Name: Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka. Ta technika umożliwia nieograniczoną produkcję komórek T specyficznych dla guza w immunoterapii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Deborah Postiff i Pani Jackline Barikdar z Tissue Procurement Core oraz dr Cindy DeLong z Pluripotent Stem Cell Core Laboratory na Uniwersytecie Michigan za jej pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez fundusze start-upów University of Michigan i granty z Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance i NIH/NCI (1K08CA197966-01) dla F. Ito.

UWAGA: Pacjenci powinni wyrazić świadomą zgodę na udział w badaniu zatwierdzonym przez Institutional Review Board i Human Pluripotent Stem Cell Committee.
1. Izolacja i kultura TIL
<ol>
	<li>Uzyskaj materiał nowotworowy, który nie jest wymagany do diagnozy histopatologicznej, z usługi patomorfologicznej/rdzenia do pobierania tkanek. Umieść 20-100 g próbek guza w 50-mililitrowej probówce z 30 ml pożywki do zbierania guza (Tabela 1).</li>
	<li>Wypreparuj twardą, twardą, normalną tkankę próbki guza z delikatnych i/lub krwawych martwiczych obszarów za pomocą nożyczek. Po usunięciu tkanki martwiczej użyj nożyczek, aby zmielić próbkę tak mało, jak to możliwe.</li>
	<li>Zdysocjuj zmieloną próbkę do zawiesiny jednokomórkowej za pomocą dysocjatora i zestawu do dysocjacji guza (człowieka) zgodnie z instrukcjami producenta. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sitka o pojemności 70 μm, które jest umieszczone na probówce o pojemności 50 ml i przemyć sitko 2 razy 2 ml RPMI 1640.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki z limfocytów T (Tabela 1).</li>
	<li>Przygotować dwustopniowy roztwór gradientowy, taki jak Ficoll (roztwór gradientowy) w probówce o pojemności 50 ml, z dolnym krokiem 10 ml 100% roztworu gradientowego i środkowym krokiem 30 ml 75% roztworu gradientowego rozcieńczonego buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu (D-PBS(-)).</li>
	<li>Nałożyć zawiesinę komórek (z kroku 1.4) na roztwór gradientowy (z kroku 1.5). Wirować przy 400 x g w temperaturze 20 °C przez 45 min.</li>
	<li>Zebrać warstwę zawierającą wzbogacone TIL na granicy faz między roztworem o 100% gradiencie a roztworem o 75% gradiencie w probówce o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć warstwę roztworu wzbogaconymi TIL, dodając 20-30 ml D-PBS(-).</li>
	<li>Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić frakcję wzbogaconą w TIL w 10 ml pożywki z limfocytów T.</li>
	<li>Wyhodować frakcję (z kroku 1.8) z 2 ml pożywki z limfocytów T i 6 000 j.m./ml rekombinowanej ludzkiej (rh) IL-2 na 6-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zmień połowę pożywki w 5 dniu po rozpoczęciu hodowli, a następnie co 2-3 dni.</li>
	<li>Podziel komórki w stosunku 1:2 bez trypsynizacji po delikatnym zawieszeniu, podwajając liczbę dołków po osiągnięciu 80-90% zbieżności. Dodać połowę objętości (1 ml) świeżej pożywki z limfocytów T i rhIL-2 w stężeniu 6 000 j.m./ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytki komórkowej SNL traktowanej mitomycyną C
<ol>
	<li>Hodować komórki karmiące SNL w 10 ml pożywki z komórek zasilających SNL (tabela 1) na 0,1% pokrytej żelatyną naczyniu o średnicy 10 cm, aż do osiągnięcia 80-90% konfluencji (3-4 x 106 komórek).</li>
	<li>Dodać 310 μl 0,4 mg/ml roztworu mitomycyny C bezpośrednio do naczynia do hodowli komórek SNL i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny i 15 minut. Odessać pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 5 ml D-PBS(-).</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w celu dysocjacji komórek. Dodać 4,5 ml pożywki z ogniwami zasilającymi SNL, aby zneutralizować i ponownie zawiesić komórki w pojedynczej zawiesinie.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i policzyć komórki za pomocą hemocytometru po ponownym zawieszeniu w 10 ml pożywki komórkowej SNL.</li>
