Name: Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę multipleksowego testu immunologicznego opartego na przeciwciałach ślinowych do jednoczesnego pomiaru narażenia na patogeny środowiskowe. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną analizę w naukach o narażeniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Clarissa Curioso otrzymała wsparcie poprzez nominację do Programu Uczestnictwa w Badaniach w Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska administrowanej przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy międzyagencyjnej umowy między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Amerykańską Agencją Ochrony Środowiska.

Uzyskano zgodę od Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) na pobieranie stymulowanych próbek śliny szczelinowej od plażowiczów na plaży Boquerón, Puerto Rico, w ramach Krajowego Badania Epidemiologicznego i Środowiskowego Rekreacyjnego (NEEAR) Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (USEPA)23 w celu oceny narażenia i chorób związanych z pływaniem. Uczestnicy badania wyrazili świadomą zgodę i zostali poinstruowani w zakresie korzystania z urządzenia do pobierania śliny przez przeszkolonych wykonawców USEPA. Próbki śliny zostały wysłane na lodzie, a po otrzymaniu zostały odwirowane i przechowywane w temperaturze -80 °C, jak opisano4.
1. Aktywacja koralików
<ol>
	<li>Zawiesić wywar z zestawu kulek przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund i przenieść około 5,0 x10 6 kulek (400 μl) do probówek mikrowirówek. 
	Uwaga: Koraliki są dostarczane w stężeniu 12,5 x 106 kulek/ml.</li>
	<li>Granulki bulionowe osadzać przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowane kulki w 100 μl wody destylowanej (dH2O) za pomocą wiru i sonikacji przez 20 sekund. Powtórzyć krok 1.2.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić przemyte kulki w 80 μl 100 mM jednozasadowego fosforanu sodu o pH 6,2 przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór N-hydroksysulfosuccinimidu (Sulfo-NHS) o stężeniu 50 mg/ml, dodając 200 μl dH2O do 10 mg podwielokrotności Sulfo-NHS. Wymieszaj wirem.</li>
	<li>Dodać 10 μl 50 mg/ml Sulfo-NHS do kulek. Wymieszaj wirem.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem sporządzić 50 mg/ml roztworu chlorowodorku 1-etylo-[3dimetyloaminopropylo]karmodimidu (EDC), dodając 200 μl wody destylowanej (dH2O) do podwielokrotności 10 mg EDC. Wymieszaj wirem.</li>
	<li>Dodać 10 μl 50 mg/ml roztworu EDC do kulek. Wymieszaj wirem. Inkubować kulki przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności, z mieszaniem wirowym w odstępach 10-minutowych. Aktywowane kulki osadzać przez mikrowirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 250 μl 50 mM kwasu 2-[N-Morfolino]etanosulfonowego (MES), pH 5,0 przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund.</li>
	<li>Aktywowane kulki osadzać przez mikrowirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.9 i 1.10. 
	Uwaga: Zapewnia to w sumie dwa prania z 50 mM MES, pH 5,0.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki w 100 μl 50 mM MES, pH 5,0 za pomocą wiru i sonikacji przez 20 sekund.</li>
</ol>
2. Sprzężenie koralików
<ol>
	<li>Sprzęgnąć antygeny z zestawami kulek, stosując stężenia pokazane w tabeli 1.</li>
	<li>Dodaj każdy antygen do aktywowanych kulek i doprowadź całkowitą objętość do 500 μl w 50 mM MES, pH 5,0. Wymieszaj antygeny i kulki za pomocą wiru.</li>
	<li>Inkubować antygeny i kulki przez 2 godziny z mieszaniem przez rotację (~15 obr./min) w temperaturze pokojowej w ciemności. Sprzężone kulki osadzać przez mikrowirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 500 μl buforowanej solą fizjologiczną (PBS) z buforem fosforanowym (PBS) - albuminą surowicy bydlęcej (BSA) - monolaurynianem polioksyetylenosorbitanu (Tween-20) - azydkiem sodu (PBS-TBN) o pH 7,4 za pomocą wiru i sonikacji. Granulki osadzać przez mikrowirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant. 
	Uwaga: Azydek sodu jest bardzo toksyczną substancją chemiczną. Jest śmiertelny w przypadku połknięcia lub kontaktu ze skórą. Nie wdychać pyłu/dymu/gazu/mgły/oparów ani rozpylonej cieczy. Podczas obchodzenia się z odpowiednimi środkami ochrony osobistej należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i utylizować je zgodnie z odpowiednimi przepisami.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 1 ml PBS-TBN za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.</li>
	<li>Granulki granulować przez mikrowirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.5 i 2.6. 
