Name: Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę przygotowania organotypowych kultur grasicy w warstwach do modelowania selekcji pozytywnej i negatywnej limfocytów T. Technika ta umożliwia badanie migracji i sygnalizacji tymocytów w ich naturalnym mikrośrodowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Marilaine Fournier za jej komentarze do manuskryptu i Josée Tessier za pomoc techniczną. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 uzyskano w ramach programu wymiany NIAID, NIH. Wsparcie dla tych badań jest udzielane przez grant Fundacji SickKids i CIHR-IHDCYN (NI15-002), grant operacyjny z CIHR-III (MOP-142254) oraz fundusze na rozpoczęcie działalności z FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) i Fundacji Hôpital Maisonneuve-Rosemont dla HJM. HJM jest młodszym stypendystą FRQS, nowym badaczem CIHR (MSH-141967) i laureatem nagrody Cole Foundation Early Career Transition.

Protokoły wszystkich badań na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.
1. Zbieranie grasicy myszy w celu przygotowania plastrów grasicy i zawiesin jednokomórkowych
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy.</li>
	<li>W kapturze z przepływem laminarnym przypnij mysz brzuszną stroną do deski preparucyjnej. Spryskaj mysz 70% etanolem. Usuń nadmiar alkoholu, przecierając go gazą, aby zapobiec przedostawaniu się etanolu do jamy klatki piersiowej i uszkodzeniu tkanki.</li>
	<li>Podnieś skórę u podstawy mostka za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie przez skórę. Rozciągnij cięcie skóry w górę do każdej kończyny przedniej.</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe nacięcie u podstawy mostka, aby oddzielić przeponę od klatki piersiowej. Następnie przetnij każdą stronę klatki piersiowej w kierunku obojczyka. Odwróć klatkę piersiową w kierunku głowy, odsłaniając klatkę piersiową. Dwa płaty grasicy leżą na szczycie serca.</li>
	<li>Usuń tkankę łączną wokół płatów grasicy za pomocą kleszczy, nożyczek do mikropreparacji i/lub ostrych, zakrzywionych nożyczek. Użyj pary zakrzywionych kleszczyków z cienką końcówką, aby podnieść poszczególne płaty od spodu lub przez pozostałą tkankę łączną. 
	Uwaga: Nie chwytaj grasicy bezpośrednio.</li>
	<li>Umieść płatki grasicy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej PBS i odstaw na lód, aż będą potrzebne.</li>
</ol>
2. Osadzanie agarozy i krojenie wibratomem płatów grasicy
<ol>
	<li>Przygotować 4% roztwór agarozy do zatopienia, rozpuszczając 2 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml sterylnego PBS i podgrzewając w kuchence mikrofalowej na małym ogniu, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Przykryć kolbę folią aluminiową i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C do momentu przygotowania do użycia.</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej przygotuj kompletną pożywkę RPMI-1640, która zawiera 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 4 mM L glutaminy, 1x penicyliny/streptomycyny i 10 μM 2-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml kompletnej pożywki RPMI-1640 na studzienkę do 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i umieść wkładkę do hodowli komórkowej w każdym dołku. Odłożyć płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.</li>
	<li>Przygotuj błotnistą kąpiel lodowatą z wodą i lodem w wiaderku z lodem.</li>
	<li>Ostrożnie usuń całą pozostałą tkankę łączną otaczającą każdy płat grasicy za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Zrób to, gdy płat grasicy jest zanurzony w PBS w naczyniu do hodowli tkankowej, po przeniesieniu na chusteczkę nasączoną PBS lub pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Pozostawić agarozę do ostygnięcia poniżej 40 °C, kiedy kolba jest po prostu ciepła w dotyku, aby uniknąć przegrzania tkanki. Schłodzoną 4% agarozę wsypujemy do formy do bibułki na wysokość ~1 cm.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść płat grasicy na chusteczkę tkankową i delikatnie go przetoczyć, aby wysuszyć go bez uszkadzania tkanki. Upewnij się, że tkanka całkowicie wyschnie, w przeciwnym razie wysunie się z agarozy podczas krojenia.</li>
