Porównanie metod usuwania białek komórek gospodarza tytoniu poprzez blanszowanie nienaruszonych roślin lub obróbkę cieplną ekstraktów

Ogólnym celem tego zestawu eksperymentów jest wytrącenie białek komórek gospodarza rośliny za pomocą ciepła. Ułatwia to w ten sposób późniejsze oczyszczanie chromatograficzne rekombinowanych białek biofarmaceutycznych. Metoda ta może pomóc w usprawnieniu rozwoju procesu i zwiększeniu stabilności produktu, na przykład poprzez aktywację proteaz gospodarza.

Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej wdrożenia w przypadku istniejących proteaz oraz możliwość szybkiego dostosowania jej do różnych białek docelowych. Procedurę zaprezentuje Hannah Gruchow, studentka studiów magisterskich z mojego laboratorium. W celu wytrącenia białek komórek gospodarza przez podgrzewanie.

Na przykład z liści tytoniu. Po wyhodowaniu roślin tytoniu zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj kąpiel wodną o objętości roboczej ośmiu litrów w termicznie izolowanym wiadrze ze styropianu. Przenieś cały zestaw na mieszadło magnetyczne i umieść w kąpieli wodnej mieszadło magnetyczne.

Następnie otocz mieszadło magnetyczne niemagnetycznym kafelkiem wspierającym, który powinien wystawać ponad mieszadło o około jeden centymetr. Na nim w późniejszym etapie procedury zostanie umieszczony koszyk z polipropylenu. Do kąpieli wodnej dodaj osiem litrów buforu.

Następnie należy umieścić polipropylenowy koszyk o wymiarach 23 x 23 x 23 cm na płytkach wspierających. Należy upewnić się, że wspornik nie utrudnia obrotu mieszadła magnetycznego, a koszyk jest całkowicie zanurzony w cieczy. Następnie należy wyjąć koszyk.

Użyj regulowanego termostatu, aby nagrzać łaźnię wodną do 70 °C. Po osiągnięciu pożądanej temperatury odczekaj co najmniej 15 minut, aby upewnić się, że cały układ osiągnął równowagę termiczną. Następnie przygotuj aliquoty o masie 150 g z liści tytoniu.

Umieść jedną porcję w koszyku, unikając nieodwracalnego ściskania i uszkodzenia liści, na przykład poprzez ich rozdzieranie. Ostrożnie, lecz szybko zanurz koszyk w gorącym płynie i ustaw go na płytkach wspierających.

Następnie umieść stalowy blok na koszyku, aby zapobiec wypływaniu liści na powierzchnię. Inkubuj liście przez pięć minut w płynie do blanszowania lub wybierz czas odpowiedni dla projektu eksperymentalnego.

Monitoruj temperaturę cieczy przez cały okres inkubacji. Po inkubacji ostrożnie wyjmij koszyk z płynu do blanchowania i odcedź liście przez 30 sekund. Następnie wyjmij liście roślin z koszyka, przełóż je do blendera i niezwłocznie rozpocznij ekstrakcję zgodnie z protokołami tekstowymi.

Aby podgrzać osad HCP w naczyniu z mieszadłem. Przenieś kąpiel wodną na mieszadło magnetyczne i umieść dwulitrowe naczynie ze stali nierdzewnej w kąpieli wodnej w taki sposób, aby środek naczynia znajdował się w centrum płyty mieszającej. Włóż magnetyczny pasek mieszający do naczynia ze stali nierdzewnej.

Napełnić naczynie buforem do ekstrakcji, a następnie wodą dejonizowaną. Napełnić kąpiel wodną do poziomu pięciu centymetrów poniżej górnej krawędzi naczynia ze stali nierdzewnej.

Użyć pokrywy z pianki polistyrenowej, aby go przykryć. Następnie włożyć termometr do naczynia ze stali nierdzewnej przez otwór w pokrywie. Następnie ustawić temperaturę kąpieli wodnej na 78 °C i inkubować cały układ przez 15 minut, aż zostanie osiągnięta równowaga termiczna.

Gdy układ osiągnie stan równowagi, opróżnić naczynie i wlać do niego 300 mililitrów ekstraktu, gdy naczynie wciąż znajduje się w kąpieli wodnej, a następnie uruchomić stoper. Mieszać ekstrakt przy 150 rpm podczas pięciominutowej inkubacji. Należy upewnić się, że w czasie inkubacji ekstrakt osiągnie temperaturę 70 stopni Celsjusza na co najmniej dwie minuty.

Po inkubacji zdejmij kąpiel wodną z mieszadła magnetycznego. Wyjmij naczynie ze stali nierdzewnej i umieść je w wiadrze z lodowatą wodą. Następnie postaw wiadro na mieszadle.

Należy upewnić się, że homogenat roślinny jest dobrze mieszany przy 150 rpm. Umieść termometr w ekstrakcie i inkubuj go, aż osiągnie temperaturę 20 °C lub temperaturę określoną w procedurze. Po przygotowaniu dwóch łaźni wodnych o objętości roboczej ośmiu litrów zgodnie z protokołem tekstowym, napełnij pierwszą łaźnię wodą dejonizowaną.