	Uwaga: Zapewnia to w sumie dwa prania z PBS-TBN.</li>
	<li>Ponownie zawiesić sprzężone i umyte kulki w 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% Azide, pH 7,4. Przechowuj sprzężone koraliki w lodówce o temperaturze 2-8 °C w ciemności.</li>
</ol>
3. Liczba koralików
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenie sprzężonych kulek w stosunku 1:10 w wodzie lub buforze PBS.</li>
	<li>Załadować 10 μl rozcieńczenia kulki na hemocytometr w miejscu wprowadzenia próbki.</li>
	<li>Policz koraliki widoczne w jednej z siatek narożnych 4 x 4. Obliczyć całkowitą liczbę sprzężonych kulek, korzystając z następującego wzoru: Liczba (1 róg siatki 4 x 4) x (1 x 104) x (współczynnik rozcieńczenia) x objętość rekompozycji w ml.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie sprzężenia antygenów
<ol>
	<li>Zawiesić podstawową mieszaninę kulek sprzężonych z antygenami będącymi przedmiotem zainteresowania za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.</li>
	<li>Przygotować roboczą mieszaninę kulek, rozcieńczając sprzężone półkulki do końcowego stężenia 100 kulek / μl każdego unikalnego zestawu kulek w buforze PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4).</li>
	<li>Przygotować co najmniej 7 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń przeciwciała pierwszorzędowego antygatunku IgG zgodnie z zaleceniami producenta w 96-dołkowej okrągłej płytce dennej z buforem PBS-1% BSA.</li>
	<li>Wstępnie zwilżyć oddzielną 8-dołkową kolumnę (8 rzędów) 96-dołkowej dolnej płytki filtra dla każdego testu potwierdzającego sprzężenie antygenu 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Dodać 50 μl mieszaniny kulek roboczych (kulki sprzężone z antygenem) do wstępnie zwilżonych studzienek.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczeń przeciwciał do rzędów 1-7 każdej kolumny 96-dołkowej płytki filtracyjnej i 50 μl buforu PBS-1% BSA do rzędu 8 zamiast rozcieńczonego przeciwciała, które ma służyć jako studzienki tła. Wymieszać z pipetorem wielokanałowym, pipetując 5 razy w górę i w dół. Wykonaj tę samą procedurę dla każdego zestawu koralików sprzężonych z antygenem, który ma zostać potwierdzony.</li>
	<li>Przykryć i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 500 obr./min. Usunąć supernatant za pomocą próżni.</li>
	<li>Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz 1x. Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało wtórne do wykrywania przeciwciał IgG swoistych dla danego gatunku do 16 μg/ml w PBS-1% BSA.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki, pipetując w górę i w dół 5 razy.</li>
	<li>Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć reporter streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE) do 24 μg/ml w PBS-1% BSA.</li>
	<li>Dodać 50 μl reportera do każdego dołka i mieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy.</li>
	<li>Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 100 μl PBS-1% BSA i przeanalizować 50 μl za pomocą analizatora29. 
	Uwaga: Wyniki multipleksowego testu immunologicznego opartego na kulkach są mierzone w medianie intensywności fluorescencji (MFI). Zawsze odwołuj się do najnowszej wersji instrukcji oprogramowania, jeśli jest dostępna, aby uniknąć błędów.</li>
</ol>
5. Test immunologiczny Multiplex w ślinie
<ol>
	<li>Usuń ślinę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zapasy kulek sprzężonych z antygenem za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.</li>
	<li>Przygotować roboczą mieszaninę kulek, rozcieńczając sprzężone granulki do końcowego stężenia 100 kulek/μl każdego unikalnego zestawu kulek w buforze PBS-1% BSA.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie śliny w stosunku 1:4 z buforem PBS-1% BSA w 96-dołkowej płytce z głębokim dołkiem.</li>
	<li>Wstępnie zwilżyć płytę filtracyjną ze 100 μl buforu płuczącego i usunąć supernatant za pomocą podciśnienia.</li>
	<li>Dodać 50 μl roboczej mieszaniny kulek i równą objętość rozcieńczonej śliny do 95 dołków z 96-dołkowymi płytkami filtracyjnymi w celu ostatecznego rozcieńczenia 1:8. Wymieszać reakcje za pomocą pipetora wielokanałowego. Do jednej studzienki kontrolnej dodaj 50 μl kulek sprzężonych z antygenem oraz 50 μl buforu BSA PBS-1% (jako zamiennik śliny).</li>
	<li>Przykryć i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 500 obr./min. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć biotynylowane kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG o wtórnym wykrywaniu do 16 μg/ml w PBS-1% BSA.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki i wymieszać zawartość za pomocą pipetora wielokanałowego.</li>
	<li>Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć reporter streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE) do 24 μg/ml w PBS-1% BSA.</li>
	<li>Dodać 50 μl reportera do każdego dołka i wymieszać z pipettorem wielokanałowym.</li>
	<li>Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 100 μl PBS-1% BSA i przeanalizować 50 μl za pomocą analizatora29. 