	<li>Ostrożnie włóż płatek do agarozy i ustaw go poziomo (aby zwiększyć powierzchnię każdego plasterka) lub pionowo (aby zwiększyć liczbę plasterków) na dnie formy. Umieść formę w lodowatej wodzie na 5-10 minut, aby agaroza zastygła.</li>
	<li>W tym czasie przygotuj wibratom do krojenia, montując tackę buforową, montując krążek próbki i wkładając ostrze wibratomu. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej na dysku z próbką. Wysterylizuj czystą, zmontowaną przestrzeń roboczą za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Gdy agaroza zastygnie, odwróć formę i delikatnie dociśnij jej środek, aby uwolnić płat osadzony w agarozie.</li>
	<li>Ostrym ostrzem przyciąć nadmiar agarozy otaczającej płat, pozostawiając ~2 mm agarozy z każdej strony i ~0,5 cm na dole.</li>
	<li>Przymocuj każdy blok agarozy za pomocą kropli kleju tkankowego do kawałka taśmy na krążku próbki. Na taśmie można przykleić wiele bloków.</li>
	<li>Dopasuj ostrze wibratomu do górnej części bloku agarozy. Napełnij tackę buforową sterylnym PBS, aż ostrze i blok(i) agarozy zostaną całkowicie zanurzone.</li>
	<li>Tkankę zatopioną w agarozie należy pokroić, aby uzyskać plastry o grubości 400-500 μm. Ustaw wibratom na prędkość 0,225 mm/s, częstotliwość 100 Hz i kąt 5°.</li>
	<li>Użyj wygiętej szpatułki, aby zebrać plastry grasicy na płytkę do hodowli tkankowej zawierającą sterylny PBS podczas ich krojenia. Odrzuć pierwszy i ostatni plasterek.</li>
	<li>Zbadaj plastry pod mikroskopem świetlnym przy 4-krotnym powiększeniu. Wybierz plastry z nienaruszoną tkanką grasiczą i otaczającą ją agarozą (ryc. 1A).</li>
	<li>Przenieś plastry na płytkę przygotowaną w kroku 2.3 za pomocą końcówki pipety, aby delikatnie wsunąć plasterek grasicy z wygiętej szpatułki na wkładkę do hodowli komórkowej. Każda wkładka może pomieścić ~3 plastry. Upewnij się, że plastry nie stykają się ze sobą ani ze ściankami wkładki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tymocytów do nałożenia
<ol>
	<li>Wyizolować płaty grasicy, jak opisano w punkcie 1. Odciąć płaty ręcznie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową za pomocą wysterylizowanego młynka do tkanek o pojemności 15 ml wypełnionego 5 ml sterylnego PBS zawierającego 2% FBS. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 545 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x bufor do lizy ACK (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA) w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w celu lizy czerwonych krwinek.</li>
	<li>Napełnić probówkę do 15 ml PBS zawierającym 2% FBS. Odwirować komórki przy 545 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS zawierającym 2% FBS i przepuścić komórki przez filtr siatkowy 255 μm.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować komórki w temperaturze 545 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS zawierającym 2% FBS w stężeniu 1 x10,7 komórek na ml.</li>
	<li>Oznacz komórki barwnikami komórkowymi, takimi jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE) zgodnie z protokołami producenta, jeśli nie używasz tymocytów od myszy wyrażających markery kongeniczne lub genetycznie kodowanych reporterów fluorescencyjnych, aby odróżnić je od komórek endogennych w warstwach.</li>
	<li>Po ostatecznym umyciu oznakowanych komórek, ponownie zawieś osad komórek w kompletnym podłożu RPMI-1640 w proporcji 1-3 x 106 komórek na 15 μl.</li>
</ol>
4. Nakładanie tymocytów na plastry grasicy
<ol>
	<li>Za pomocą pipety odessać płyn otaczający plastry grasicy na wkładce. 
