrofuge zawierających rdzenie tkanek i energicznie wiruj przez dziesięć sekund. Następnie umieść w bloku grzewczym ustawionym na 50 stopni Celsjusza na trzy minuty.

Po inkubacji wirować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Po odwirowaniu umieść rdzenie na lodzie na pięć minut, aby zestalić woskową pozostałość. Teraz ostrożnie usuń parafinę, która nagromadziła się wokół menisku wraz z supernatantem za pomocą końcówki pipety.

Następnie powtórzyć zabieg z użyciem ksylenu. Po usunięciu mieszanki parafiny ksylenu dodaj jeden mililitr 100-procentowego etanolu i energicznie wiruj przez dziesięć sekund. Po odwirowaniu z maksymalną prędkością przez dwie minuty ostrożnie wyrzuć etanol.

Powtórzyć płukanie etanolem jeszcze raz przed rozpoczęciem homogenizacji. Ponownie zawiesić odparafinowane rdzenie w 700 mikrolitrach 100-procentowego etanolu przed homogenizacją. Użyj zmotoryzowanego homogenizatora tkankowego na średnim ustawieniu, aby zmielić rdzenie na drobne cząstki.

Dokładna homogenizacja rdzeni tkanek jest wymagana dla optymalnej wydajności DNA i RNA. Następnie napełnij oddzielne 15-mililitrowe probówki około dziesięcioma mililitrami wybielacza, roztworem neutralizującym RNazę i 70-procentowym etanolem. Po homogenizacji próbki umyj sondę homogenizatora w każdym z roztworów czyszczących w podanej kolejności.

Uruchom homogenizator na najwyższych obrotach podczas etapu mycia. Przetrzyj sondę chusteczką i pozwól sondzie całkowicie wyschnąć przed homogenizacją następnej próbki. Sprawdź wzrokowo ostrza sondy pod kątem resztek tkanek, a jeśli zostaną znalezione, ponownie wyczyść sondę.

Po homogenizacji doprowadzić objętość próbki do jednego mililitra ze 100-procentowym etanolem, a następnie odwirować z maksymalną prędkością przez 15 minut. Ostrożnie zassać etanol i wysuszyć granulki na powietrzu przez około 15 do 20 minut przed rozpoczęciem ekstrakcji proteinazy K. Ponownie zawiesić granulki w 150 mikrolitrach buforu do wytrawiania proteinazy K i potrząśnij rurkami, aby poluzować osad.

Trawienie proteinazy K przez noc jest zalecane w celu szybszego odzyskania DNA. Dodaj 10 mikrolitrów stabilnej temperaturowo proteinazy K i wymieszaj, trzepiąc. Inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 15 minut z łagodnym mieszaniem.

Inkubować probówki na lodzie przez trzy minuty. Po schłodzeniu odwirować probówkę przez 15 minut z maksymalną prędkością. Następnie, nie naruszając osadów, ostrożnie przenieś każdy supernatant do nowej probówki mikrowirówki w celu oczyszczenia RNA.

Ekstrakcja RNA i DNA przy użyciu zoptymalizowanej procedury opisanej w pisemnym protokole, która obejmuje wydłużony czas trawienia tkanek w celu ekstrakcji DNA. Za pomocą tej metody można odzyskać RNA i DNA ze starszych próbek tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie. Kwasy nukleinowe ekstrahowano z próbek raka prostaty w wieku od 3 do 14 lat.

Średnia wydajność wyniosła 2 270 nanogramów RNA i 820 nanogramów DNA. Co ciekawe, nie stwierdzono istotnej korelacji między wiekiem próbki tkanki a odzyskiwaniem kwasów nukleinowych. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność RNA i DNA była skorelowana między próbkami, chociaż w większości przypadków odzyskano ponad dwa razy więcej RNA w stosunku do DNA.

Aby zademonstrować wydajność genomowego DNA wyekstrahowanego za pomocą tego protokołu, ekstrakty DNA przekształcone w wodorosiarczyn z archiwalnych próbek raka prostaty amplifikowano za pomocą PCR specyficznego dla metylacji. Powtarzalne elementy ALU zastosowano jako kontrolę metylacji i wykazały niewielką zmienność między próbkami. GSTP1, gen, o którym wiadomo, że jest hipermetylowany w raku prostaty, nie wykazał wykrywalnej amplifikacji przez PCR specyficzny dla metylacji, gdy użyto DNA wyekstrahowanego z łagodnych próbek.

Próbki DNA od pacjentów z agresywnym rakiem gruczołu krokowego wykazywały wykrywalne wartości progowe cyklu QPCR, które były niższe niż w przypadku komórek powolnego raka prostaty, co wskazuje na zwiększoną metylację GSTP1 w agresywnym raku gruczołu krokowego. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin w przypadku RNA, a po nocnym trawieniu, w ciągu czterech godzin w przypadku DNA, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Technika ta powinna umożliwić naukowcom zajmującym się patologią molekularną zbadanie diagnostycznych biomarkerów DNA i RNA w różnych nowotworach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować rdzenie tkanek do ekstrakcji DNA i RNA z precyzyjnie zmapowanych obszarów zainteresowania w archiwalnych blokach tkankowych.