	Uwaga: Wyniki multipleksowego testu immunologicznego są mierzone w jednostkach mediany intensywności fluorescencji (MFI). Zawsze odwołuj się do najnowszej wersji instrukcji oprogramowania, jeśli jest dostępna, aby uniknąć błędów.</li>
</ol>

<ol><li>Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPr%C3%BCss-%C3%9Cst%C3%BCn%2C+A+%22Safer+water%2C+better+health%3A+costs%2C+benefits+and+sustainability+of+interventions+to+protect+and+promote+health%22">Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health</a>. , World Health Organization. Geneva. (2008).</li>
<li>Augustine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+approaches+to+developing+a+multiplex+immunoassay+for+determining+human+exposure+to+environmental+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens.</a> J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).</li>
<li>Griffin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+salivary+antibody+immunoassays+for+the+detection+of+incident+infections+with+Norwalk+virus+in+a+group+of+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers.</a> J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).</li>
<li>Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+for+the+quantitation+of+salivary+antibody+responses+to+selected+waterborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens.</a> J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).</li>
<li>Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Current diagnostic uses of saliva.</a> J Dent Res. 66, 420-424 (1987).</li>
<li>Mandel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">The diagnostic uses of saliva.</a> J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).</li>
<li>Malamud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+as+a+Diagnostic+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+J%22%5BJournal%5D)">Saliva as a Diagnostic Fluid.</a> Brit Med J. 305, 207-208 (1992).</li>
<li>Ballam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+is+useful+in+the+salivary+diagnosis+of+Helicobacter+pylori+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection.</a> J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).</li>
<li>Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva+as+a+source+of+anti-malarial+antibodies+to+examine+population+exposure+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 10, 104(2011).</li>
<li>Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+invasive+amebiasis+by+enzyme-linked+immunosorbent+assay+of+saliva+to+detect+amebic+lectin+antigen+and+anti-lectin+immunoglobulin+G+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies.</a> J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Toyoguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reactivity+to+Cryptosporidium+parvum+in+saliva+of+calves+after+experimental+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection.</a> J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).</li>
<li>Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+and+booster+salivary+antibody+responses+to+a+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+infants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants.</a> J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).</li>
<li>Tourinho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+cutoff+ratio+for+detecting+antibodies+against+hepatitis+A+virus+in+oral+fluids+by+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay.</a> J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).</li>
<li>Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+saliva+as+an+alternative+to+plasma+for+the+detection+of+hepatitis+C+virus+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies.</a> Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).</li>
<li>Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+norwalk+virus+infection+by+indirect+enzyme+immunoassay+detection+of+salivary+antibodies+to+recombinant+norwalk+virus+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).</li>
<li>Yap, G., Sil, B., Ng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saliva+for+early+dengue+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of saliva for early dengue diagnosis.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).</li>
<li>Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+saliva-based+test+for+detecting+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).</li>
<li>Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+saliva+for+antibodies+to+the+LPS+of+Escherichia+coli+O157+in+patients+with+serum+antibodies+to+E.+coli+O157+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS.</a> J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).</li>
<li>Ashbolt, N., Bruno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+refinement+of+the+WHO+risk+framework+for+recreational+waters+in+Sydney%2C+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia.</a> J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).</li>