	<li>Płytkę 1,5 x 106 komórek na studzienkę komórek zasilających SNL na 10 cm szalce i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Użyj ogniw podajnika SNL w ciągu 3 dni.</li>
</ol>
3. Generowanie iPSC za pomocą wektora wirusa Sendai (SeV)
<ol>
	<li>Zebrać TIL (z kroku 1.11) i aktywować 5 x 105 komórek TIL za pomocą związanego z płytką mysiego anty-ludzkiego CD3 (1 μg/ml) i rozpuszczalnego mysiego anty-ludzkiego CD28 (5 μg/ml), z rhIL-2 (6,000 IU/ml) w 2 ml pożywki z komórek T na 6-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 dni.</li>
	<li>Zebrać TIL (z kroku 3.1) do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Reaktywuj 1 x 105 komórek TIL za pomocą związanego z płytką mysiego anty-ludzkiego CD3 (1 μg/ml) i rozpuszczalnego mysiego anty-ludzkiego CD28 (5 μg/ml), z rhIL-2 (60 IU/ml) w 500 μl pożywki do przeprogramowania (Tabela 1) na studzienkę w 24-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny. Przygotuj 3 studzienki na infekcję SeV: OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC (1 dołek); Zakażenie SeV (GFP: białko zielonej fluorescencji) (1 dołek); i liczba komórek (1 dołek).</li>
	<li>Po 24 godzinach (od kroku 3.3) policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i określ objętość każdego wirusa dla różnych (3-20) wielokrotności infekcji (MOI). Wyjąć jeden zestaw probówek z wektorami wirusa Sendai z magazynu w temperaturze -80 °C. Szybko rozmrozić wektory SeV w łaźni wodnej (37 °C) i umieścić je na lodzie. 
	Objętość wirusa (μl) = MOI (CIU/komórka) x liczba komórek/miano wirusa (CIU/ml) × 10-3 (μl/ml)</li>
	<li>Dodaj obliczone objętości każdej z czterech probówek wektorów wirusa Sendai, które indywidualnie przenosiły OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC, dodając mieszaninę wektorów SeV o stężeniu 10-20 MOI do pożywki, w tym aktywowane TIL.</li>
	<li>Aby określić wydajność transdukcji, dodaj obliczone objętości SeV-GFP do studzienki aktywowanych TIL.</li>
	<li>Umieścić naczynie (z kroku 3.5 i kroku 3.6) w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 24 godziny. Po 24 godzinach oszacuj skuteczność infekcji za pomocą TIL zakażonych SeV-GFP pod mikroskopią fluorescencyjną.</li>
	<li>Zebrać komórki (z kroku 3.5) do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 0,5 ml pożywki hESC z pożywką dla komórek ES naczelnych i zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng/ml).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do 10-centymetrowego naczynia zawierającego komórki SNL poddane działaniu mitomycyny C w 10 ml pożywki hESC. Zmieniaj pożywkę hESC co drugi dzień, aż kolonie będą rosły.</li>
	<li>Około 18 do 21 dnia usuń komórki zasilające SNL wokół kolonii pod mikroskopem za pomocą końcówki 10 μl w czystej ławce.</li>
	<li>Zeskrobać kolonie za pomocą końcówki o pojemności 10 μl i przenieść je za pomocą końcówki o pojemności 200 μl do 100 μl pożywki iPSC na dołek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Pigazuj w górę i w dół 2-3 razy, aby rozbić kolonie na małe kępy o średniej wielkości 50-100 μm.</li>
	<li>Przenieś małe grudki na 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej z komórkami SNL traktowanymi mitomycyną C (z etapu 2) w 2 ml na studzienkę pożywki iPSC z podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng / ml). Zmieniaj nośniki iPSC każdego dnia.</li>
	<li>Przenieś iPSC na 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej ze świeżymi komórkami SNL traktowanymi mitomycyną C z 1 mg / ml kolagenazy dożylnej co 5-6 dni. Przygotuj 2 dołki na płytki każdego klonu do barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Określ pełne przeprogramowanie każdego klonu przez immunohistochemiczne barwienie markerów pluripotencji (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 i OCT3/4)1, 
	UWAGA: W celu dalszej oceny potencjału pluripotencji należy potwierdzić, że w pełni przeprogramowane linie iPSC mogą różnicować się w trzy listki zarodkowe za pomocą testu tworzenia i różnicowania ciał zarodkowych lub testu tworzenia potworniaków16.</li>
