Porównanie metod usuwania białek komórek gospodarza tytoniu poprzez blanszowanie nienaruszonych roślin lub obróbkę cieplną ekstraktów
8 sierpnia 2016
Przedstawiono trzy metody wytrącania ciepła, które skutecznie usuwają ponad 90% białek komórek gospodarza (HCP) z ekstraktów tytoniowych przed jakimkolwiek innym etapem oczyszczania. HCP roślin nieodwracalnie agregują się w temperaturach powyżej 60 °C.
Ogólnym celem tego zestawu eksperymentów jest wytrącenie białek komórek gospodarza roślin za pomocą ciepła. Ułatwia to późniejsze oczyszczanie chromatograficzne rekombinowanych białek biofarmaceutycznych. Metoda ta może pomóc w usprawnieniu rozwoju procesu i zwiększeniu stabilności produktu, na przykład poprzez aktywację proteaz gospodarza.
Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo wdrożyć do istniejących proteaz i szybko dostosować do różnych białek docelowych. Procedurę zademonstruje Hannah Gruchow, studentka studiów magisterskich z mojego laboratorium. Aby podgrzać, wytrącić białka komórki gospodarza.
Na przykład z liści tytoniu. Po wyhodowaniu roślin tytoniu zgodnie z protokołem tekstowym należy założyć ośmiolitrową kąpiel wodną o objętości roboczej w izolowanym termicznie wiadrze z pianki polistyrenowej. Przenieś cały zespół na magnetyczną płytkę mieszającą i umieść pręt magnetyczny w łaźni wodnej.
Następnie otocz mieszadło niemagnetyczną płytką nośną, która pokrywa mieszadło o około jeden centymetr. Na którym w dalszej części zabiegu zostanie umieszczony kosz polipropylenowy. Dodać osiem litrów buforu do łaźni wodnej.
Następnie umieść kosz polipropylenowy o wymiarach 23 na 23 na 23 centymetry na płytkach nośnych. Upewnij się, że podpora nie przeszkadza w obracaniu się mieszadła i że kosz jest całkowicie zanurzony w płynie. Następnie wyjął kosz.
Użyj regulowanego termostatu, aby doprowadzić łaźnię wodną do 70 stopni Celsjusza. Odczekaj co najmniej 15 minut po osiągnięciu żądanej temperatury, aby upewnić się, że cały zespół osiągnął równowagę termiczną. Następnie przygotuj 150 gramów porcji z liści tytoniu.
Umieść jedną porcję w koszu, unikając nieodwracalnego ściskania i uszkodzenia liści. Na przykład przez rozdzieranie. Ostrożnie, ale szybko zanurz kosz w gorącym płynie i umieść go na płytkach wsporczych.
Następnie umieść blok ze stali nierdzewnej na górze kosza, aby zapobiec flotacji. Inkubuj liście przez pięć minut w płynie do blanszowania. Lub wybierz czas odpowiedni dla projektu eksperymentalnego.
Monitoruj temperaturę cieczy przez cały okres inkubacji. Po inkubacji ostrożnie wyjmij kosz z płynu do blanszowania i pozwól liściom spłynąć przez 30 sekund. Następnie wyjmij liście rośliny z kosza, przenieś je do blendera i natychmiast rozpocznij ekstrakcję zgodnie z protokołami tekstowymi.
Aby podgrzać, wytrącić HCP w mieszanym naczyniu. Przenieś łaźnię wodną na magnetyczną płytkę mieszającą i umieść dwulitrowe naczynie ze stali nierdzewnej w łaźni wodnej tak, aby środek naczynia był wyrównany ze środkiem płytki mieszającej. Umieść mieszadło magnetyczne w naczyniu ze stali nierdzewnej.
Napełnić naczynie buforem ekstrakcyjnym. Następnie z wodą dejonizowaną. Napełnij łaźnię wodną do pięciu centymetrów poniżej górnej krawędzi naczynia ze stali nierdzewnej.
Użyj pokrywki z pianki polistyrenowej, aby ją przykryć. Następnie włóż termometr do naczynia ze stali nierdzewnej przez kojący otwór w pokrywce. Następnie ustaw temperaturę łaźni wodnej na 78 stopni Celsjusza i inkubuj cały zespół przez 15 minut, aby osiągnąć równowagę termiczną.