<li>Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QMRA+%28quantitative+microbial+risk+assessment%29+and+HACCP+%28hazard+analysis+and+critical+control+points%29+for+management+of+pathogens+in+wastewater+and+sewage+sludge+treatment+and+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse.</a> Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).</li>
<li>Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+drinking+water+and+disease+outcomes+in+developing+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions.</a> Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).</li>
<li>Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+model+to+assess+microbial+health+risks+associated+with+beneficial+uses+of+biosolids%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids.</a> Risk Anal. 24, 221-236 (2004).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWade%2C+TJ+%22Report+on+2009+National+Epidemiologic+and+Environmental+Assessment+of+Recreational+Water+Epidemiology+Studies%2C+US+EPA.+US+EPA+Report+Number%3A+EPA%2F600%2FR-10%2F168%3A+US+EPA2011%22">Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011</a>. , (2011).</li>
<li>Fujii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+surveillance+development+for+tropical+infectious+diseases+using+simultaneous+microsphere-based+multiplex+assays+and+finite+mixture+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).</li>
<li>Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+serological+survey+in+the+Italian+population%3A+interpretation+of+results+using+mixture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model.</a> Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).</li>
<li>Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+serological+surveys+using+mixture+models%3A+the+seroepidemiology+of+measles%2C+mumps+and+rubella+in+England+and+Wales+at+the+beginning+of+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century.</a> Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).</li>
<li>Baughman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+diagnostic+cutoff+points+for+levels+of+serum+antibodies+to+pertussis+toxin%2C+filamentous+hemagglutinin%2C+and+fimbriae+in+adolescents+and+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).</li>
<li>Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead-based+immunoassay+for+simultaneous+detection+of+Shiga+toxins+and+isolation+of+Escherichia+coli+O157+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods.</a> J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Luminex+User+Software+Manual+%28RUO%29+xPONENT+3.1+Rev.+2%22">Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2</a>. 3, 6-102 (2014).</li>
<li>Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-specific+binding+in+serological+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays.</a> J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).</li>
</ol>

Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska poprzez swoje Biuro Badań i Rozwoju finansowała i zarządzała opisanymi tutaj badaniami. Został on poddany przeglądowi administracyjnemu Agencji i zatwierdzony do publikacji. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.

Wyniki te wskazują, że metoda multipleksowego testu immunologicznego jest przydatna do rozróżniania próbek śliny, które są immunododatnie lub immunoujemne. Aby określić immunopozytywność, opracowano pojedynczy punkt odcięcia, obliczając średnią plus trzy odchylenia standardowe przekształconych logarytmicznie odpowiedzi MFI kontrolnych niesprzężonych kulek testowanych na wszystkich próbkach śliny. Punkt odcięcia umożliwił ocenę narażenia i immunoprewalencji na jeden lub wiele patogenów. Ta zdolność dyskryminacyjna może by...

Osiemdziesiąt osiem procent chorób związanych z biegunką na całym świecie jest związanych z narażeniem ludzi na skażoną wodę, niebezpieczną żywność i złe warunki sanitarne/higieniczne, powodując około 1,5 miliona zgonów, z których większośćto dzieci1. Jest to główny powód do niepokoju dla urzędników zdrowia publicznego i decydentów. Starając się zbadać narażenie i choroby związane z patogenami przenoszonymi przez wodę i inne patogeny środowiskowe, opracowaliśmy multipleksowy test immunologiczny do pomiaru przeciwciał w próbkachludzkich 2-4. Metoda ta może być stosowana w badaniach epidemiologicznych w celu określenia narażenia ludzi na te patogeny oraz lepszego zdefiniowania immunoprewalencji i incydentów zakażeń.
Ślina jest bardzo obiecująca jako alternatywa dla surowicy do badań nad ludzkimi biomarkerami. Wśród zalet stosowania śliny jest nieinwazyjność i łatwość pobierania próbek, niski koszt, a próbki można łatwo pobrać od dzieciw wieku 5-7 lat. Próbki surowicy i śliny zostały dokładnie przebadane na obecność przeciwciał przeciwko H. pylori2,3,8, Plasmodium falciparum9, Entamoeba histolytica10, Cryptosporidium parvum3,11, Streptococcus pneumonia12, wirusom zapalenia wątroby A i C13-14, norowirusom2-4,15, T. gondii2-4, wirusowi dengi16, ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV)17 oraz Escherichia coli O157:H718.
