Name: Fluorescencyjny ortotopowy mysi model raka trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę implantacji komórek raka trzustki wyrażających GFP do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu. Model ortotopowy umożliwia nieinwazyjne monitorowanie progresji guza i przerzutów w żywym organizmie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Zachodniemu Uniwersytetowi Nauk o Zdrowiu za Intramural Grant.

Protokół opisany poniżej jest realizowany pod nadzorem i aprobatą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zachodniego. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotowanie kompletnego podłoża
	<ol>
		<li>Korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II, przygotuj kompletną pożywkę, aseptycznie dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) i streptomycynę penicylinową (P/S) do 500 ml butelki pożywki RPMI. Delikatnie wymieszaj, mieszając. Końcowe stężenie każdego suplementu wynosi 10% FBS i 1% P/S (v/v). Na przykład uzupełnij 500 ml pożywki 56 ml FBS i 6 ml P/S.</li>
		<li>Umieścić kompletną pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki rozmrażające i rozmnażające
	<ol>
		<li>Pobierz ogniwa PANC-1 GFP z ciekłego azotu. Rozmrozić fiolkę przez delikatne mieszanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
		Uwaga: Rozmrażanie powinno być szybkie (około 2 - 3 minuty).</li>
		<li>Kolby T-75 należy oznaczyć (a) nazwą linii komórkowej, (b) numerem przejścia, (c) datą i (d) inicjałami badacza.</li>
		<li>Przetrzeć fiolkę 70% etanolem i przenieść fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Aby rozmnożyć komórki, dodać 9,0 ml kompletnej pożywki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Za pomocą pipety o pojemności 1,0 ml ostrożnie przenieść zawiesinę komórek i zawiesić ją w 9 ml kompletnego podłoża.</li>
		<li>Wirować przy 125 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść stożkową fiolkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i zassać supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>Zawiesić osad w 10 ml świeżej, kompletnej pożywki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść je w kolbach T-75 o gęstości 2,1 x 106 komórek/kolbę. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Monitoruj komórki codziennie wzrokiem i pod mikroskopem. Jeśli konieczne jest odnowienie płynu, należy w asepcie odessać całą pożywkę wzrostową z kolby i wyrzucić. Dodać równą objętość świeżego, kompletnego podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmnażanie komórek
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z kolby w sposób aseptywny. Dodać 5 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (DPBS) firmy Dulbecco, aby wypłukać komórki i wyrzucić.</li>
		<li>Oderwać komórki od kolby, dodając 3 ml 0,25% trypsyny. Inkubować kolbę zawierającą trypsynę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5–10 minut.</li>
		<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem (10-krotne powiększenie) i upewnij się, że są okrągłe i przemieszczone.</li>
		<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając równą objętość kompletnego podłoża i rozbij grudki, delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
		<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przenieść odpowiednią objętość zawiesiny komórek do nowych kolb o gęstości komórek podanej w ppkt 1.2.7; dodać tyle świeżej pożywki, aby końcowa objętość wynosiła 10 ml na kolbę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat zawiesiny komórek do wstrzykiwań 
	Uwaga: Ponieważ matryca błony podstawnej, o wysokim stężeniu, krzepnie w temperaturze pokojowej, wszystkie materiały należy utrzymywać na lodzie. Wszystkie sterylne końcówki i fiolki do pipet należy umieścić na noc w zamrażarce i przechowywać na lodzie podczas pracy z zawiesiną.
	<ol>
		<li>Trzymaj butelkę z pożywką RPMI bez żadnych dodatków na lodzie. Rozmrozić matrycę błony podstawnej o wysokim stężeniu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Najlepiej porcjować do mniejszych fiolek, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania 10.</li>