Gdy zespół osiągnie równowagę, opróżnij naczynie i wlej 300 mililitrów ekstraktu do naczynia, gdy jest jeszcze w łaźni wodnej i uruchom stoper. Mieszaj ekstrakt z prędkością 150 obr./min, inkubując przez pięć minut. Upewnij się, że ekstrakt osiąga temperaturę 70 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie minuty w okresie inkubacji.
Po inkubacji należy usunąć gorącą kąpiel wodną z mieszadła magnetycznego. Wyjmij naczynie ze stali nierdzewnej i umieść je w wiadrze z lodowatą wodą. Następnie umieść wiadro na talerzu mieszającym.
Upewnij się, że homogenat roślinny jest dobrze wymieszany przy 150 obr./min. Umieść termometr w ekstrakcie i inkubuj go, aż osiągnie temperaturę 20 stopni Celsjusza lub określoną temperaturę. Po ustawieniu dwóch ośmiolitrowych kąpieli wodnych o objętości roboczej zgodnie z protokołem tekstowym, użyj wody dejonizowanej do napełnienia pierwszej wanny.
Ustaw termostat na 74,5 stopnia Celsjusza i inkubuj zespół przez 15 minut, aby osiągnąć równowagę termiczną. Przygotuj izolowane naczynie do przechowywania, umieszczając plastikową zlewkę o pojemności 0,5 litra w plastikowej zlewce o pojemności jednego litra. I użyj materiału izolacyjnego, takiego jak wata, aby wypełnić szczeliny.
Za pomocą rurki LS24 podłącz wymiennik ciepła do pompy perystaltycznej na jednym końcu, a do węża wylotowego na drugim końcu. Umieść oba końce rurki wraz z termometrem w izolowanym naczyniu do przechowywania. I napełnij go 300 milimetrami buforu ekstrakcyjnego.
Następnie umieść wymiennik ciepła w łaźni gorącej wody i uruchom pompę perystaltyczną z prędkością 300 mililitrów na minutę. Po trzech minutach upewnij się, że uzyskana temperatura w naczyniu wynosi 70 stopni Celsjusza. Około 4,5 stopnia Celsjusza poniżej wartości zadanej łaźni wodnej.
Wyrzucić bufor ekstrakcyjny z izolowanego naczynia i przygotować 300 mililitrów porcji ekstraktu roślinnego. Następnie jedną porcją napełnij izolowane naczynie. Teraz pompuj ekstrakt roślinny przez wymiennik ciepła z prędkością 300 mililitrów na minutę przez pięć minut.
Następnie upewnij się, że temperatura ekstraktu wynosi 70 stopni Celsjusza po trzech minutach lub jest równa temperaturze, którą można znaleźć w projekcie eksperymentalnym. Po pięciu minutach przenieś wymiennik ciepła do lodowatej łaźni wodnej. Przed kontynuowaniem upewnij się, że temperatura ekstraktu jest niższa niż 30 stopni Celsjusza.
Wyjmij wąż dopływowy podłączony do pompy perystaltycznej z izolowanego naczynia. I kontynuuj pompowanie, aby zebrać resztkowy ekstrakt roślinny wytrącony ciepłem z wnętrza wymiennika ciepła. Następnie zatrzymaj pompę.
Aby przeprowadzić filtrację workową ekstraktu roślinnego, należy zamontować filtr workowy w odpowiednim koszu wsporczym zamontowanym w obudowie filtra. Umieść jednolitrowe naczynie pod koszem i nałóż porcje ekstraktu na worek z szybkością 150 mililitrów na minutę. Po filtracji użyć mętnościomierza, aby zmierzyć zmętnienie rozcieńczenia filtratu w buforze ekstrakcyjnym od 1 do 10.
Podzielić próbkę o objętości jednego mililitra i przetworzyć filtrat workowy. Na przykład poprzez filtrację wgłębną i chromatografię. Dalej analizuj próbkę zgodnie z protokołem tekstowym.
Wytrącanie cieplne białek komórek gospodarza przez blanszowanie zmniejsza całkowite rozpuszczalne białko lub TSP o 96 plus minus jeden procent. Blanszowanie pozwoliło odzyskać do 83 plus minus jeden procent DsRed i 51 procent docelowego białka Vax8. Zwiększenie jego czystości z 0,1 procent do 1,2 procent przed separacją chromatograficzną.