Multipleksowy test immunologiczny pozwala na analizę wielu analitów jednocześnie w obrębie jednej objętości próbki i w ramach jednego cyklu lub przebiegu. Multipleksowane antygeny C. jejuni, T. gondii, H. pylori, wirusa zapalenia wątroby typu A i dwóch norowirusów wykorzystano do pomiaru odpowiedzi ludzkich przeciwciał IgG2-4 i IgA3,4 i IgA2,3 oraz osocza na te patogeny za pomocą testu immunologicznego multipleksowego opartego na koralikach. W połączeniu z badaniami epidemiologicznymi dotyczącymi narażenia na drobnoustroje w wodzie, glebie i żywności, rodzaj testu opisany w tym badaniu może dostarczyć cennych informacji w celu lepszego zrozumienia zakażeń wywołanych przez patogeny środowiskowe. Co więcej, dane dotyczące przeciwciał w ślinie uzyskane z takich badań mogą być wykorzystane do ulepszenia modeli oceny ryzyka19-22.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt i oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwirówka</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>75002446</td><td>Służy do wirowania próbek</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>Służy do mieszania próbek</td></tr><tr><td>Sonicator (mini)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-337-22</td><td>Służy do oddzielania kulek</td></tr><tr><td>Pipetory P10, P20, P100, P1000, 8 kanałów. </td><td>Capp</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometry (jasna linia)</td><td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>Służy do liczenia sprzężonych koralików</td></tr><tr><td>Wielositowy rozdzielacz próżniowy</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Stosowany na etapach mycia w celu usunięcia supernatantu</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>Służy do mieszania kulek podczas inkubacji</td></tr><tr><td>Stojak na probówki (1,5 ml i 0,5 ml) (różne)</td><td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Mettler lub inna</td><td></td><td>Służy do pomiaru odczynników płuczących do wytwarzania</td></tr><tr><td>Mieszalnik próbek Dynabead</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>Używany podczas etapu inkubacji sprzęgającej</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Służy do analizy danych odpowiedzi przeciwciał</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>Służy do analizy danych odpowiedzi przeciwciał</td></tr><tr><td>Luminex Analyzer z oprogramowaniem xPonent 3.1</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>Przyrząd i oprogramowanie używane do przeprowadzania testu</td></tr><tr><td>Antigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GI.1 Wirus Norwalk: cząstka</td><td>p Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>* Szpital Dziecięcy w Cincinnati. Stężenie końcowe 5 &mikro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 Norowirus VA387: cząstka p</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA*</td><td>Szpital Dziecięcy w Cincinnati. Stężenie końcowe 5 &mikro;g.</td></tr><tr><td>Wirus zapalenia wątroby typu A: koncentrat II stopnia z hodowli komórkowej</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>Antygen sprzężony w 100 &mikro; g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori: lizat</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>Antygen sprzężony przy 25 &mikro; g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii: rekombinowany antygen p30 (SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td><td>sprzężony przy 25 &mikro; g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni: zabijane termicznie całe komórki</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>Antygen sprzężony przy 50 &mikro; g</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwotne</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anty-Norowirus świnki morskiej</td> <td>(CCHMC)*</td><td>NA</td><td>Używany do potwierdzania sprzężenia</td></tr><tr><td>Mysz przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Używany do potwierdzania sprzężenia</td></tr><tr><td>Mysz przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Używany do potwierdzania sprzężenia</td></tr><tr><td>BacTraceAffinity Oczyszczone przeciwciało przeciwko Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>Służy do potwierdzania sprzężenia</td></tr><tr><td>Kozia pAb do Toxoplasma gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>Służy do potwierdzania sprzężenia</td></tr><tr><td>BacTrace Goat anty-Campylobacter</td><td>gatunek KPL</td><td>01-92-93</td><td>Służy do potwierdzania</td></tr> <tr><td>sprzężenia<silny>Drugorzędny&nbsp; Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-SP-sprzężona AffiniPure Donkey anty-kozia IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>Służy do potwierdzania sprzężenia</td></tr><tr><td>Biotynylowany królik anty-kozi IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>Służy do potwierdzania sprzężenia</td></tr><tr><td>Biotynylowany kozioł anty-mysi IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>Służy do potwierdzania</td></tr> <tr><td>sprzężeniaPowinowactwo Oczyszczone przeciwciało Biotyna Znakowane kozie anty-królicze IgG (H + L)</td> <td>KPL</td><td>176-1506</td><td>Służy do potwierdzania sprzężenia</td></tr> <tr><td>< mocne>Materiały eksploatacyjne< / mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki wirówkowe z kopolimeru</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>Używane jako probówki do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania</td></tr><tr><td>10 i mikro; l wkłady do końcówek do pipet</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; l wkłady do końcówek do