Name: Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj mechanizm przejścia śródbłonka rogówki in vitro i in vivo przy użyciu modeli kultury komórek bydlęcych oraz szczurzego modelu kriourazowego. Ta metoda umożliwia badanie regeneracji śródbłonka rogówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy personelowi Drugiego Laboratorium Podstawowego, Departamentu Badań Medycznych, Narodowego Tajwańskiego Szpitala Uniwersyteckiego za ich wsparcie techniczne.

Wszystkie procedury zastosowane w tym badaniu były zgodne z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego na Tajwanie.
1. Izolacja, przygotowanie hodowli pierwotnej i barwienie immunologiczne bydła CEC
<ol>
	<li>Zdobądź świeże oczy bydlęce z lokalnej rzeźni.</li>
	<li>Zdezynfekuj oczy w 10% w/v roztworze jodu powidonu przez 3 minuty. Przemyj je roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Zbierz guzik rogówki skalpelem i nożyczkami w sterylnych warunkach. Oderwij błonę Descemeta kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym (zauważ, że w tym badaniu oczy bydła zostały wyłuszczone przez lokalną rzeźnię; dlatego pierwszą procedurą badawczą była dezynfekcja oczu preenucleated w laboratorium).</li>
	<li>Inkubować błonę Descemeta w 1 ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zebrać bydlęce CEC przez odwirowanie przy 112 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki w 1 ml uzupełnionego hormonalnego podłoża nabłonkowego (SHEM) zawierającego równe objętości zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle z buforem HEPES i pożywki F12 Ham's, uzupełnione 5% płodową surowicą bydlęcą, 0,5% dimetylosulfotlenku, 2 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 5 mg/ml insuliny, 5 mg/ml transferyny, 5 ng/ml selenu, 1 nmol/l toksyny, 50 mg/ml gentamycyny i 1,25 mg/ml amfoterycyny B.</li>
	<li>Zasiaj komórki (około 1 x 10,5 komórek na oko) w naczyniu o średnicy 6 cm. Hoduj je w SHEM. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w powietrzu. Zmieniaj pożywkę co 3 dni.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną zbieżność, umyć je w PBS i inkubować w 1 ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zebrać je przez odwirowanie w stężeniu 112 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml SHEM.
	<ol>
		<li>Policz komórki w hemocytometrze. Zasiać komórki na szkiełkach przykrywkowych o gęstości 1 x 104 na dołek na płytce 24-dołkowej i wyhodować komórki w SHEM. W celu zbadania wpływu marimastatu na tłumienie EnMT, należy inkubować komórki w SHEM z 10 μM marimastatu dodanymi do pożywki hodowlanej i zmieniać pożywkę co 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwal komórki we wskazanym punkcie czasowym za pomocą 250 μl 4% paraformaldehydu o pH 7,4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczać 250 μl 0,5% Triton X-100 przez 5 min. Blok z 10% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 min.</li>
	<li>Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko aktywnej beta-kateninie (ABC), ślimakowi i ślimakowi przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczenie zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych wynosi 1:200. Przeciwciała rozcieńcza się w rozcieńczalniku przeciwciał składającym się z 10 mM PBS, 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej i 0,09% w/v azydku sodu.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS przez 15 minut i inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorem Alexa (1:100 w rozcieńczalniku przeciwciała) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przeciwbarwić jądro komórkowe, pokrywając komórki 2 μg / ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu, umyć komórki dwukrotnie PBS przez 15 minut i zamontować je roztworem montażowym zapobiegającym blaknięciu.</li>
	<li>Uzyskanie obrazów immunofluorescencyjnych przy długościach fal wzbudzenia 405 i 488 nm za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z 20-krotnym powiększeniem obiektywu.</li>
</ol>
2. Model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura i wstrzyknięcie dokomorowe
<ol>
	<li>Znieczulenie 12-tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley za pomocą domięśniowych wstrzyknięć 2% ksylazyny (5,6 mg/kg) i tiletaminy oraz zolazepamu (18 mg/kg). Delikatnie uszczypnij skórę zwierząt, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie w przypadku braku drgania skóry.</li>
	<li>Wkropl jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy do prawego oka każdego szczura, aby zminimalizować ból oczu i odruch mrugania. Wkraplać maść tetracyklinową do lewego oka, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Schłodzić sondę ze stali nierdzewnej (średnica = 3 mm) w ciekłym azocie. Przyłóż sondę ze stali nierdzewnej do środkowej rogówki prawego oka na 30 sekund. Często wkraplaj PBS do prawego oka podczas zabiegu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Wkraplać 0,1% atropiny i 0,3% siarczanu gentamycyny natychmiast po kriourazie i raz dziennie, aby złagodzić ból oka wynikający ze skurczu rzęsek i zapobiec infekcji.
	<ol>
		<li>Po zabiegu utrzymuj szczury w cieple za pomocą lampy grzewczej i obserwuj ich regenerację co 15 minut po znieczuleniu, aż odzyskają kontrolę motoryczną. Dodatkowo nałóż maść tetracyklinową na prawe oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w okresie rekonwalescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzaj kriouraz rogówki przez 3 kolejne dni.</li>
	<li>W celu dostarczenia marimastatu lub bFGF do przedniej komory oczu szczura, należy znieczulić szczury zgodnie z wcześniejszym opisem. Wkraplan jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy do prawego oka, aby zminimalizować ból oczu i odruch mrugania.</li>
	<li>Przepłukać powierzchnię oka sterylnym PBS. Wykonać paracentezę komory przedniej pod mikroskopem operacyjnym, wprowadzając igłę 30 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml w przezroczystej rogówce przylimbowej w płaszczyźnie powyżej i równolegle do tęczówki.</li>
	<li>Obróć igłę do góry i lekko wciśnij ranę rogówki, aby odsączyć trochę cieczy wodnistej i zmniejszyć ciśnienie wewnątrzgałkowe. Wstrzyknąć 0,02 ml leku domiejscowo. Podczas wyjmowania igły delikatnie ścisnąć przewód igły bawełnianą końcówką.</li>
	<li>Sfotografuj oko zewnętrzne we wskazanym punkcie czasowym pod mikroskopem operacyjnym.</li>
</ol>
3. Zbieranie guzika rogówki szczura i barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Aby poddać szczury eutanazji, umieść je w komorze eutanazyjnej i wlej 100% CO2 z szybkością napełniania 10-30% objętości komory na minutę. Utrzymuj wlew CO2 przez dodatkową minutę po braku oddychania i wyblakłym kolorze oczu.</li>
	<li>Przebij oko szczura na rąbku ostrym ostrzem. Przetnij rogówki nożyczkami rogówkowymi wzdłuż rąbka. Spłaszcz rogówki na szkiełku. Wykonaj dodatkowe promieniste nacięcia, jeśli rogówka zwija się.</li>
	<li>Utrwalić rogówki za pomocą 250 μl 4% paraformaldehydu o pH 7,4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczać 250 μl 0,5% Triton X-100 przez 5 min, a blokować 10% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 min.</li>
	<li>Inkubować rogówki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko ABC przez noc w temperaturze 4 °C w rozcieńczalniku 1:200 w rozcieńczalniku przeciwciał. Przemyć rogówki dwukrotnie PBS przez 15 minut i inkubować je z przeciwciałem drugorzędowym (1:100 w rozcieńczalniku przeciwciała) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przeciwbarwić jądro komórkowe, pokrywając komórki 2 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu i dwukrotnie przemywać komórki PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Zamontuj rogówki w roztworze montażowym zapobiegającym blaknięciu. Uzyskaj obrazy immunofluorescencyjne przy długościach fal wzbudzenia 405 i 561 nm za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego przy 20-krotnym powiększeniu obiektywu.</li>
</ol>