		<li>Odessać pożywkę ze wszystkich kolb i przepłukać 5 ml DPBS. Powtórz wszystkie kroki opisane w poprzedniej sekcji, aż do kroku 1.3.4.</li>
		<li>Przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 125 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść stożkową fiolkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i ponownie zawiesić osad przy użyciu 10 ml DPBS.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić granulki. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Ponownie odwirować zgodnie z opisem w kroku 1.4.3. Odessać supernatant i w zależności od liczby komórek dodać odpowiedni rozcieńczalnik, aby uzyskać 3 x 106 komórek w objętości 50 μl. Rozcieńczalnik będzie mieszaniną pożywki wolnej od surowicy i membrany macierzystej o wysokim stężeniu w stosunku 1:1 (v/v).</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj zawieszenie i utrzymuj je na lodzie przez cały czas. Zawiesina jest teraz gotowa do wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implantacja chirurgiczna 
	Uwaga: Upewnij się, że wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne są sterylne. Przez cały czas stosuj techniki aseptyki.
	<ol>
		<li>Połóż poduszkę grzewczą na stole i przykryj sterylną zasłoną. Ustaw aparat do znieczulenia i upewnij się, że wszystkie materiały są w zasięgu ręki.</li>
		<li>Umieść pysk zwierzęcia w masce anestezjologicznej i ustaw znieczulenie na 1 l/min tlenu i 2,5% izofluranu.</li>
		<li>Delikatnie wyszoruj bok zwierzęcia jodem i spłucz 70% etanolem. Powtórz trzy razy.</li>
		<li>Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, szczypiąc tylną łapę. Zwierzę jest w pełni znieczulone i gotowe do operacji, jeśli nie zaobserwuje się żadnej odpowiedzi. Jeśli jednak zwierzę się wzdrygnie, upewnij się, że w waporyzatorze jest wystarczająca ilość znieczulenia i daj zwierzęciu więcej czasu na całkowite znieczulenie.</li>
		<li>Załadować około 200 μl zawiesiny komórek do strzykawki o pojemności 1,0 ml z igłą 18 G (uprzednio schłodzoną). Zastąp igłę igłą 27 G i wróć do lodu, aż będzie gotowa do użycia.</li>
		<li>Zlokalizuj ogólny obszar śledziony (lewy górny kwadrant brzucha) i za pomocą kleszczy uszczypnij skórę na szczycie tego obszaru. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości około 1,0 cm, aby utworzyć kieszonkę. Podobnie uszczypnij mięśnie gładkie na szczycie śledziony i przetnij, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.</li>
		<li>Delikatnie chwyć ogonowy koniec śledziony i wyciągnij go z ciała. Trzustka zostanie przyczepiona do śledziony. Rozłóż trzustkę za pomocą mokrej, sterylnej końcówki higienicznej i zlokalizuj ogon trzustki.</li>
		<li>Wstrzyknąć 50 μl do końcówki trzustki, pozostawić igłę w środku na 10 sekund i powoli obrócić igłę z trzustki. Udana implantacja będzie wyglądała jak powierzchowna bańka bez żadnych przecieków.</li>
		<li>Wróć trzustkę i śledzionę do jamy otrzewnej. Najpierw obejmij mięsień, a następnie osobno obejmij skórę. Użyj szwu lub zszywki 6-0, aby zamknąć nacięcie. Aby uniknąć bólu u zwierzęcia, podawaj ketoprofen podskórnie (SC) (5 mg/kg) przez 24 godziny. Alternatywnie, buprenorfinę podskórnie (0,05 - 0,1 mg/kg) należy podawać co 12 godzin przez okres 36 godzin. </li>
		<li>Odzyskaj zwierzę ze znieczulenia i włóż je z powrotem do klatki. Monitoruj również ból. Zwierzęta muszą mieć zapewnioną ulgę w bólu w czasie (lub nawet przed – prewencyjnym) zabiegiem chirurgicznym. Zwierzętom, które odczuwają ból, należy zapewnić dodatkową ulgę w bólu zgodnie z protokołem IACCUC lub zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii lub osoby wyznaczonej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie in vivo 