pipet</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro; l Wkłady do końcówek do pipet</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Używane utrzymują koraliki w ciemności podczas inkubacji</td></tr><tr><td>Płytki Deep Well</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>Służy do rozcieńczania próbek śliny</td></tr><tr><td>Wielositowe płytki filtracyjne</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>Służy do przeprowadzania testów</td></tr><tr><td>System zbierania śliny Oracol</td><td>Malvern Medical Developments Limited</td><td></td><td>Służy do pobierania śliny</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karboksylowane mikrosfery (kulki)</td><td>Luminex Corporation</td><td>W zależności od zestawu kulek</td><td>Antygeny są sprzężone z mikrosferami</td></tr><tr><td>EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu)</td><td>Pierce</td><td>77149 lub 22980</td><td>Stosowany w aktywacji</td></tr> <tr><td>kulekSulfo-NHS (N-hydroksysulfosuccinimid)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>Stosowany w aktywacji kulek</td></tr><tr><td>Steptawidyna-R-fikoerytryna (1 mg / ml)</td><td>Sondy molekularne</td><td>S-866</td><td>Stosowany jako reporter</td></tr><tr><td>MES (kwas 2-[N-Morfolino]etanosulfonowy)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td>Używany do sprzężenia</td></tr><tr><td>Tween-20 (monolaurynian polioksyetylenosorbitanu)</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>Stosowany w buforze płuczącym do usuwania niespecyficznych wiążących</td></tr> <tr><td>< silnych>białkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-TBN Bufor blokujący/magazynujący (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azide, pH 7,4)**</td><td></td><td></td> <td>Filtruj Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7888</td><td>0,1% (w/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>0,2% (v/v)</td></tr><tr><td>Azydek sodu (0,05% azydek)**</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td>**Uwaga: Azydek sodu jest bardzo toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Utylizować zgodnie z obowiązującymi przepisami.</td></tr><tr><td>MES/Bufor sprzęgający (0,05 M MES, pH 5,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES (kwas 2-[N-Morfolino]etanosulfonowy)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor testowy (PBS, 1% BSA, pH 7,4)&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Filter Sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>PBS, 1% BSA, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3688</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA</td></tr><<tr><td>silny>bufor aktywacji (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)</td><td></td><td></td><td>Filter Sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 & C</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (Fosforan sodu, jednozasadowy bezwodny)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td>0,1 M NaH2PO4</td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>Filter Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 &deg; C</td></tr><tr><td>PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3563</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN</td></tr></tbody></table>

opracowanie testu immunologicznego multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Etiologia i wpływ narażenia ludzi na patogeny środowiskowe są głównym problemem na całym świecie, dlatego nieodzowna byłaby możliwość oceny narażenia i infekcji przy użyciu efektywnych kosztowo, wysokoprzepustowych podejść. Niniejszy manuskrypt opisuje opracowanie i analizę multipleksowego testu immunologicznego opartego na kulkach, zdolnego do pomiaru obecności przeciwciał w ludzkiej ślinie przeciwko wielu patogenom jednocześnie. Ślina jest szczególnie atrakcyjna w tym zastosowaniu, ponieważ jest nieinwazyjna, tańsza i łatwiejsza do zebrania niż surowica. Antygeny patogenów środowiskowych sprzężono z karboksylowanymi mikrosferami (kulkami) i wykorzystano do pomiaru przeciwciał w bardzo małych objętościach próbek ludzkiej śliny za pomocą testu fazy roztworu na bazie kulek. Koraliki połączono z antygenami Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norowirusami (G I.1 i G II.4) i wirusem zapalenia wątroby typu A. Aby upewnić się, że antygeny są wystarczająco sprzężone z kulkami, potwierdzono sprzężenie za pomocą specyficznych dla gatunku, pierwotnych przeciwciał wychwytujących pochodzenia zwierzęcego, a następnie przeprowadzono inkubację z biotynylowanymi przeciwciałami wtórnego wykrywania przeciwciał antygatunkowych i reporterem streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE). Jako kontrola do pomiaru niespecyficznego wiązania, jeden zestaw koralików był traktowany identycznie jak inne, z wyjątkiem tego, że nie był sprzężony z żadnym antygenem. Kulki sprzężone z antygenem i kontrolne inkubowano następnie z prospektywnie pobranymi próbkami ludzkiej śliny, mierzonymi na analizatorze o wysokiej przepustowości w oparciu o zasady cytometrii przepływowej, a obecność przeciwciał przeciwko każdemu antygenowi mierzono w jednostkach mediany intensywności fluorescencji (MFI). Ten multipleksowy test immunologiczny ma wiele zalet, w tym więcej danych przy mniejszej próbce; obniżone koszty i robocizna; oraz możliwość dostosowania testu do wielu interesujących nas celów. Wyniki wskazują, że multipleksowy test immunologiczny śliny może być zdolny do identyfikacji wcześniejszych ekspozycji i infekcji, co może być szczególnie przydatne w badaniach nadzorczych z udziałem dużych populacji ludzkich.