	Uwaga: Uważaj, aby nie uszkodzić agarozy. Jeśli agaroza jest uszkodzona, nałożone tymocyty nie przyczepią się do powierzchni plastra z powodu utraty napięcia powierzchniowego.</li>
	<li>Nie dotykając plastra końcówką pipety, nałóż 15 μl tymocytów przygotowanych w sekcji 3 na każdy plasterek grasicy.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby umożliwić komórkom migrację do plastrów grasicy.</li>
	<li>Po 2 godzinach opłucz plastry grasicy 3 razy 1 ml PBS, aby usunąć nadmiar nałożonych tymocytów, które jeszcze nie migrowały do tkanki.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, aż plastry grasicy będą gotowe do zbioru, zwykle 1-72 godziny, w zależności od doświadczenia.</li>
</ol>
5. Dysocjacja wycinków grasicy w cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotuj probówkę do mikrowirówki dla każdego plasterka, dodając 150 μl PBS zawierającego 2% FBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS zawierającego 2% FBS do wkładki do hodowli tkankowej z plastrami grasicy i delikatnie wymieszać zgiętą szpatułką, aby oderwać plastry od powierzchni wkładki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Przenieś plasterek z wkładki do probówki mikrowirówki za pomocą wygiętej szpatułki.</li>
	<li>Ręcznie rozdrobnij plasterek za pomocą tłuczka do próbek z probówki do mikrowirówki. Dodać 150 μl PBS zawierającego 2% FBS do końcowej objętości 300 μl.</li>
	<li>Przefiltruj zdysocjowaną tkankę przez filtr 40 μm do nowej probówki do mikrowirówki. Przefiltrowane komórki są gotowe do barwienia do analizy cytometrii przepływowej40.</li>
	<li>Przefiltruj komórki po raz drugi przed przekazaniem ich do cytometru przepływowego, aby upewnić się, że cała agaroza została usunięta i nie zatkała cytometru przepływowego.</li>
	<li>Zdobądź komórki na cytometrze przepływowym i przeanalizuj dane, jak opisano wcześniej40.</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+thymic+positive+selection+and+the+mature+T+cell+repertoire+for+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen.</a> Immunity. 41, 181-190 (2014).</li>
<li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).</li>
<li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+migration+during+human+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Tracking migration during human T cell development.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).</li>
<li>Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+motility%3A+mutants%2C+movies+and+migration+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns.</a> Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).</li>
<li>Ross, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+in+the+positive+selection+of+CD8%2B+T+cells+distinguished+by+intrathymic+migration+and+T-cell+receptor+signaling+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).</li>
<li>Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR4+promotes+medullary+entry+and+thymocyte-dendritic+cell+interactions+required+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance.</a> J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+Orchestrates+a+Thymic+Program+of+Self-Antigen+Expression+for+Immune+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance.</a> Cell. 163, 975-987 (2015).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Stritesky, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+thymic+selection+quantified+using+a+unique+method+to+capture+deleted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+thymus+organ+cultures+and+T-cell+receptor+repertoire+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development.</a> Immunology. 100, 405-410 (2000).</li>
<li>Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of T cell development.</a> Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).</li>
<li>de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+potential+and+development+in+vitro%3A+the+OP9-DL1+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach.</a> Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).</li>
<li>Lian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymically+injected+hemopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+all+lineage+cells+in+the+thymus%3A+differences+between+c-kit%2B+cells+and+c-kit+%3C+low+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells.</a> Stem Cells. 15, 430-436 (1997).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrathymic Injection.</a> Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+thymocytopoiesis+in+rats+and+mice.+I.+Kinetics+of+appearance+of+thymocytes+using+a+direct+intrathymic+adoptive+transfer+assay+for+thymocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors.</a> J Exp Med. 163, 1-17 (1986).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+T+lymphocytes+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).</li>
<li>Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+and+functional+evaluation+of+in+vitro+generated+to+ex+vivo+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells.</a> J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li>
<li>Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells+provide+unique+signals+for+positive+selection+of+CD4%2BCD8%2B+thymocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro.</a> J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+dendritic+cells+and+B+cells+in+the+clonal+deletion+of+Mls-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus.</a> J Exp Med. 173, 539-547 (1991).</li>
<li>Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cytolytic+T+lymphocyte+precursors+in+organ-cultured+mouse+embryonic+thymus+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments.</a> J Exp Med. 155, 617-622 (1982).</li>
<li>Fairchild, P. J., Austyn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+predispose+the+fetal+thymus+to+positive+selection+of+CD4%2BCD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells.</a> Immunology. 85, 292-298 (1995).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).</li>
<li>Le Borgne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li>
<li>Ueda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mst1+regulates+integrin-dependent+thymocyte+trafficking+and+antigen+recognition+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus.</a> Nat Commun. 3, 1098(2012).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%3A+a+timeline+for+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection.</a> PLoS Biol. 11, e1001566(2013).</li>
<li>Halkias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+chemokine+gradients+control+human+thymocyte+migration+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ.</a> J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).</li>
<li>Au-Yeung, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+requirements+revealed+for+Zap70+catalytic+activity+during+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development.</a> Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).</li>
<li>Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+temporal+patterns+of+T+cell+receptor+signaling+during+positive+versus+negative+selection+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ.</a> Sci Signal. 6, (2013).</li>
<li>Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+thymic+positive+and+negative+selection+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry.</a> J Vis Exp. (68), e4269(2012).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1-deficient+mice+have+no+mature+B+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes.</a> Cell. 68, 869-877 (1992).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+regulatory+T+cell+niche+size+is+dictated+by+limiting+IL-2+from+antigen-bearing+dendritic+cells+and+feedback+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition.</a> Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).</li>
<li>Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+interactions+and+sustained+TCR+signaling+characterize+thymocyte-thymocyte+interactions+that+support+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection.</a> J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+mice+expressing+different+GFP+variants+for+multiple+non-invasive+reporter+usage+within+a+single+animal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal.</a> BMC Biotechnol. 2, (2002).</li>
<li>Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+antigen-dependent+CD8%2B+T-cell%2F+dendritic+cell+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo.</a> Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisano protokół przygotowania plastrów grasicy i reprezentatywne wyniki skutecznej pozytywnej i ujemnej selekcji nałożonych na siebie transgenicznych tymocytów TCR klasy I ograniczonych przed selekcją MHC za pomocą cytometrii przepływowej. System ten został wykorzystany z podobnym powodzeniem do wspierania pozytywnej selekcji limfocytów T CD4 + z ograniczeniami MHC klasy II z preselekcji tymocytów DP32 oraz, w obecności antygenu agonistycznego, selekcji negatywnej i rozwoju Treg<...