	Uwaga: Przechwytywanie obrazu zostało wykonane przy użyciu komercyjnego systemu obrazowania wyposażonego w ciemną komorę i odpowiednie filtry do obrazowania GFP. Akwizycja obrazu została zrealizowana za pomocą kamery CCD oraz układu optycznego składającego się z wymiennych soczewek wzbudzających/emisyjnych (wzbudzenie: 455 - 495 nm; emisja: 513 - 557 nm). Obrazy w jasnym polu zostały wykonane bez filtra przy binningu 1 x 1 dla każdego punktu czasowego. Wzbudzenie GFP wykorzystało ksenonowe wielospektralne źródło światła. Zwierzęta utrzymywano w znieczuleniu przez cały proces obrazowania poprzez podłączenie aparatu do znieczulenia gazowego kolektora zintegrowanego z ciemną komorą systemu obrazowania.
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę w sposób opisany w ppkt 1.5.2. Maska anestezjologiczna znajduje się we wnętrzu ciemnej komory komercyjnego systemu obrazowania, aby utrzymać zwierzę pod narkozą podczas procesu obrazowania.</li>
		<li>Ustaw odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji.</li>
		<li>Zacznij od uzyskania początkowego obrazu przy użyciu samego światła białego. Utrzymuj tę samą pozycję zwierzęcia przez całą sesję obrazowania i przełącz się na filtry GFP, aby wykonać drugie zdjęcie.</li>
		<li>Aby uzyskać najlepsze wyniki, nałóż na siebie oba obrazy. Przeanalizuj obraz pod kątem obszaru i intensywności fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf">http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf</a> (2014).</li>
<li>Smyth, E., Cunningham, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmyth%2C+E+%22Harrison%27s+Principles+of+Internal+Medicine%22">Harrison's Principles of Internal Medicine</a>. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).</li>
<li>Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+borderline+resectable+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastrointest+Oncol%22%5BJournal%5D)">Management of borderline resectable pancreatic cancer.</a> World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).</li>
<li>De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of pancreatic cancer.</a> Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+orthotopic+xenografts%3A+better+mimic+of+metastasis+than+subcutaneous+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts.</a> Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+uses+of+fluorescent+proteins+to+visualize+cancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.</a> Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).</li>
<li>Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+orthotopic+pancreatic+cancer+mouse+model%3A+cells+suspended+and+injected+in+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel.</a> World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).</li>
<li>Arranz, A., Ripoll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+optical+imaging+for+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Advances in optical imaging for pharmacological studies.</a> Front Pharmacol. 6, 189(2015).</li>
<li>Corning. Corning Matrigel Matrix: Frequently Asked Questions. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf">http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf</a> (2013).</li>
<li>Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+serial+selection+of+human+pancreatic+cancer+cells+in+orthotopic+mouse+models+produces+high+metastatic+variants+irrespective+of+Kras+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status.</a> J Surg Res. 184, 290-298 (2013).</li>
<li>Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).</li>
<li>Katz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+efficacy+of+adjuvant+cytosine-analogue+CS-682+in+a+fluorescent+orthotopic+model+of+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer.</a> Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).</li>
<li>Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy ortotopowy mysi model raka trzustki, który wyraża GFP, umożliwiając w ten sposób nieinwazyjne monitorowanie wzrostu guza za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo całego ciała (ryc. 1). Ta technika pozwala nam monitorować rozwój guza w czasie rzeczywistym (ryc. 3); Może to być ważne narzędzie dla naukowców do badania skuteczności terapeutycznej nowych środków przeciwko rakowi trzustki. Innym ważnym aspektem tego modelu jest to, że fluorescencja GFP zapewnia wizua...