Pojemność filtra spadała przy temperaturach blanszowania powyżej 63 stopni Celsjusza. Temu można zaradzić, dodając flokulanty po ekstrakcji białka i pomoce filtracyjne po filtracji workowej. Mieszane naczynie do wytrącania ciepła usunęło maksymalnie 84 plus minus jeden procent HCP.
Osiągnięcie czystości 0,33 plus minus 0,02 procent dla Vax8 i 20,2 plus minus 1,4 procent dla DsRed. W przeciwieństwie do blanszowania i konfiguracji wymiennika ciepła, wytrącanie HCP w zbiorniku zwiększa wydajność dalszej filtracji wgłębnej 2,5-krotnie. Odzwierciedla to mniejsze siły naczyń w porównaniu z pompowaniem ekstraktu przez wymiennik ciepła lub homogenizacją po blanszowaniu.
Około 88,3 plus minus 0,7 procent zawartości HCP było konsekwentnie usuwane z ekstraktu za pomocą wymiennika ciepła w temperaturze od 60 do 70 stopni Celsjusza. Osiągnięcie czystości 0,31 plus minus 0,01 procent dla Vax8. I 27,6 plus minus 2,0 procent dla DsRed.
Wreszcie, wymiennik ciepła osiągnął również najniższą wydajność filtra wgłębnego za wymiennikiem. Klarowanie tylko 13,5 plus minus 6,0 litrów na metr kwadratowy przed zatkaniem. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 50 minut plus próbkę, jeśli jest wykonana prawidłowo.
Próbując tej metody, należy pamiętać, aby upewnić się, że docelowe białko jest stabilne termicznie. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak chromatografia, w celu dalszego oczyszczenia produktu do wymaganego poziomu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się roślinami dzięki technologii badania nad oczyszczaniem białek kandydujących na szczepionki i gatunków nicotiana.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytrącać białka komórek gospodarza roślin za pomocą blanszowania, mieszania naczynia lub wymiennika ciepła.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu przedstawiono trzy metody precypitacji termicznej, które skutecznie usuwają ponad 90% białek komórek gospodarza (HCPs) z ekstraktów tytoniowych. Metody te ułatwiają kolejne etapy oczyszczania rekombinowanych białek biofarmaceutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Oczyszczanie białek
- Rozwój farmaceutyków
Wstęp
- Białka komórek gospodarza mogą utrudniać oczyszczanie białek rekombinowanych.
- Wytrącanie termiczne jest techniką stosowaną w celu usunięcia niepożądanych białek.
- Skuteczne usunięcie białek HCP jest kluczowe dla stabilności produktu.
- Metodę tę można dostosować do różnych białek docelowych.
Cel badania
- Opracowanie metody wytrącania białek komórek gospodarza roślinnego za pomocą ciepła.
- Usprawnienie procesu rozwoju rekombinowanych leków biologicznych.
- Zwiększenie stabilności produktu końcowego.
Zastosowane metody
- Wytrącanie termiczne ekstraktów z tytoniu.
- Kontrola temperatury w celu indukowania agregacji białek.
- Kolejne techniki oczyszczania chromatograficznego.
- Prezentacja przeprowadzona przez studenta studiów magisterskich w laboratorium.
Główne wyniki
- Z ekstraktów usunięto ponad 90% HCP.
- Obróbka termiczna skutecznie powodowała agregację roślinnych HCP w temperaturze powyżej 60 °C.
- Metoda jest łatwa w implementacji i adaptowalna.
- Ułatwia oczyszczanie białek rekombinowanych.
Wnioski
- Wytrącanie termiczne jest skuteczną metodą usuwania HCP.
- Technika ta może zwiększyć wydajność procesów oczyszczania białek.