<ol><li>Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+the+fluid+pump+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The location of the fluid pump in the cornea.</a> J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).</li>
<li>Joyce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+capacity+of+the+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferative capacity of the corneal endothelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).</li>
<li>Morishige, N., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bullous+keratopathy+as+a+progressive+disease%3A+evidence+from+clinical+and+laboratory+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies.</a> Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).</li>
<li>Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophakic+bullous+keratopathy%3A+relationship+with+endothelial+cell+density+and+use+of+a+predictive+cell+loss+model.+A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report.</a> Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).</li>
<li>Wilson, S. E., Lloyd, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+its+receptor%2C+basic+fibroblast+growth+factor%2C+transforming+growth+factor+beta-1%2C+and+interleukin-1+alpha+messenger+RNA+production+in+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).</li>
<li>Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta2+in+aqueous+humor+suppresses+S-phase+entry+in+cultured+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).</li>
<li>Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA%3A+a+promoter+of+proliferation+in+human+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).</li>
<li>Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+corneal+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth of human corneal endothelial cells in culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).</li>
<li>Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+endothelial+cell+expansion+for+corneal+endothelium+transplantation%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview.</a> Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).</li>
<li>Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+in+human+corneal+endothelial+cells+cultured+from+young+and+older+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors.</a> Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).</li>
<li>Ko, M. K., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+FGF-2+on+type+I+collagen+expression+during+endothelial+mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).</li>
<li>Lee, H. T., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-2+induced+reorganization+and+disruption+of+actin+cytoskeleton+through+PI+3-kinase%2C+Rho%2C+and+Cdc42+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells.</a> Mol Vis. 9, 624-634 (2003).</li>
<li>Pipparelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Enhances+Adhesion+and+Wound+Healing+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells.</a> PloS one. 8 (4), e62095(2013).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li>
<li>Jakobiec, F. A., Bhat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrocorneal+membranes%3A+a+comparative+immunohistochemical+analysis+of+keratocytic%2C+endothelial%2C+and+epithelial+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins.</a> Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ZEB1+and+Snail1+in+excessive+production+of+extracellular+matrix+in+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+on+primate+corneal+endothelial+cell+survival+in+vitro+by+a+ROCK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).</li>
<li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li>
<li>Ho, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Matrix+Metalloproteinase+Activity+Reverses+Corneal+Endothelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+and+fibronectin+synthesis+by+retrocorneal+fibrous+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signal+Regulates+Corneal+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+Inhibitor+Eye+Drop+Accelerates+Corneal+Endothelium+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).</li>
<li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier%3A+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