Rak trzustki jest diagnozowany częściej w porównaniu z innymi nowotworami i jestczwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Od momentu postawienia diagnozy ponad 90% pacjentów umiera w ciągu pięciu lat 1,2. Obecnie chirurgiczne usunięcie guza jest jedynym lekarstwem na raka trzustki, ale mniej niż 20% pacjentów kwalifikuje się do poddania się operacji, głównie dlatego, że w momencie rozpoznania choroba jest w zaawansowanym stadium i ma przerzuty 3,4. Brak specyficznych objawów sprawia, że rak trzustki jest cichą chorobą; Niektóre z objawów to ból brzucha, ból pleców, utrata apetytu, żółtaczka i nudności; które można łatwo zinterpretować jako powszechne choroby układu pokarmowego 4. Z tego powodu ważne jest opracowanie nowych narzędzi farmakologicznych, które pomogą w diagnozowaniu i leczeniu raka trzustki.
Wykorzystanie modeli zwierzęcych pozwala nam zrozumieć biologię raka trzustki i daje wgląd w zastosowanie tej wiedzy u ludzi. Ortotopowe modele ksenoprzeszczepu raka trzustki są realistyczne, ponieważ guzy rosną w narządzie pochodzenia 5. W przeciwieństwie do modeli heterotopowych, w których linie komórkowe lub fragmenty guza są wszczepiane podskórnie, modelowanie ortotopowe pozwala na odtworzenie mikrośrodowiska guza i naśladuje interakcję komórek nowotworowych z otoczeniem 6. Opisany tutaj model ksenoprzeszczepu wywodzi guzy z ludzkiej linii komórkowej raka trzustki PANC-1 GFP, która jest genetycznie modyfikowana do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP). Wykrywanie GFP umożliwia nieinwazyjne obrazowanie i monitorowanie wzrostu guza i przerzutów 7. Rozwój guza następuje szybko, spontanicznie i bardzo przypomina rozwój guzów pierwotnych u pacjentów z rakiem trzustki 8. Modele ortotopowe zapewniają dokładniejsze przewidywanie skuteczności leku w odpowiedzi na środki terapeutyczne, naśladując jednocześnie mikrośrodowisko guza.
Jak wspomniano powyżej, ten model zwierzęcy umożliwia fluorescencyjne wykrywanie wzrostu guza i przerzutów w czasie rzeczywistym. Detekcja fluorescencyjna pozwala na bardziej bezpośrednie/żywe obrazowanie w porównaniu z luminescencją. W przypadku fluorescencji emitowane światło jest wynikiem wzbudzenia przez inne światło o krótszej długości fali; Natomiast w przypadku luminescencji emitowane światło jest wynikiem reakcji chemicznej i może nie mieć silnej emisji9. Co więcej, obrazowanie fluorescencyjne całego ciała in vivo nie jest szkodliwe dla zwierzęcia i pozwala naukowcom monitorować wzrost guza w czasie w odpowiedzi na leczenie terapeutyczne.