	<li>Potwierdź, że w pełni przeprogramowane linie iPSC wykazują prawidłowy kariotyp za pomocą analizy cytogenetycznej.</li>
	<li>W celu utworzenia potworniaka należy wstrzyknąć niezróżnicowaną zawiesinę iPSC pochodzącą z TIL (1 x 106) w 100 μl DMEM zawierającego 10% FCS do tkanki podskórnej 6-8 tygodniowych samic myszy NOD / SCID. Wybarwienie skrawków potworniaka hematoksyliną i eozyną.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne iPSC dla SSEA3, SSEA4, TRA1-60 i TRA1-81
<ol>
	<li>Przemyć iPSC 1 ml PBS i utrwalić iPSC 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu przez 10 minut. Usunąć 4% roztwór paraformaldehydu i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas stosowania paraformaldehydu, ponieważ jest on toksyczny.</li>
	<li>Wstępnie potraktuj iPSC buforem blokującym (tabela 1) przez 30 minut. W międzyczasie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała (szczurzy anty-ludzki SSEA3, mysi anty-ludzki SSEA4, mysi anty-ludzki TRA1-60 i mysi anty-ludzki TRA1-81) 1:50 w 1,5% roztworze surowicy koziej rozcieńczonym PBS i TritonX-100 (całkowita objętość: 1 ml).</li>
	<li>Usuń bufor blokujący (tabela 1). Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (anty-mysie IgG i IgM lub anty-szczurze IgM) w stosunku 1:50 w 1,5% roztworze surowicy koziej.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczony roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. Obserwuj iPSC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.</li>
</ol>
5. Barwienie immunofluorescencyjne iPSC dla Oct3/4
<ol>
	<li>Przemyć iPSC 1 ml PBS i utrwalić iPSC 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu przez 10 minut. Usunąć 4% roztwór paraformaldehydu i przemyć iPSC PBS 3 razy.</li>
	<li>Dodać bufor permeabilizacyjny (Tabela 1) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć bufor permeabilizacji i dodać bufor blokujący (Tabela 1).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W międzyczasie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało (mysie przeciwciało anty-ludzkie Oct3/4) w stosunku 1:50 w buforze blokującym.</li>
	<li>Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. W międzyczasie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-mysie IgG/IgM) w stosunku 1:100 w buforze blokującym.</li>
	<li>Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu przez 45 minut.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczony roztwór wtórny i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. Obserwuj iPSC pod mikroskopią immunofluorescencyjną.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj zademonstrowaliśmy protokół przeprogramowania TIL czerniaka do iPSC poprzez transdukcję czterech czynników transkrypcyjnych OCT3 / 4 za pośrednictwem SeV. Podejście to, wykorzystujące system SeV do przeprogramowania limfocytów T, ma przewagę nad metodą niecałkującą7.
Poprzednie badanie wykazało, że system przeprogramowania SeV był wysoce wydajny i niezawodny w przeprogramowywaniu nie tylko fibroblastów, ale także limfocytów T krwi obwodowej7,17. Ponadto niedawno wyk...

Technologia przeprogramowania komórkowego, która pozwala na generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez nadekspresję określonego zestawu czynników transkrypcyjnych, jest bardzo obiecująca w dziedzinie terapii komórkowych1,2. Te iPSC wykazują cechy transkrypcyjne i epigenetyczne oraz mają zdolność do samoodnawiania się i pluripotencji, podobnie jak embrionalne komórki macierzyste (ESC)3-5. Niezwykły postęp dokonany w technologii przeprogramowania w ciągu ostatniej dekady pozwolił nam na generowanie ludzkich iPSC nawet z terminalnie zróżnicowanych komórek, takich jak limfocyty T6-8. IPSC pochodzące z limfocytów T (TiPSC) zachowują tę samą przegrupowaną konfigurację genów łańcuchowych receptora komórek T (TCR), co oryginalne limfocyty T, co umożliwia regenerację limfocytów T specyficznych dla antygenu z TiPSC9-11.