Jeden unikalny zestaw kuleczek wykorzystano jako kontrolę w celu pomiaru nieswoistego wiązania oraz zmienności między próbkami. Kuleczki te traktowano identycznie jak kuleczki sprzężone z antygenem, z wyjątkiem tego, że w etapie sprzęgania nie inkubowano ich z żadnym antygenem. Wartości MFI &gt;500 uzyskane z kuleczek kontrolnych inkubowanych ze wszystkimi próbkami śliny zostały usunięte z dalszych analiz ze względu na podejrzenie kontaminacji surowicą, a pozostałe odpowiedzi rozkładano l...

W obecnym klimacie ograniczonych zasobów, pojawiają się nowe technologie, które pozwalają badaczom prowadzić badania taniej, szybciej i z większą precyzją. W tym miejscu opisujemy rozwój multipleksowego testu immunologicznego na bazie przeciwciał ślinowych na bazie kulek do pomiaru narażenia ludzi na wiele patogenów środowiskowych jednocześnie.

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Ogólnym celem tego wielomiernikowego testu immunoenzymatycznego opartego na koralikach do oznaczania przeciwciał w ślinie jest identyfikacja czynników etiologicznych odpowiedzialnych za objawowe i bezobjawowe choroby związane ze środowiskiem poprzez jednoczesny pomiar odpowiedzi przeciwciał IgG na wiele patogenów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nauki o ekspozycji, na przykład: które patogeny są odpowiedzialne za wywoływanie chorób w konkretnych populacjach.Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego i kosztowo efektywnego oznaczania przeciwciał przeciwko wielu analizowanym czynnikom jednocześnie, przy użyciu bardzo małych objętości próbek. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat czynników etiologicznych oraz dróg ekspozycji, w tym dróg pokarmowych, wodnych i powietrznych. Oficjalna demonstracja tej procedury jest kluczowa, ponieważ niewłaściwe jej przeprowadzenie może prowadzić do uzyskania niewiarygodnych wyników.Zacznij od wymieszania na wirówce oraz sonikacji roztworów stokowych kulek sprzężonych z interesującymi antygenami przez 20 sekund każdorazowo, aby uzyskać jednorodne zawiesiny kulek. Następnie rozcieńcz zapasy sprzężonych kulek w PBS uzupełnionym o 1% BSA do końcowego stężenia 100 kulek na mikrolitr dla każdego unikalnego zestawu kulek. W dalszej kolejności, zgodnie z zaleceniami producenta, przygotuj co najmniej siedem dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych przeciwciała pierwszorzędowego anty-IgG przeciwko gatunkowi I w PBS z BSA w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem.Nawilż wstępnie oddzielną kolumnę 12 dołków w 96-dołkowej płytce filtracyjnej dla każdego testu potwierdzenia sprzęgania antygenu, stosując 100 µL buforu płuczącego, a następnie usuń nadsącz za pomocą próżni. Następnie dodaj 50 µL kulek sprzęganych z antygenem do nawilżonych dołków oraz 50 µL seryjnie rozcieńczonego przeciwciała do rzędów od pierwszego do siódmego 96-dołkowej płytki filtracyjnej; do rzędu ósmego dodaj 50 µL PBS z BSA jako kontrolę tła dla rozcieńczonego przeciwciała. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdego z dołków, pipetując w górę i w dół pięć razy.Następnie przykryć płytkę i inkubować przeciwciała z kuleczkami sprzężonymi z antygenem w ciemności, w temperaturze pokojowej, na wytrząsarce do mikro płytek przy 500 rpm. Po jednej godzinie odprowadzić nadsącz i przemyć dołki dwiema alikwotami buforu do mycia po 100 µL każda. Po drugim myciu zastąpić bufor 50 µL PBS z dodatkiem BSA.Następnie rozcieńcz biotynilowane przeciwciało wtórne anty-gatunkowe IGG do stężenia 16 µg/mL w PBS z BSA i dodaj 50 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego do każdego rzędu. Inkubuj kuleczki i przeciwciała w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut na wytrząsarce do płytek. Po zakończeniu inkubacji odessij supernatant i przemyj kuleczki dwiema alikwotami po 100 µL buforu do mycia.Po drugim płukaniu ponownie zawiesić kuleczki w 50 µL PBS z dodatkiem BSA i rozcieńczyć reporter streptawidyna r-fikorytryna do stężenia 24 µg/mL w PBS z dodatkiem BSA. Dodać 50 µL reportera do każdej studni i wymieszać za pomocą pipetowania. Inkubować płytkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, a następnie przeprowadzić dwa płukania 100 µL buforu do płukania, zgodnie z instrukcją.Następnie ponownie zawiesić kuleczki w 100 µL PBS z BSA i ocenić kuleczki z przyłączonym antygenem na analizatorze. Po ponownym