<table><tbody><tr><td>RPMI media 1640</td><td>Caisson Labs</td><td>RPL03-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Ficher Sci</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Membrana podstawna Matrigel HC, wysokie stężenie</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>SutureVet PGA 6-0 PGA</td><td>Henry Schein</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>Alcare lub spieniony antyseptyczny żel do dezynfekcji rąk</td><td>Steris</td><td>639680</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dubelcco)&nbsp;</td>Strzykawka <td>Thermo Ficher Sci</td><td>21300025</td><td></td></tr><tr><td>TB 27 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Blutler Schein</td><td>50562</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne, 5,5" prosty majonez&nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>22-1600</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa PANC-1 GFP&nbsp;</td><td>Anticancer, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania małych zwierząt: iBox Scientia</td><td>UVP, LLC. Upland, Kalifornia.</td><td></td><td>System obrazowania małych zwierząt do obserwacji guza fluorescencyjnego u żywych zwierząt</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy



Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Rak trzustki pozostaje jednym z nowotworów, dla których przeżywalność nie poprawiła się znacząco w ciągu ostatnich kilku dekad. Tylko 7% zdiagnozowanych pacjentów przeżyje dłużej niż pięć lat. Aby zrozumieć i naśladować mikrośrodowisko guzów trzustki, wykorzystaliśmy mysi ortotopowy model raka trzustki, który umożliwia nieinwazyjne obrazowanie progresji guza w czasie rzeczywistym. Komórki raka trzustki wykazujące ekspresję białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) zawieszono w macierzy błony podstawnej o wysokim stężeniu (np. Matrigel HC) z pożywką wolną od surowicy, a następnie wstrzyknięto do ogona trzustki za pomocą laparotomii. Zawiesina komórkowa w macierzy błony podstawnej o wysokim stężeniu staje się substancją żelową po osiągnięciu temperatury pokojowej; Dlatego żeluje się w kontakcie z trzustką, tworząc uszczelnienie w miejscu wstrzyknięcia i zapobiegając wyciekom komórek. Wzrost guza i przerzuty do innych narządów są monitorowane u żywych zwierząt za pomocą fluorescencji. Bardzo ważne jest stosowanie odpowiednich filtrów do wzbudzenia i emisji GFP. Etapy implantacji ortotopowej są szczegółowo opisane w tym artykule, dzięki czemu naukowcy mogą łatwo odtworzyć procedurę na nagich myszach. Głównymi etapami tego protokołu są przygotowanie zawiesiny komórek, implantacja chirurgiczna i obrazowanie fluorescencyjne całego ciała in vivo. Ten model ortotopowy ma na celu zbadanie skuteczności nowych terapii w przypadku guzów pierwotnych i przerzutowych.

Metoda ta opisuje chirurgiczną implantację ortotopową fluorescencyjnych ludzkich komórek raka trzustki, koncentrując się na przygotowaniu zawiesiny komórkowej do iniekcji, odpowiedniej anestezji gryzoni, podaniu zawiesiny komórkowej poprzez laparotomię oraz zastosowaniu fluorescencyjnego obrazowania in vivo małych zwierząt. Wykrycie sygnału zielonej fluorescencji (sygnału GFP) od dwóch do trzech tygodni po implantacji dostarcza badaczom wizualnej wskazówki potwierdzającej obecnoś...

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie ortotopowego mysiego modelu fluorescencyjnego raka trzustki, który można monitorować nieinwazyjnie u żywego zwierzęcia. Model ten umożliwia nieinwazyjne badanie wpływu konkretnego leku na guz pierwotny oraz jego przerzuty w żywym organizmie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwej obserwacji efektów leczenia in situ.Zacznij od rozmrożenia alikwotu wysokostężonego Matrigelu zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie przemyj każdą kolbę z komórkami pięcioma mililitrami DPBS i zbierz hodowle za pomocą trypsyny. Po dodaniu medium RPMI przenieś uzyskane zawiesiny komórkowe do probówek o pojemności 15 ml i odwiruj komórki.Po zakończeniu wirowania przenieś komórki do komory z laminarnym przepływem powietrza i resuspender osady w 10 mililitrach świeżego DPBS, delikatnie pipetując. Po policzeniu komórek ponownie je odwirowuj i rozcieńcz zawiesiny komórkowe do stężenia 3×10⁶ komórek na 50 µL lodowatego, beztłuszczowego medium oraz Matrigelu, będącego wysokostężoną błoną podstawną.Aby zaimplantować komórki, należy najpierw nałożyć maść do oczu znieczulonej myszy i umieścić zwierzę na podkładce grzewczej przykrytej sterylną chustą. Następ

fluorescent-orthotopic-mouse-model-of-pancreatic-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Film wyjaśnia krokową metodę chirurgiczną do ortotopowego wszczepienia fragmentu guza od dawcy nowotworowego do trzustki myszy z nienowotworowym biorcą w celu rozwoju raka trzustki. Ortotopowo wszczepiony PDAC może dokładniej uchwycić mikrośrodowisko tkanek ludzkiego raka trzustki niż konwencjonalne modele podskórne (SC).