CEC są znane ze swojej skłonności do ulegania EnMT podczas proliferacji komórek. Aby opracować strategie tłumienia procesu EnMT w celach terapeutycznych, konieczne jest dokładne zrozumienie mechanizmu EnMT. Opisaliśmy 2 modele do badania EnMT, a mianowicie model hodowli bydła CEC in vitro i model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura. Nasze wyniki pokazały proces EnMT w obu modelach. Co więcej, efekt tłumienia EnMT marimastatu został odtworzony w obu modelach, co sugeruje, że te 2 modele mają ten sam mechan...

Komórki śródbłonka rogówki (CEC) odgrywają istotną rolę w utrzymaniu czystości rogówki, a tym samym ostrości widzenia, regulując stan nawodnienia zrębu rogówki poprzez aktywne pompowanie1. Ze względu na ograniczony potencjał proliferacyjny ludzkich CEC, liczba komórek zmniejsza się wraz z wiekiem, a naprawa ran śródbłonka rogówki po urazie odbywa się zwykle poprzez powiększenie i migrację komórek, a nie mitozę komórek2. Gdy liczba CEC spada poniżej progu około 500 komórek/mm2, stan odwodnienia zrębu rogówki nie może być utrzymany, co prowadzi do keratopatii pęcherzowej i upośledzenia wzroku3,4.
Ograniczony potencjał proliferacyjny ludzkich CEC został przypisany kilku czynnikom, w tym zmniejszonej ekspresji naskórkowego czynnika wzrostu i jego receptora w starzejących się komórkach5, antyproliferacyjnemu TGFβ2 w cieczy wodnistej6 i hamowaniu kontaktu2,7. Chociaż niektóre czynniki wzrostu, takie jak podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), mogą zwiększać proliferację w hodowanym ludzkim śródbłonku rogówki, wydajność hodowli pozostaje ograniczona8,9. Ponadto CEC mogą ulegać zmianie fenotypowej podczas ekspansji ex vivo, przypominającej przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT)10-13. Przejście śródbłonkowo-mezenchymalne (EnMT) charakteryzuje się destabilizacją połączeń komórkowych, utratą polaryzacji wierzchołkowo-podstawnej, rearanżacją cytoszkieletu, ekspresją aktyny mięśni gładkich alfa i wydzielaniem kolagenu typu I14. Wszystkie te cechy mogą zakłócić normalne funkcjonowanie CEC, utrudniając stosowanie CEC hodowanych ex vivo w inżynierii tkankowej. Ponadto EnMT jest związany z patogenezą kilku chorób śródbłonka rogówki, w tym dystrofii śródbłonka rogówki Fuchsa i tworzenia błony zarogówkowej15,16. W związku z tym zrozumienie mechanizmu EnMT może pomóc w manipulowaniu procesem EnMT i ułatwić regenerację CEC w celu umożliwienia kompetentnego funkcjonowania. 
W tym badaniu opisaliśmy metodę izolowania bydlęcych CEC od guzika rogówki. W hodowli pierwotnej in vitro zaobserwowano proces EnMT, w tym zmianę fenotypową, translokację jądrową β-kateniny oraz regulatory EMT ślimaka i ślimaka. Dalej opisaliśmy metodę demonstrowania EnMT in vivo przy użyciu modelu kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura. Korzystając z tych 2 modeli, wykazaliśmy, że marimastat, inhibitor metaloproteinazy macierzowej (MMP) o szerokim spektrum działania, może hamować proces EnMT. Opisane protokoły ułatwiają szczegółową analizę mechanizmu EnMT oraz opracowanie strategii manipulowania procesem EnMT w celu dalszego zastosowania klinicznego.