Prawie 80% limfocytów naciekających czerniaka (TIL) uzyskanych z guza pacjenta rozpoznaje antygeny związane z nowotworem i utrzymuje cytotoksyczność w stosunku do oryginalnych komórek rakowych12. W szczególności stwierdzono, że ekspresja białka programowanej śmierci komórki-1 (PD-1) na TIL identyfikuje autologiczny repertuar reaktywny na nowotwór, w tym zmutowane limfocyty CD8 + specyficzne dla neoantygenu13. Adoptywny transfer ekspandowanych autologicznych TIL ex vivo w połączeniu z preparatywnymi schematami limfodepletingu i ogólnoustrojowym podawaniem interleukiny-2 (IL-2) może powodować znaczną regresję czerniaka z przerzutami w podgrupach pacjentów14. Pomimo zachęcających wyników w modelach przedklinicznych i u pacjentów, słaba przeżywalność limfocytów T podawanych we wstrzyknięciu i istnienie szlaków immunosupresyjnych wydaje się zagrażać pełnemu potencjałowi adoptywnej terapii limfocytami T. Obecne protokoły kliniczne wymagają rozległej manipulacji ex vivo autologicznymi limfocytami T w celu uzyskania dużej liczby. Powoduje to wytwarzanie terminalnie zróżnicowanych limfocytów T, które mają słabą przeżywalność, zmniejszoną zdolność proliferacyjną i wysoki poziom PD-115.
To ograniczenie adoptywnej terapii limfocytami T można teoretycznie przezwyciężyć za pomocą iPSC, które mogą zapewnić nieograniczone źródło autologicznych limfocytów T do immunoterapii. Niedawno informowaliśmy o przeprogramowaniu TIL czerniaka wyrażających wysokie poziomy PD-1 przez transdukcję czterech czynników transkrypcyjnych, w której pośredniczy wirus Sendai (SeV) i OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC16. Podczas gdy wektory retrowirusowe wymagają integracji z chromosomami gospodarza w celu ekspresji genów przeprogramowujących, wektory SeV są nieintegrujące się i ostatecznie są eliminowane z cytoplazmy. Wydajność przeprogramowania jest znacznie wyższa w przypadku systemu SeV w porównaniu z wektorami lentiwirusowymi lub retrowirusowymi6-8. Co więcej, SeV może specyficznie przeprogramowywać limfocyty T w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), podczas gdy niektóre klony iPSC generowane przez wektory lentiwirusowe lub retrowirusowe mogą pochodzić z linii nielimfoidalnych6-8. W tym miejscu szczegółowo opisano procedury stosowane w celu izolacji i aktywacji ludzkich czerniaków TIL oraz generowania iPSC pochodzących z TIL za pomocą systemu przeprogramowania SeV.