Limfocyty T różnicują się poprzez szereg pośrednich procesów rozwojowych w grasicy, podczas których napotykają kilka punktów kontrolnych, które zapewniają wytworzenie funkcjonalnego, samotolerancyjnego repertuaru limfocytów T1-3. Selekcja pozytywna sprzyja przetrwaniu tymocytów z receptorami limfocytów T (TCR) zdolnymi do rozpoznawania, z niskim lub umiarkowanym powinowactwem, peptydu prezentowanego przez główne cząsteczki kompleksu zgodności tkankowej (MHC) na komórkach nabłonka grasicy korowej (cTEC)2,3. Selekcja negatywna i rozwój regulatorowych limfocytów T (T reg) przyczyniają się do ustanowienia samotolerancji poprzez eliminację lub przekierowanie tymocytów, które silnie reagują na autopeptyd prezentowany przez MHC2,4. Niedojrzałe podwójnie dodatnie (DP) tymocyty CD4 + CD8 + eksprymujące TCR, które przechodzą proces selekcji, różnicują się w dojrzałe subpopulacje limfocytów T, z których większość to cytotoksyczne limfocyty T CD8 + z ograniczeniami MHC klasy I lub pojedyncze dodatnie (SP) limfocyty pomocnicze CD4 + klasy II z ograniczeniami MHC, przed opuszczeniem grasicy w celu pełnienia funkcji efektorowych w wtórnych narządach limfatycznych1-3.

Dodatkowym czynnikiem komplikującym rozwój limfocytów T jest dynamiczna migracja i spotkania komórkowe rozwijających się tymocytów w całej sieci komórek zrębu5-9. Te komórki zrębu odgrywają różne role w rozwoju tymocytów i są różnie rozmieszczone między obszarami kory grasiczej i rdzenia, w których zachodzi selekcja pozytywna i negatywna10. Chociaż selekcja pozytywna zachodzi głównie w korze mózgowej, istnieje coraz więcej dowodów na to, że tymocyty DP migrują do rdzenia i nadal wymagają sygnałów TCR, zanim zróżnicują się w dojrzałe limfocyty T, co sugeruje, że rdzeń może dostarczać dodatkowych sygnałów niezbędnych do zakończenia selekcji pozytywnej i różnicowania linii11,12. Ponadto, pomimo obecności wyspecjalizowanych komórek nabłonka rdzeniastego grasicy (mTEC), które wyrażają i prezentują antygeny o ograniczonych ograniczeniach tkankowych, ułatwiające delecję autoreaktywnych tymocytów13,14, duża część selekcji negatywnej zachodzi w korze w odpowiedzi na wszechobecny autopeptyd prezentowany przez komórki dendrytyczne15,16. W związku z tym dokładne modele rozwoju limfocytów T muszą zapewniać wysoce zorganizowane mikrośrodowisko grasicy, z nienaruszonymi obszarami korowymi i rdzeniowymi, które ułatwia interakcję między tymocytami a komórkami zrębu i wspiera migrację tymocytów, gdy komórki te przechodzą selekcję pozytywną i negatywną.

Aby uzupełnić analizy ex vivo tymocytów jako sposób badania selekcji pozytywnej i negatywnej, opracowano szereg modeli rozwoju limfocytów T in vitro, in situ i in vivo 17-22. Niezwykle trudno było podsumować selekcję pozytywną in vitro, ale kokultura populacji komórek macierzystych lub prekursorów limfocytów T z komórkami zrębu eksprymującymi ligand Notch, w szczególności komórki OP9-DL1 / 4, ma zdolność do wspierania zaangażowania linii T i ograniczonej selekcji pozytywnej, co czyni go nieocenionym modelem in vitro do badania rozwoju limfocytów T23-25. Do ograniczeń tego systemu należy jednak fakt, że komórki te nie mają unikalnej maszynerii przetwarzania peptydów, którą można znaleźć w komórkach zrębu grasicy i trójwymiarowym mikrośrodowisku grasicy.