<table><tbody><tr><td>trypsyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle i pożywka Ham's F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ludzki naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>insulina, transferyna, selen&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>toksyna</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>amfoterycyna B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>mikroskopia elektronowa 111219</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>marimastat</td><td>Sigma</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>antyaktywne przeciwciało beta-kateniny</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciw ślimakom</td><td>Santa cruz</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciw ślimakom</td><td>Santa cruz</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) wtórne przeciwciało</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>do barwienia ABC bydlęcych CEC</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) drugorzędowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td><td>do barwienia ABC śródbłonka rogówki szczura</td></tr><tr><td>kozła przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>do barwienia ślimaków i ślimaków bydlęcych CEC</td></tr><tr><td>rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Genemed Biotechnologies</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>podłoże montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>ksylazyna&nbsp;</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tiletamine plus zolazepam</td><td>Virbac</td><td>N/A lek</td><td>weterynaryjny</td></tr><tr><td>chlorowodorek proparakainy roztwór okulistyczny</td><td>Alcon</td><td>N/A lek</td><td>weterynaryjny</td></tr><tr><td>0,1% atropiny</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>Nie dotyczy</td><td>leku klinicznego&nbsp;</td></tr><tr><td>0,3% siarczan gentamycyny</td><td>Sinphar Group</td><td>N/A</td><td>lek kliniczny&nbsp;</td></tr><tr><td>podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>lek kliniczny&nbsp;</td></tr></tbody></table>

modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Komórki śródbłonka rogówki (CEC) odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu czystości rogówki poprzez aktywne pompowanie. Zmniejszona liczba CEC może prowadzić do obrzęku rogówki i pogorszenia ostrości wzroku. Jednak ludzkie CEC są podatne na upośledzony potencjał proliferacyjny. Ponadto stymulacja wzrostu komórek jest często komplikowana przez stopniowe przejście śródbłonkowo-mezenchymalne (EnMT). W związku z tym zrozumienie mechanizmu EnMT jest niezbędne do ułatwienia regeneracji CEC o kompetentnej funkcji. W tym badaniu przygotowaliśmy pierwotną hodowlę CEC bydła poprzez obieranie CEC za pomocą błony Descemeta z guzika rogówki i wykazaliśmy, że CEC bydła wykazywały proces EnMT, w tym zmianę fenotypową, translokację jądrową β-kateniny oraz regulatory EMT ślimaka i ślimaka, w hodowli in vitro. Ponadto wykorzystaliśmy model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować proces EnMT in vivo. Reasumując, hodowla pierwotna in vitro bydła CEC i modele kriouszkodzeń śródbłonka rogówki szczurów in vivo stanowią użyteczne platformy do badania mechanizmu EnMT.

Po izolacji bydlęcych CEC, komórki hodowano in vitro. Rycina 1 przedstawia obrazy w kontraście fazowym bydlęcych CEC. Sześciokątny kształt komórek w fazie konfluencji wskazywał, że podczas izolacji komórki nie zostały zanieczyszczone fibroblastami z zrazu rogówki. Rycina 2 przedstawia immunobarwienie wykonane z użyciem przeciwciał przeciwko ABC, snail oraz slug w wskazanym punkcie czasowym. Poza zmianami fenotypowymi w hodowli in vitro, ...

