Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Ogólnym celem niniejszego protokołu indukcji hemogennej jest zainicjowanie procesu rozwojowego w fibroblastach mysich poprzez nadekspresję czynników transkrypcyjnych, aby wygenerować in vitro komórki prekursorowe krwiotwórcze, które po przedłużonej hodowli produkują komórki krwiotwórcze. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie programowania krwiotwórczego, takie jak to, czy można opracować protokół pozwalający na uzyskanie de novo prawdziwych HSC, które są zdolne do różnicowania wieloliniowego i graftmentu. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki nadekspresji minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych proces rozwojowy może zostać zainicjowany w przeprogramowanych komórkach bez konieczności przechodzenia przez etap pośredni w formie pluripotencji.

Po wyhodowaniu embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) i wyprodukowaniu wirusa zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć 0,1% żelatyny w PBS do wstępnego pokrycia płytek 6-dołkowych. Należy upewnić się, że żelatyna pokrywa całą powierzchnię dołka. Płytki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 20 minut.

Następnie wyjmij płytki i odessij żelatynę. Wysiej MEF w standardowej pożywce DMEM z gęstością 25 000 komórek na dołek i pozostaw komórki do osadzenia w temperaturze 37 °C przez noc. Przygotuj 100 µl koktajlu wirusowego, mieszając 50 µl M2RTTA oraz po 12,5 µl GATA2, GFI1B, CFOS i ETV6.

Odssać pożywkę z MEFS i dodać dwa mililitry standardowego DMEM z 8 µg/mL bromku heksadymetryny. Następnie przeprowadzić transdukcję każdego dołka MEF, dodając 15 µl koktajlu wirusowego, i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Po 16 do 20 godzinach inkubacji wymienić pożywkę w każdym dołku na dwa mililitry świeżego standardowego DMEM, uzupełnionego o 1 µg/mL DOX.

Inkubować w temperaturze 37°C przez trzy dni. W czwartym dniu przygotować pożywkę do kultur hematopoetycznych uzupełnioną o hydrokortyzon, czynnik stymulujący komórki macierzyste (SCF), ligand kinazy tyrozynowej 3 związanej z MFS, interleukinę 3, interleukinę 6 oraz DOX. Następnie odessać pożywkę z MEF i użyć 1 mL PBS do przemycia komórek.

Następnie, po odessaniu PBS, dodaj do każdej studzienki jeden mililitr 0,05% trypsyny w celu dysocjacji i zebrania komórek. Za pomocą hemocytometru policz komórki, a następnie wiruj je przy 300 ×g przez pięć minut i użyj 12 mililitrów świeżo przygotowanego medium hematopoetycznego, aby resuspenderć komórki. Następnie wysiej 10 000 komórek na studzienkę na sześciostudzienkowych płytkach pokrytych żelatyną.

Przez cały czas trwania hodowli wymieniaj medium co sześć dni na świeże, suplementowane medium do hodowli hematopoetycznej. Analizuj komórki zgodnie z protokołem tekstowym. Po wyjęciu łożysk od ciężarnych myszy zgodnie z protokołem tekstowym, użyj od dwóch do pięciu mililitrów 0,2% kolagenazy typu one w PBS z 20% FBS, aby wypłukać tkankę, a następnie, używając igły o rozmiarze 18G założonej na strzykawkę o pojemności pięciu mililitrów, zdysocjuj tkankę mechanicznie w roztworze PBS.

Inkubować komórki łożyska w dwóch do pięciu mililitrów roztworu kolagenazy w temperaturze 37°C przez 1,5 godziny. Następnie kilkukrotnie przepuścić komórki przez igły o rozmiarze 20 do 25 G założone na strzykawki 5 ml w celu dalszej dysocjacji mechanicznej. Następnie przefiltrować zawiesiny pojedynczych komórek przez sita komórkowe o rozmiarze 70 µm.

Następnie, używając komory Bürкера, policz komórki i napromieniuj je dawką 2 000 cGy w celu inaktywacji mitotycznej. Do szalki o średnicy dziesięciu centymetrów dodaj dziesięć mililitrów pożywki do hodowli krwiotwórczej uzupełnionej o poniższe składniki. Umieść filtr 0,65 µm bezpośrednio na pożywce w szalce, pozwalając mu pływać w celu stworzenia interfejsu ciecz-gaz, a następnie odstaw szalkę.