- Dalsze badania mogą zgłębić możliwość jej zastosowania w odniesieniu do innych białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zanieczyszczenie białkami komórek gospodarza (HCP) pozostaje krytycznym wąskim gardłem w oczyszczaniu biofarmaceutyków, szczególnie w systemach ekspresyjnych opartych na roślinach, gdzie wysokie obciążenie HCP utrudnia efektywność chromatograficzną. Niniejsze badanie ocenia trzy skalowalne metody wytrącania termicznego — blanszowanie całych liści tytoniu, obróbkę w reaktorze z mieszadłem oraz przetwarzanie w wymienniku ciepła — w celu selektywnej agregacji i usuwania HCP w temperaturach powyżej 60°C, co poprawia wyniki oczyszczania w dalszych etapach procesu. Umożliwiając uzyskanie wyższej czystości białka docelowego przed chromatografią, podejścia te wspierają intensyfikację procesu, zmniejszają zużycie buforów i zwiększają ogólną odporność procesu produkcji kandydatów na szczepionki oraz białek terapeutycznych wytwarzanych w roślinach.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę funkcjonalną białek docelowych poprzez redukcję interferencji HCP w procesach oczyszczania na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybki, oparty na obróbce termicznej etap klarowania, kompatybilny z przesiewaniem ekspresji w małej skali w gatunkach Nicotiana spp.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie klarownych ekstraktów z zredukowanym tłem białek gospodarza (HCP), co poprawia stosunek sygnału do szumu w późniejszych analizach immunologicznych i pomiarach aktywności.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie materiału wyjściowego, zapewniając powtarzalną wydajność chromatograficzną w kolejnych seriach badań.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera produkcję kandydatów na szczepionki, takich jak Vax8, o zwiększonej czystości, co ułatwia ocenę immunogenności i bezpieczeństwa.
- Wartość operacyjna: Integruje się z istniejącymi procesami perfuzji lub zbioru okresowego bez konieczności modyfikacji genetycznej gospodarza.
Integracja potoku i przepływu pracy
Wytrącanie termiczne pełni funkcję operacji jednostkowej pomiędzy etapem zbioru a chromatografią i znajduje zastosowanie w procesach otrzymywania rekombinowanych białek z roślin – od wczesnej fazy odkrywania po generowanie dostaw do badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Redukuje szum wywołany przez białka gospodarza (HCP) podczas detekcji białek docelowych, wspierając mechanistyczną minimalizację ryzyka w przypadku kandydatów na leki.
- Screening: Poprawia klarowność i filtrowalność ekstraktów, umożliwiając wiarygodny screening wysokoprzepustowej puryfikacji.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych wskaźników redukcji HCP (np. usunięcie 84–96%) oraz wzrostu czystości (np. DsRed z 0,1% do 27,6%) do porównania procesów.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność białek docelowych (np. Vax8, DsRed) po obróbce, umożliwiając kontynuację prac w zakresie formulacji i testowania skuteczności.
- Zastosowania korporacyjne: Możliwość adaptacji w różnych systemach ekspresji roślinnej i dla różnych białek docelowych przy minimalnej rewalidacji, co wspiera wdrożenie na poziomie platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność wyników oczyszczania dzięki spójnemu usuwaniu HCP oraz zmniejszonemu zanieczyszczeniu chromatograficznemu.
- Wartość operacyjna: Zwiększa wydajność filtrów głębinowych w etapie downstream (do 2,5-krotnie w naczyniu z mieszadłem) i zmniejsza częstotliwość wymiany buforu.
- Wartość strategiczna: Obniża ryzyko produkcyjne poprzez wczesne usuwanie zanieczyszczeń procesowych, co zmniejsza prawdopodobieństwo odrzucenia partii na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów pochodzenia roślinnego z uwzględnieniem ryzyka poprzez poprawę wczesnych wskaźników rozwijalności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu kontroli procesów termicznych oraz oceny stabilności białek, aby uniknąć denaturacji białka docelowego.
- Zależy od dostępu do naczyń z kontrolą temperatury, wymienników ciepła lub infrastruktury do blanszowania z precyzyjnym mieszaniem i monitorowaniem.
- Wymaga standaryzacji czasu blanszowania, temperatury i geometrii naczyń we wszystkich ośrodkach w celu zapewnienia powtarzalnego usuwania HCP.
- Wiąże się z kompromisami: blanszowanie może zmniejszyć wydajność filtra, natomiast stosowanie wymienników ciepła stwarza problemy z czyszczeniem, mimo ich skalowalności.
- Wymaga optymalizacji empirycznej za pomocą planowania eksperymentów (DoE), aby zrównoważyć usuwanie HCP, wydajność produktu oraz możliwość prowadzenia dalszych etapów procesu dla każdego białka docelowego.