Chociaż bardziej skomplikowane technicznie, modele selekcji grasiczy in situ i in vivo mogą pokonać niektóre bariery związane z systemami in vitro. Reagregowane kultury narządów grasicy (RTOC) zawierają określone mieszaniny tymocytów i komórek zrębu grasicy18,26,27. Te reagregacje komórek nabłonka grasicy utrzymują ekspresję MHC klasy I i II i mogą wspierać rozwój obu konwencjonalnych podzbiorów limfocytów T, ale nadal nie mają zdefiniowanych struktur korowych i rdzeniowych. Pohodowla narządów grasicy płodu (FTOC) jest popularnym modelem rozwoju limfocytów T, który może być zasiewany tymocytami poprzez hodowlę limfodeplementów limfodepletowych płatów grasicy w zawieszeniu lub poprzez wstrzyknięcie tymocytów do limfoforestetycznych płatów grasicy i wspierać wydajny rozwój limfocytów T CD4 + i CD8 + w czasie w hodowli18,28-31. W momencie inicjacji posiewu płatów grasicy płodu występuje niedobór mTEC, ale określone struktury korowe i rdzeniowe mogą rozwijać się z czasem w zależności od warunków. Ważną kwestią jest to, że model ten może preferencyjnie wspierać rozwój limfocytów T płodu w porównaniu z dorosłymi. Wreszcie, dograsicze wstrzyknięcie zdefiniowanych prekursorów grasicy u dorosłych myszy jest technicznie trudne, ale wyraźnie zapewnia środowisko do wspierania rozwoju limfocytów T in vivo. Te modele in situ i in vivo są doskonałymi narzędziami do badania rozwoju limfocytów T, a ich zastosowanie powinno być rozważane na zasadzie eksperymentu z osobna.

Plastry grasicy pojawiły się jednak ostatnio jako wszechstronny, uzupełniający model do badania selekcji grasicy in situ z możliwością dostosowania się do unikalnych, złożonych i ogólnie bardziej wydajnych eksperymentów. Plastry grasicy utrzymują integralność obszarów korowych i rdzeniowych oraz zapewniają szkielet komórek zrębu, który wspiera migrację tymocytów podczas rozwoju, a także wydajną selekcję pozytywną i negatywną11,32-39. Podzbiory tymocytów dodane do wycinków grasicy migrują do tkanki i do odpowiedniej niszy mikrośrodowiskowej34,37. Nałożone tymocyty można odróżnić od endogennych komórek wycinka grasicy za pomocą markerów kongennych lub znaczników fluorescencyjnych i można je przechowywać w hodowli przez kilka dni. Hodowle organotypowe plastrów grasicy mogą być wykorzystywane do badania różnych aspektów rozwoju limfocytów T, w tym między innymi selekcji grasicy, zachowania tymocytów (migracja i interakcje komórkowe) oraz lokalizacji tymocytów. Biorąc pod uwagę możliwość wygenerowania ~20 wycinków grasicy na mysz, skalowalność eksperymentów jest na ogół większa niż w przypadku innych modeli selekcji grasicy in situ. Chociaż przygotowanie plastrów grasicy wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak wibratom, a czas życia plastrów grasicy w hodowli jest ograniczony ze względu na utratę komórek w czasie w wyniku śmierci komórki i brak błony otaczającej, plastry grasicy stanowią doskonały model do analizy selekcji grasicy zsynchronizowanych populacji tymocytów w dojrzałym mikrośrodowisku grasicy. W tym miejscu opisujemy przygotowanie plastrów grasicy (w tym zbieranie grasicy, osadzanie płatów grasicy w agarozie i wibratome cięcia osadzonej tkanki), izolację i nakładanie tymocytów oraz dysocjację wycinków grasicy do analizy cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50080</td><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td></tr><tr><td>Forma do zatapiania (ścięta - T12)</td><td>Polietyleny</td><td>18986</td><td>22 mm x 22 mm kwadrat, ścięty do 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Ostrza przygotowawcze z podwójną krawędzią</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klej do tkanek</td><td>3M&nbsp;</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>0,4 i mikro; m Wkładki do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Spośród