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie mechanizmu przejścia endotelialno-mezenchymalnegoy nabłonka rogówki in vitro i in vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania dotyczące przejścia endotelialno-mezenchymalnego nabłonka rogówki w dziedzinie regeneracji śródbłonka rogówki. Zaletą tej techniki jest możliwość jej zastosowania zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo.Jest ona również łatwa w manipulacji. Implikacje tej techniki zmierzają w stronę terapii chorób związanych z nabłonkowo-mezenchymalną transformacją śródbłonówki rogówki. Dzięki temu, że modele te mogą być wykorzystane do wyboru czynników hamujących proces nabłonkowo-mezenchymalnej transformacji śródbłonówki rogówki, mogą one służyć do badania mechanizmów ich powstawania.Procedurę przeprowadzi panna Jung-Shen Chang, technik laboratoryjny. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zdezynfekować świeże oczy bydlęce w 10% (w/v) roztworze powidonu jodowego przez trzy minuty. Następnie należy je przemyć PBS.Pobierz przycinek rogówki za pomocą skalpela i nożyczek, a następnie przemyj go w PBS. Pod mikroskopem stereoskopowym odwarstw błonę Descemeta za pomocą pincety. Następnie inkubuj błonę Descemeta w jednym mililitrze trypsyny w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie odzyskaj wołowe CEC poprzez wirowanie przy 112×g przez pięć minut.Po wirowaniu ponownie zawiesić komórki w 1 ml SHEM. Wysiać komórki do szalki o średnicy 6 cm i hodować je w SHEM. Następnie inkubować komórki w temperaturze 37°C w 5% CO2 i wymieniać pożywkę hodowlaną co trzy dni.Gdy komórki osiągną konfluencję, należy je wypłukać w PBS. Następnie inkubować je w 1 mm trypsyny w temperaturze 37°C przez pięć minut. Zebrać je poprzez wirowanie przy 112 ×g przez pięć minut.Po pięciu minutach ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml SHEM. Następnie policzyć komórki za pomocą komory Hemacytometru. Po tym wysiać komórki na szkiełka nakrywki w płytce 24-dołkowej i hodować komórki w SHEM.Aby zbadać efekt hamowania ENMT przez Maramastat, inkubować komórki w pożywce SHEM z dodatkiem 10 micromolar Maramastat w medium hodowlanym, wymieniając medium co trzy dni. Następnie, w wyznaczonym punkcie czasowym, utrwalić komórki, stosując 250 microliters 4%Paraformaldehyde przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie poddać je permeabilizacji, używając 250 microliters 0.5%Triton X-100 przez pięć minut.Następnie należy zablokować niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 10% BSA przez 30 minut. Po tym czasie komórki inkubuje się z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko ABC, snail i slug przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia komórki należy przemyć dwukrotnie za pomocą PBS, wykonując każde płukanie przez 15 minut.Następnie inkubuj je z przeciwciałem wtórnym koniugowanym z Alexa Fluor w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po tym czasie przeprowadź barwienie kontrastowe jąder komórkowych, nakładając na komórki DAPI w stężeniu 2 µg/mL. Przemyj komórki dwukrotnie PBS, każdorazowo przez 15 minut.Następnie zamontuj je za pomocą roztworu montażowego przeciwdopełniającego przed wykonaniem obrazów immunofluorescencyjnych. Po znieczuleniu 12-tygodniowego samca szczura linii SD, delikatnie uszczypnij skórę zwierzęcia, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie poprzez brak drgawek skóry. Następnie nanieś kroplę 0,5% Proparacaine Hydrochloride do prawego oka szczura, aby zminimalizować ból i odruch mrugania.Następnie na lewe oko nanieś maść z tetracykliną, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Potem schłodź stalową sondę w ciekłym azocie. Przyłóż stalową sondę do centralnej części rogówki prawego oka na 30 sekund.Podczas procedury często wkraplaj PBS do prawego oka, aby zapobiec wysuszeniu rogówki, a bezpośrednio po kriourazie podawaj raz dziennie 0,1% atropinę oraz 0,3% siarczan gentamycyny, aby złagodzić ból oka wynikający ze skurczu rzęsek oraz zapobiec infekcji. Po zabiegu utrzymuj szczura w cieple, używając lampy grzewczej, i obserwuj jego powrót do sprawności, aż do odzyskania kontroli motorycznej. Nakładaj maść tetracyklinową na prawe oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w okresie rekonwalescencji, i powtarzaj procedurę kriourazu rogówki przez trzy kolejne dni.Aby wprowadzić Maramastat lub podstawowy czynnik wzrostu FGF do komory przedniej oczu szczura, nanieś kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy do prawego oka znieczulonego szczura, aby zminimalizować ból i odruch mrugania. Następnie przemyj powierzchnię oka sterylnym PBS. Pod mikroskopem operacyjnym wykonaj paracentezę komory przedniej, wprowadzając igłę 30G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml w przeźroczystą część rogówki w okolicy paralimbalnej, w płaszczyźnie nadtęczówkowej i równolegle do tęczówki. Następnie skieruj ścięcie igły do góry i lekko dociśnij ranę rogówki, aby odprowadzić część cieczy wodnistej i obniżyć ciśnienie wewnątrzgałkowe.Wstrzyknij 0,02 ml leku do komory przedniej oka, a podczas wycofywania igły delikatnie uciśnij miejsce wkłucia patyczkiem bawełnianym. Rycina przedstawia obrazy w kontraście fazowym wołowych CECs i hodowli. Sześciokątny kształt komórek po osiągnięciu konfluencji wskazuje, że podczas izolacji komórek nie doszło do zanieczyszczenia fibroblastami stromy rogówki.Podczas hodowli in vitro bovine CECs, translokacja jądrowa ABC, snail i slug była wykrywana do 14. dnia. Rycina ta przedstawia wpływ Maramastatu, inhibitora MMP o szerokim spektrum działania, na proces ENMT w hodowlach in vitro bovine CECs. Poniżej przedstawiono zdjęcia zewnętrzne oczu szczurów po kriooburzaniu, po którym wykonano wstrzyknięcie do komory przedniej.Zdjęcia przedstawiają zmniejszony obrzęk rogówki po wstrzyknięciu podstawowego FGF. Maramastat dodatkowo zredukował obrzęk rogówki w porównaniu z samym podstawowym FGF. Rycina ta przedstawia natomiast barwienie immunocytochemiczne guzika rogówki szczura z użyciem przeciwciała przeciwko ABC po kriourazie, a następnie wstrzyknięciu do komory przedniej oka.Translokacja jądrowa ABC jest obserwowana w grupie PBS i jest znacząco zwiększona w grupie FGF podstawowego, co wskazuje na aktywację szlaku sygnałowego Wnt Beta-katenina oraz procesu ENMT. Po wstrzyknięciu do przedniej komory oka FGF podstawowego, a następnie Maramastatu, barwienie jądrowe ABC ulega zmniejszeniu, co sugeruje efekt hamujący ENMT przez Maramastat. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego rogówki, zarówno in vitro, jak i in vivo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób izolacji komórek nabłonkowych rogówki bydlęcej oraz sposób przeprowadzania kriourazu rogówki, jak również iniekcji do przedniej komory oka