Ortotopowy przeszczep guza homograftu: technika generowania mysich modeli guza trzustki

Ten film demonstruje protokół ortotopowego wszczepiania komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji do trzustki myszy. Ortotopowy model myszy pomaga w badaniu skuteczności nowych terapii w przypadku guzów pierwotnych i przerzutowych.

Fluorescencyjny ortotopowy model myszy: wszczepianie GFP z ekspresją komórek rakowych do myszy w celu oceny progresji guza in vivo

Ten film demonstruje ortotopowy model raka trzustki, który wykorzystuje Matrigel do miejscowego dostarczania komórek i obrazowania bioluminescencji in vivo do nieinwazyjnego monitorowania progresji guza. Model ortotopowy jest odpowiedni zarówno dla modeli syngenicznych, jak i ksenoprzeszczepów i może być wykorzystany w badaniach przedklinicznych w celu zbadania wpływu nowych terapii przeciwnowotworowych na wzrost pierwotnego guza trzustki i przerzuty.

Bioluminescencyjny ortotopowy model myszy raka trzustki: nieinwazyjna technika monitorowania progresji raka u myszy

Lepsze zrozumienie biologii raka trzustki jest niezwykle potrzebne, aby umożliwić opracowanie lepszych opcji terapeutycznych w leczeniu raka trzustki. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, demonstrujemy ortotopowy model raka trzustki, który umożliwia nieinwazyjne monitorowanie progresji raka za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.

Bioluminescencyjny ortotopowy model progresji raka trzustki

Celem tego protokołu jest zastosowanie dynamicznego rezonansu magnetycznego wzmocnionego kontrastem (DCE-MRI) dla ortotopowych ksenoprzeszczepów guza trzustki u myszy. DCE-MRI jest nieinwazyjną metodą analizy mikrokrążenia w tkance docelowej i przydatną do oceny odpowiedzi naczyniowej w guzie po nowej terapii.

Obrazowanie rezonansu magnetycznego z kontrastem dynamicznym ortotopowego modelu myszy z rakiem trzustki

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Opisujemy protokół implantacji pod kontrolą ultrasonograficzną linii komórkowych rdzeniakoraka przewodowego trzustki pochodzących od myszy bezpośrednio do natywnego miejsca guza. Takie podejście spowodowało guzy trzustki wykrywalne za pomocą skanowania ultrasonograficznego w ciągu 2-4 tygodni od wstrzyknięcia i znacznie zmniejszyło odsetek wysiewu komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej w porównaniu z chirurgiczną implantacją ortotopową.

Ortotopowa implantacja mysiego gruczolakoraka przewodowego trzustki pod kontrolą USG

W kontekście klinicznym, pacjenci z zlokalizowanym rakiem trzustki zostaną poddani pankreatektomii, a następnie leczeniu uzupełniającemu. Przedstawiony tutaj protokół ma na celu ustanowienie bezpiecznej i skutecznej metody modelowania tego scenariusza klinicznego u nagich myszy, poprzez ortotopową implantację raka trzustki, a następnie dystalną pankreatektomię i splenektomię.

Ortotopowy resekcyjny mysi model raka trzustki

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Syngeneic mysie ortotopowe alloprzeszczepy gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) podsumowują biologię, fenotypy i reakcje terapeutyczne podtypów choroby. Ze względu na szybką, powtarzalną progresję nowotworu są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych. Tutaj pokazujemy powszechne praktyki generowania tych modeli, wstrzykiwania syngenicznych mysich kultur PDAC do trzustki.

Syngeniczne ortotopowe alloprzeszczepy myszy do modelowania raka trzustki

Opisujemy metodę wykorzystania limfocytów naciekających nowotwór (TIL) od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Protokół ten ma na celu weryfikację specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki.

Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

Poznaj metodę implantacji komórek raka trzustki wyrażających GFP do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu. Model ortotopowy umożliwia nieinwazyjne monitorowanie progresji guza i przerzutów w żywym organizmie.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Przeglądaj więcej filmów