<table><tbody><tr><td>delikatne rurki MACS C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>delikatny dysocjator MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji guza, człowiek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Technologie życiowe</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy do komórek Falcon 70 um</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Stożkowe probówki do trifużu</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Technologie życiowe</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>ludzkiej surowicy AB</td><td>Technologie życia</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200mM)</td><td>Technologie życia</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (1000x, 55mM)</td><td>Technologie życia</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Technologie życiowe</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Technologie życia</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Cumberland Farmaceutyki Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Falcon (6-dołkowe)</td><td>Płytki</td><td></td> do hodowli tkankowych Corning 353046 <td></td></tr><tr><td>Falcon (24-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Wektor wirusa Sendai</td> Komórki zasilające <td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycyna C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>rozpuszczalna w wodzie (0,5 mg / ml)</td></tr><tr><td>żelatyna</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>Technologie życia</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptywny transfer ex vivo rozszerzonych autologicznych limfocytów naciekających nowotwór (TILs) może pośredniczyć w trwałych i pełnych odpowiedziach w znacznych podgrupach pacjentów z przerzutowym czerniakiem. Głównymi przeszkodami w tym podejściu są zmniejszona żywotność przenoszonych limfocytów T, spowodowana skróceniem telomerów, oraz ograniczona liczba TIL uzyskanych od pacjentów. Mniej zróżnicowane limfocyty T z długimi telomerami byłyby idealnym podzbiorem limfocytów T do adoptywnej terapii komórkami T; jednak generowanie dużej liczby tych mniej zróżnicowanych limfocytów T jest problematyczne. To ograniczenie adoptywnej terapii limfocytami T można teoretycznie przezwyciężyć za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które samoodnawiają się, utrzymują pluripotencję, mają wydłużone telomery i stanowią nieograniczone źródło autologicznych limfocytów T do immunoterapii. W tym miejscu przedstawiamy protokół do generowania iPSC przy użyciu wektorów wirusa Sendai do transdukcji czynników przeprogramowujących do TIL. Protokół ten generuje w pełni przeprogramowane, wolne od wektorów klony. Te iPSC pochodzące z TIL mogą być w stanie generować mniej zróżnicowane limfocyty T specyficzne dla pacjenta i nowotworu do adoptywnej terapii limfocytami T.

Rysunek 1 przedstawia schemat procedury, która obejmuje wstępną ekspansję TIL-ów z czerniaka z użyciem rhIL-2, a następnie aktywację przeciwciałami anty-CD3/CD28 oraz transfer genów OCT3/4, KLF4, SOX2 i c-MYC do TIL-ów w celu generowania iPSC. Zazwyczaj TIL-e w hodowli z rhIL-2 zaczynają tworzyć sfery od 21 do 28 dni po rozpoczęciu hodowli. W tym momencie TIL-e są gotowe do aktywacji anty-CD3/CD28. Rysunek 2A przedstawia TIL-e w hodowli z rhIL-2 w 21. dni...

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z limfocytów naciekających czerniaka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii nowotworów, szczególnie w zakresie immunoterapii raka. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwość generowania ludzkich komórek iPS z limfocytów naciekających guz może zapewnić nieograniczoną liczbę słabiej zróżnicowanych, specyficznych dla nowotworu limfocytów T do celów immunoterapii.Technika ta może znaleźć zastosowanie w leczeniu przerzutowego czerniaka, ponieważ obecnie niska przeżywalność limfocytów T w warunkach klinicznych stanowi głównym ograniczeniem adaptacyjnej terapii limfocytami T. Metoda ta może być również przydatna w badaniu repertuaru receptorów limfocytów T w mikrośrodowisku guza. Procedurę zaprezentuje dr Kumiko Iwabuchi, stażysta podoktorski z mojego laboratorium.Po pobraniu materiału nowotworowego należy wybrać od 5 do 20 g próbek guza i za pomocą nożyczek oddzielić prawidłową, zwartą i twardą tkankę od kruchych i/lub krwawych obszarów martwiczych próbek nowotworu. Rozdrobnione próbki należy posiekać tak drobno,

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film demonstruje test do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych CD8αβ+ pochodzących z indukowanych komórek macierzystych (iPSC) specyficznych dla antygenu nowotworowego. Specyficzne dla antygenu nowotworowego iPSC są hodowane na monowarstwie komórek zrębu i różnicowane w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC). HPC są różnicowane w podwójnie dodatnie limfocyty T CD4 + CD8 + przy użyciu pożywki różnicowej. Komórki te są następnie stymulowane do generowania...

Generowanie pojedynczych dodatnich limfocytów T CD8 z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Ta praca opisuje protokół różnicowania in vitro do produkcji pigmentowanych, dojrzałych melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą grzebienia nerwowego i etapu pośredniego melanoblastu przy użyciu 25-dniowego protokołu bez karmienia.

Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Poznaj metodę wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka. Ta technika umożliwia nieograniczoną produkcję komórek T specyficznych dla guza w immunoterapii nowotworowej.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Przeglądaj więcej filmów