kilku testowanych marek, te utrzymywały komórki na wierzchu plastrów najlepsze</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>ThermoFisher</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 z L-glutaminą</td><td>Żubr</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Żubr</td><td></td><td>080-110</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Żubr</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna, 100x</td><td>Żubr</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Młynki do tkanek Tenbroeck</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Dostawa komponentów</td> filtra<td>z siatki nylonowej</td><td>U-CMN-255</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do mikrowirówki</td><td>Bel-Art</td><td>F19922-0000</td><td></td></tr><tr><td>40 i mikro; m Nylonowy sitko komórkowe</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Inox Tip</td><td>Dumont&nbsp;</td><td>RS-5047</td><td>Kleszcze zakrzywione z cienką końcówką, rozmiar .17 x .10 mm</td></tr><tr><td>Mikrokleszcze</td><td>Dumont&nbsp;</td><td>Złącze RS-5090&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Selekcja grasicy przebiega w unikalnym i wysoce zorganizowanym mikrośrodowisku grasicy, co prowadzi do powstania funkcjonalnego, samotolerancyjnego repertuaru limfocytów T. Modele in vitro do badania zaangażowania i rozwoju linii T dostarczyły cennych informacji na temat tego procesu. Jednak systemy te nie mają pełnego trójwymiarowego środowiska grasicy niezbędnego do rozwoju limfocytów T, a zatem są niekompletnymi przybliżeniami selekcji grasicy in vivo. Niektóre z wyzwań związanych z modelowaniem rozwoju limfocytów T można przezwyciężyć poprzez zastosowanie modeli in situ, które zapewniają nienaruszone mikrośrodowisko grasicy, które w pełni wspiera selekcję grasicy rozwijających się komórek T. Organotypowe hodowle plastrów grasicy uzupełniają istniejące techniki in situ. Plastry grasicy zachowują integralność obszarów kory grasicy i rdzenia oraz stanowią platformę do badania rozwoju nałożonych tymocytów o określonym stadium rozwojowym lub endogennych limfocytów T w dojrzałym mikrośrodowisku grasicy. Biorąc pod uwagę możliwość generowania ~20 wycinków na mysz, wycinki grasicy stanowią wyjątkową zaletę pod względem skalowalności w przypadku eksperymentów o wysokiej przepustowości. Co więcej, względna łatwość generowania wycinków grasicy i możliwość nakładania różnych podzbiorów grasicy lub innych populacji komórek z różnych środowisk genetycznych zwiększa wszechstronność tej metody. W tym miejscu opisano protokół przygotowania plastrów grasicy, izolacji i nakładania tymocytów oraz dysocjacji plastrów grasicy do analizy cytometrii przepływowej. System ten można również dostosować do badania niekonwencjonalnego rozwoju limfocytów T, a także do wizualizacji migracji tymocytów, interakcji komórek tymocyt-zręb oraz sygnałów TCR związanych z selekcją grasicy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przekroje grasicy umożliwiają analizę różnych aspektów rozwoju limfocytów T, takich jak selekcja pozytywna i negatywna. Dla powodzenia eksperymentów kluczowa jest jakość przekroju grasicy. W związku z tym należy zbadać przekroje grasicy, aby upewnić się, że tkanka grasicy jest nienaruszona, a otaczający ją agar pozostaje w całości (Rycina 1A). Uszkodzenie agaru może zaburzyć napięcie powierzchniowe, co prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby tymocytów m...

Opisujemy przygotowanie wycinków grasicy, które w połączeniu z cytometrią przepływową mogą być użyte do modelowania pozytywnej i negatywnej selekcji rozwijających się limfocytów T. Plastry grasicy można również przystosować do analizy in situ migracji, lokalizacji i sygnalizacji tymocytów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii dwufotonowej.

Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie skrawków grasicy, które w połączeniu z cytometrią przepływową mogą służyć do modelowania selekcji pozytywnej i negatywnej rozwijających się limfocytów T. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju limfocytów T, takie jak sygnały regulujące selekcję pozytywną i negatywną rozwijających się limfocytów T in situ. Główną zaletą tej techniki jest to, że skrawki grasicy zachowują integralność kory i rdzenia grasicy, zapewniając platformę do badania rozwoju określonych subpopulacji tymocytów w nienaruszonym mikrośrodowisku grasicy.Zacznij od przypięcia uśpionej myszy do deski sekcyjnej stroną brzuszną do góry. Spryskaj mysz 70% etanolem, a następnie osusz nadmiar etanolu gazikiem, aby zapobiec jego przedostaniu się do jam klatki piersiowej i uszkodzeniu tkanek. Następnie, za pomocą pęsety unieś skórę u podstawy mostka i wykonaj nacięcie skóry.Przedłuż cięcie skóry w górę w kierunku każdej z kończyn przednich. Wykonaj dodatkowe cięcie u podstawy mostka, aby oddzielić przeponę od klatki piersiowej. Następnie przetnij klatkę piersiową po obu stronach w kierunku obojczyka i odchyl ją w stronę głowy, odsłaniając jamę klatki piersiowej.Dwa płaty grasicy znajdują się nad sercem. Używając pęsety i nożyczek do mikrodissekcji, usuń tkankę łączną otaczającą płaty grasicy. Następnie użyj pęsety zakrzywionej z cienkimi końcami, aby podnieść poszczególne płaty od spodu lub za pomocą pozostałej tkanki łącznej.Umieść płaty grasicy w 15 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej PBS i odstaw na lód do momentu użycia. Najpierw przygotuj czteroprocentową agarozę do zatapiania, rozpuszczając dwa gramy agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 mililitrach sterylnego PBS i podgrzewając w mikrofalówce na niskim ustawieniu, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Przykryj kolbę folią aluminiową i umieść w kąpieli wodnej w temperaturze 55 stopni Celsjusza do czasu użycia.W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy dodać 1,5 mililitra kompletnej pożywki RPMI-1640 do dołków płytki hodowlanej z sześcioma dołkami. Następnie w każdym dołku należy umieścić insert do hodowli komórkowych. Płytkę należy odstawić do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia dalszych prac.Przygotuj kąpiel w lodowatej wodzie z lodu i wody w wiaderku z lodem. Przenieś płaty grasicy na chusteczkę do tkanek nasączoną PBS i ostrożnie usuń pozostałą tkankę łączną otaczającą każdy płat grasicy za pomocą pęsety z cienkimi końcami. Przenieś materiał do naczynia do hodowli tkanek zawierającego PBS.Po odczekaniu, aż agaroza ostygnie do temperatury, w której kolba jest ledwie ciepła w dotyku, wlej schłodzoną czteroprocentową agarozę do formy do tkanek, osiągając wysokość około jednego centymetra. Następnie za pomocą pincety ostrożnie chwyć płat grasicy za pozostałą tkankę łączną i delikatnie przetocz go po ręczniku papierowym, aby osuszyć go bez uszkodzenia tkanki. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie sucha, w przeciwnym razie wysunie się z agarozy podczas krojenia.Ostrożnie włóż płat do agarozy i umieść go na dnie formy, albo poziomo, aby zwiększyć powierzchnię każdego przekroju, albo pionowo, aby zwiększyć liczbę uzyskiwanych przekrojów. Umieść formę w lodowatej wodzie na od 5 do 10 minut, aby umożliwić stężenie agarozy. W tym czasie przygotuj wibrotom do krojenia, montując taczkę z buforem, wkładając ostrze wibrotomu i montując dysk do preparatu.Naklej kawałek taśmy laboratoryjnej na dysk z preparatem. Na koniec wysterylizuj czysty, przygotowany obszar roboczy 70% etanolem. Po zestaleniu się agarozy odwróć formę i delikatnie naciśnij jej środek, aby uwolnić zatopiony w agarozie płatek.Następnie za pomocą ostrego ostrza należy odciąć nadmiar agarozy wokół płata, pozostawiając około dwóch milimetrów agarozy po każdej stronie oraz 0,5 centymetra u dołu. Nanieś kroplę kleju tkankowego na kawałek taśmy na dysku do preparatów i przymocuj blok agarozy do taśmy na dysku. Na taśmie można przykleić wiele bloków.Następnie należy wyrównać ostrze wibrotomu z górną krawędzią bloku agarozowego, a następnie napełnić tackę buforową sterylnym PBS, aż ostrze i bloki agarozowe zostaną całkowicie zanurzone. Ustawić parametry cięcia w wibrotomie. Wyciąć plastry z tkanki zatopionej w agarozie, aby uzyskać przekroje o grubości od 400 do 500 mikronów.Użyj wygiętej szpatułki, aby zbierać wycinki grasicy do płytki hodowlanej z jałowym PBS w miarę ich wycinania. Obejrzyj wycinki pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 