Ustaw termostat na 74,5 °C i inkubuj zestaw przez 15 minut, aby osiągnął równowagę termiczną. Przygotuj izolowany pojemnik do przechowywania, umieszczając plastikowy zlew o pojemności 0,5 l w plastikowym zlewie o pojemności jednego litra. Luki wypełnij materiałem izolacyjnym, takim jak wata bawełniana.

Używając rurki LS24, podłącz wymiennik ciepła z jednej strony do pompy perystaltycznej, a z drugiej do węża odpływowego. Umieść oba końce rurki wraz z termometrem w izolowanym naczyniu do przechowywania. Następnie napełnij je 300 mililitrami buforu do ekstrakcji.

Następnie umieść wymiennik ciepła w łaźni wodnej i uruchom pompę perystaltyczną z prędkością 300 ml/min. Po trzech minutach upewnij się, że temperatura w naczyniu wynosi 70 °C. Jest to wartość o około 4,5 °C niższa od temperatury zadanej dla łaźni wodnej.

Wylej bufor ekstrakcyjny z izolowanego naczynia i przygotuj 300 mililitrowe alikwoty ekstraktu roślinnego. Następnie napełnij izolowane naczynie jedną alikwotą. Teraz przepompowuj ekstrakt roślinny przez wymiennik ciepła z prędkością 300 mililitrów na minutę przez pięć minut.

Następnie upewnij się, że po trzech minutach temperatura ekstraktu wynosi 70 °C lub jest równa temperaturze określonej w planie doświadczenia. Po pięciu minutach przenieś wymiennik ciepła do kąpieli wodnej z lodem. Przed przejściem do kolejnego kroku upewnij się, że temperatura ekstraktu spadła poniżej 30 °C.

Wyjmij wąż doprowadzający podłączony do pompy perystaltycznej z izolowanego naczynia. Kontynuuj pompowanie, aby zebrać pozostały wyciąg roślinny wytrącony przez ciepło z wnętrza wymiennika ciepła. Następnie zatrzymaj pompę.

Aby przeprowadzić filtrację workową ekstraktu roślinnego, zamontuj filtr workowy w odpowiednim koszu wspierającym umieszczonym w obudowie filtra. Pod koszem ustaw naczynie o pojemności jednego litra i dozuj alikwoty ekstraktu do worka z prędkością 150 ml/min. Po filtracji użyj turbidymetru, aby zmierzyć mętność rozcieńczenia filtratu w buforze ekstrakcyjnym w stosunku od 1 do 10.

Należy pobrać próbkę o objętości 1 ml i przetworzyć filtrat z worka. Można to zrobić na przykład poprzez filtrację głębinową i chromatografię. Następnie należy przeanalizować próbkę zgodnie z protokołem tekstowym.

Wytrącanie białek komórek gospodarza poprzez obróbkę termiczną (blanszowanie) redukuje całkowitą ilość białek rozpuszczalnych (TSP) o 96 ± 1%. Blanszowanie pozwoliło na odzyskanie do 83 ± 1% DsRed oraz 51% białka docelowego Vax8, zwiększając jego czystość z 0,1% do 1,2% przed rozdziałem chromatograficznym.

Wydajność filtra spadała w temperaturach blanszowania powyżej 63 °C. Można temu zaradzić poprzez dodanie flokulantów po ekstrakcji białek oraz środków filtracyjnych po filtracji workowej. Zbiornik z mieszadłem do precypitacji termicznej usunął maksymalnie 84 ± 1% HCP.

Osiągnięto czystość na poziomie 0,33 ± 0,02% dla Vax8 oraz 20,2 ± 1,4% dla DsRed. W przeciwieństwie do blanszowania i układu z wymiennikiem ciepła, wytrącanie HCP w naczyniu zwiększa wydajność późniejszej filtracji głębinowej 2,5-krotnie. Odzwierciedla to niższe siły ścinania w naczyniu w porównaniu do pompowania ekstraktu przez wymiennik ciepła lub homogenizacji po blanszowaniu.

Około 88,3 ± 0,7% zawartości HCP było konsekwentnie usuwane z ekstraktu przy użyciu wymiennika ciepła w temperaturze od 60 do 70 °C. Osiągnięto czystość na poziomie 0,31 ± 0,01% dla Vax8 oraz 27,6 ± 2,0% dla DsRed.

Wreszcie, wymiennik ciepła osiągnął najniższą wydajność filtra głębinowego na wylocie. Przejaśniono jedynie 13,5 plus lub minus 6,0 litrów na metr kwadratowy przed zapchaniem filtra. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura może zająć mniej niż 50 minut plus czas potrzebny na próbkę.

Podczas stosowania tej metody ważne jest upewnienie się, że białko docelowe jest termostabilne. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak chromatografia, w celu dalszego oczyszczenia produktu do wymaganego poziomu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie roślin, dostarczając technologii umożliwiającej badanie oczyszczania białek kandydackich na szczepionki oraz gatunków nicotiana.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wytrącać białka komórek gospodarza roślinnego za pomocą blanszowania, mieszadła mechanicznego lub wymiennika ciepła.