Dysocjować przetransdukowane MEF w 25. dniu, zgodnie z wcześniejszą instrukcją w tym filmie, a następnie zmieszać 33 000 przetransdukowanych MEF ze 167 000 komórek mitotycznie inaktywowanych agregatów łożyskowych. Aby utworzyć agregat, odwirować mieszaninę MEF i komórek łożyska z prędkością 300 ×g przez pięć minut. Odessać medium i użyć od 30 do 50 µL standardowego DMEM do resuspensji osadu komórkowego, pobierając zawiesinę pojedynczych komórek do nieściętej końcówki pipety o pojemności 200 µL.

Następnie za pomocą folii parafinowej uszczelnij końcówkę pipety. Potem umieść zablokowaną końcówkę w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj z prędkością 300 ×g przez pięć minut, aż na zakrytym końcu końcówki utworzy się osad. Ostrożnie wyjmij końcówkę z probówki 15 ml i zamocuj ją na końcu pipety P200.

Usuń folię parafinową i wyciśnij osad komórkowy na filtr pływający w naczyniu z pożywką hodowlaną. Hoduj agregaty na pływających filtrach w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 przez cztery do pięciu dni. Za pomocą skrobaka do komórek zbierz agregaty, a następnie połącz je i poddaj trawieniu przy użyciu 0,5% kolagenazy.

Po dysocjacji należy użyć od dwóch do pięciu mililitrów PBS z pięcioprocentowym FBS, aby wypłukać agregaty, a następnie odwirować je przy 300 ×g przez pięć minut. Agregaty należy resuspender w 500 µL DMEM bez FBS, Pen-Strep lub L-glutaminy. Całą zawiesinę dodaje się do trzech mililitrów jednego procentowego medium z metylocelulozą uzupełnionego o 10 ng/mL Tepo, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.

Rozlej równe objętości tej mieszaniny do trzech niepowlekanych szalek hodowlanych o wymiarach 35 x 10 mm w celu przeprowadzenia analizy CFU. W ramach kontroli przeprowadź hodowlę napromieniowanych agregatów łożyskowych. Na koniec, po 10–14 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, dokonaj ręcznego przeliczenia kolonii krwiotwórczych pod mikroskopem.

W procesie przeprogramowania MEF w HSC komórki są transdukowane czynnikami transkrypcyjnymi, jak pokazano tutaj. Po trzech dniach ekspansji i ekspozycji na DOX w celu rozpoczęcia aktywacji transgenu, komórki są dysocjowane, dzielone i hodowane na płytkach powlekanych żelatyną w uzupełnionej pożywce hematopoetycznej. W 20. dniu hodowli, po transdukcji w pożywce do przeprogramowania, MEF 34/H2BGFP wykazują wyraźne zmiany morfologiczne, w tym morfologię endotelialną odmienną od MEF.

Dalsza hodowla do 35. dnia skutkuje pojawieniem się kilku okrągłych komórek przypominających komórki krwiotwórcze, wywodzących się z pośrednich komórek przypominających komórki śródbłonka; komórki te są dodatnie pod kątem GFP oraz wykazują pozytywne barwienie dla markerów krwiotwórczych Sca1 i CD45. Dalsza hodowla prowadzi do powstania komórek wykazujących ekspresję CD45 przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji ludzkiego reportera CD34. Po agregacji łożyskowej komórki hodowlane nabywają potencjału klonogennego i tworzą w metylocelulozie kolonie zawierające różne morfologie krwiotwórcze oraz komórki blastopodobne.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby każdą sekcję realizować powoli, aby uniknąć pomyłek. Wszelkie błędy będą trudne do zauważenia aż do czasu upływu kilku tygodni od rozpoczęcia przeprogramowania. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak testy tworzenia kolonii typu cobblestone oraz testy inicjowania hodowli długoterminowej, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład czy pochodne komórki rzeczywiście posiadają funkcję krwiotwórczą, co zostanie wykazane w testach funkcjonalnych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie programowania hematopoetycznych komórek macierzystych do eksploracji innych strategii przeprogramowania i protokołów optymalizacji w komórkach krwi, śródbłonka i innych typach komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować program hemogenny w fibroblastach mysich, jak przeprowadzić nadekspresję czynników transkrypcyjnych oraz w jaki sposób funkcjonalnie ocenić pochodną komórkę. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.