4X. Wybierz wycinki z nienaruszoną tkanką grasicy i otaczającą ją agarozą.Następnie za pomocą końcówki pipety delikatnie przesuń plaster grudki tymusa z zgiętej szpatułki na wkłady do hodowli komórkowej w płytce sześciodołkowej. Każdy wkład może pomieścić do trzech plastrów. Przechowuj płytkę w temperaturze 37 °C do momentu użycia.Po wyizolowaniu płatów grasicy od myszy kongenicznych, analogicznie jak poprzednio, należy użyć sterylnego rozcieracza do tkanek o pojemności 15 ml wypełnionego pięcioma mililitrami sterylnego PBS zawierającego 2% FBS w celu manualnej dysocjacji płatów. Zawiesinę pojedynczych komórek należy przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Komórki należy odwirować przy 545 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po odlaniu supernatantu komórki ponownie zawiesić w jednym mililitrze buforu do lizy ACK 1X i inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty w celu lizy erytrocytów. Następnie dopełnić objętość w probówce do 15 mililitrów za pomocą PBS zawierającego 2% FBS. Wirować komórki przy 545 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w 10 mililitrach PBS zawierającego dwa procent FBS, przepuść komórki przez filtr siatkowy o rozmiarze oczek 255 mikronów. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Po odwirowaniu komórek przy 545 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ponownie zawieś osad komórkowy w kompletnej pożywce RPMI-1640 w zagęszczeniu od 1 do 3 × 10⁶ komórek na 15 mikrolitrów, a następnie przejdź do nakładania tyminocytów.Używając pipety, ostrożnie odessij PBS otaczający skrawki grasicy na wkładzie, uważając, aby nie uszkodzić agarozy. Nie dotykając skrawka końcówką pipety, nanieś 15 µL przygotowanych tymocytów na każdy skrawek grasicy. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez dwie godziny, aby umożliwić komórkom migrację do wnętrza skrawków grasicy.Po dwóch godzinach przemyj skrawki grasicy trzykrotnie jednym mililitrem PBS, aby usunąć nadmiar nałożonych tymocytów, które nie zmigrowały jeszcze do tkanki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C do czasu, aż skrawki grasicy będą gotowe do zbioru, zazwyczaj od 1 do 72 godzin w zależności od eksperymentu. Na skrawkach grasicy naniesiono predeselekcjonowane transgeniczne tymocyty z receptorami dla komórek T ograniczonych przez MHC klasy I, a następnie za pomocą cytometrii przepływowej monitorowano rozwój dojrzałych, pojedynczo dodatnich komórek T CD4+ lub CD8+.W przypadku nałożenia na przekroje grasicy z knockoutem beta 2m, przedselekcyjne tyreocyty transgeniczne pod kątem receptora komórek T OT-1 pozostają w stadium podwójnie dodatnim i nie generują istotnej ilości pojedynczo dodatnich komórek T CD8+. W przeciwieństwie do tego, po nałożeniu na przekroje grasicy typu dzikiego, zawierające endogenne ligandy selekcyjne, rozwój komórek T CD8+ po 72 godzinach wykazuje zdolność tego modelu do wspierania selekcji pozytywnej. Aby zamodelować selekcję negatywną w odpowiedzi na powszechnie występujący antygen, tyreocyty z myszy typu dzikiego znakowane CTV oraz tyreocyty z myszy transgenicznych pod kątem receptora komórek T OT-1 z knockoutem RAG-1 znakowane CFSE zmieszano w stosunku jeden do jednego i nałożono na przekroje typu dzikiego w obecności lub przy braku peptydu owalbuminy.Po 24 godzinach inkubacji względne proporcje nałożonych komórek przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Na tym obrazie przedstawiono względne stosunki żywych, CFSE-dodatnich komórek transgenicznych OT-1 do żywych, CTV-dodatnich fragmentów komórek typu dzikiego po inkubacji z peptydem owalbuminy lub bez niego. Spadek względnej proporcji transgenicznych komórek OT-1 oznacza selekcję negatywną komórek transgenicznych OT-1 w obecności peptydu owalbuminy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowywania skrawków grasicy, izolowania tymocytów oraz nakładania komórek na skrawki grasicy w celu analizy ich rozwoju in situ. Skrawki grasicy mogą być również wykorzystywane w innych zastosowaniach, takich jak immunofluorescencja i mikroskopia dwufotonowa, aby określić lokalizację tymocytów, ich migrację, interakcje komórkowe oraz sygnalizację receptorów limfocytów T podczas selekcji grasiczej.

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Poznaj metodę przygotowania organotypowych kultur grasicy w warstwach do modelowania selekcji pozytywnej i negatywnej limfocytów T. Technika ta umożliwia badanie migracji i sygnalizacji tymocytów w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Przeglądaj więcej filmów