in-vitro-vivo-models-to-study-corneal-endothelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Protokół opisuje test mikrokieszeni rogówki, tak jak został on opracowany u myszy.

Test mikrokieszeni rogówki: model angiogenezy w oku myszy

Myszy były używane jako model do badania wielu form transplantacji, w tym przeszczepu rogówki.  W niniejszym raporcie opisujemy mysi model zarówno do ostrego, jak i późnego przeszczepu rogówki.

Przeszczep rogówki u myszy: model do badania najczęstszej formy przeszczepu narządów litych

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Ten protokół opisuje nowatorski trójwymiarowy model in vitro, w którym komórki zrębu rogówki i zróżnicowane komórki neuronalne są hodowane razem, aby pomóc w badaniu i zrozumieniu interakcji dwóch typów komórek.

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania i uprawy rozszczepionych guzików rogówki u świń. Ponieważ ten typowy dla organoorganizacji model hodowli narządów wykazuje wskaźnik umieralności komórek w ciągu 15 dni, porównywalny z ludzkimi rogówkami dawców, stanowi on pierwszy model umożliwiający długotrwałą hodowlę rogówek innych niż ludzkie bez dodawania toksycznego dekstranu.

Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Ten protokół opisuje kluczowe kroki wymagane do założenia i wyhodowania hodowli komórek śródbłonka rogówki z eksplantatów tkanek ludzkich lub owczych. Przedstawiono również metodę subhodowli komórek śródbłonka rogówki na biomateriałach błoniastych.

Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Opisujemy metody badania EndMT indukowanego przez TGF-β2 w komórkach śródbłonka, obserwując zmiany morfologii komórek i badając zmiany markerów związanych z ekspresją EndMT za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Opisano edycję genu CRISPR/Cas9 i wykorzystano ją do wyczerpania genu kodującego ślimaka w celu zbadania jego roli w EndMT indukowanym przez TGF-β2.

Przejście śródbłonka do mezenchymalnego za pośrednictwem TGF-β (EndMT) i ocena funkcjonalna efektorów EndMT przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Poznaj mechanizm przejścia śródbłonka rogówki in vitro i in vivo przy użyciu modeli kultury komórek bydlęcych oraz szczurzego modelu kriourazowego. Ta metoda umożliwia badanie regeneracji śródbłonka rogówki.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Przeglądaj więcej filmów