zawieszeniu zapasów kuleczek z przyłączonym antygenem poprzez wstrząsanie w wibratorze laboratoryjnym i sonikację przez 20 sekund, rozcieńczyć zapasy przyłączonych kuleczek do końcowego stężenia 100 kuleczek na µL dla każdego unikalnego zestawu kuleczek w PBS z BSA. Następnie przygotować rozcieńczenie od 1 do 4 śliny w temperaturze pokojowej w PBS z BSA w 96-dołkowej płytce głębokiej.Nawilż płytkę filtrującą, dodając 100 µL buforu płuczącego, a następnie odessaj nadsącz. Następnie do 95 studni 96-dołkowej płytki filtrującej, przeznaczonej dla rozcieńczeń końcowych od 1:1 do 1:8, dodaj 50 µL kulek sprzęgniętych z antygenem oraz taką samą objętość rozcieńczonej śliny. Jednocześnie do studni kontrolnej dodaj 50 µL kulek sprzęgniętych z antygenem oraz 50 µL samego PBS z BSA.Inkubować kuleczki w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę na wstrząsarce do mikropłytek przy 500 rpm. Następnie odessać nadsącz i dwukrotnie przemyć studzienki 100 µl buforu do mycia. Po drugim myciu ponownie zawiesić kuleczki w 50 µl PBS z dodatkiem BSA.Rozcieńczyć przeciwciało wtórne i dodać po 50 µL do każdej studzienki. Po wymieszaniu zawartości studzienek za pomocą pipety wielokanałowej inkubować płytkę na wytrząsarce w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przemyć studzienki 100 µL buforu do mycia i resuspender kuleczki w 50 µL świeżego PBS z dodatkiem BSA. Następnie rozcieńczyć reporter i dodać po 50 µL do każdej studzienki.Wymieszaj dokładnie za pomocą pipety wielokanałowej. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej na wytrząsarce w ciemności przemyj studzienki dwukrotnie, zgodnie z demonstracją, a następnie ponownie zawieś kuleczki w 100 µl PBS z dodatkiem BSA i oceń próbki na analizatorze. Aby upewnić się, że kuleczki z przyłączonym antygenem są w stanie osiągnąć zakres dynamiczny analizy, prawidłowe przyłączenie definiuje się jako średnią intensywność fluorescencji większą lub równą 18 000.Jak pokazano na tych reprezentatywnych potwierdzeniach sprzęgania antygenów w teście na C.jejuni i T.gondii. Na podstawie ustalonego punktu odcięcia, wskaźniki immunoprewalencji dla próbek wahały się od około 2% dla T.gondii do prawie 50% dla Norowirusa z grupy genetycznej 1.1, co wskazuje, że wskaźnik immunoprewalencji był najwyższy dla norowirusów, a następnie dla wirusa zapalenia wątroby A i H.Pylori. Podczas gdy 32% próbek było immunonegatywnych dla wszystkich patogenów w teście, 68% było immunopozytywnych dla jednego lub więcej patogenów.Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać wykonana w około cztery godziny, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia wszystkich kroków. Podczas realizacji procedury ważne jest przechowywanie kulek w ciemności, aby uniknąć fotowybielania. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy ELISA i Western blotting, w celu uzyskania dodatkowych odpowiedzi na pytania dotyczące czułości i swoistości.Jak również reaktywność krzyżową przeciwciał. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom z zakresu epidemiologii, nauki o ekspozycji i mikrobiologii klinicznej do badania ryzyka dla ludzi wynikającego z ekspozycji środowiskowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak opracować, analizować i interpretować wyniki wieloanalitowego testu immunoologicznego (multiplex immunoassay), umożliwiającego jednoczesny pomiar przeciwciał przeciwko wielu patogenom.Należy pamiętać, że praca z płynami ustrojowymi i azotkiem sodu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej oraz właściwa utylizacja odczynników.

developing-salivary-antibody-multiplex-immunoassay-to-measure-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Ten film demonstruje technikę multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie wykrywa przeciwciała przeciwko wielu patogenom środowiskowym w ludzkiej ślinie. Kulki fluorescencyjne sprzężono z antygenami różnych patogenów, które wychwycono za pomocą przeciwciał w próbce ludzkiej śliny. Po znakowaniu przeciwciał za pomocą reportera fluorescencyjnego, kulki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny obecności w ślinie różnych przeciwciał...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do identyfikacji przeciwciał specyficznych dla patogenu w ślinie

Opisujemy procedurę profilowania białek śliny za pomocą multipleksowanych układów przeciwciał opartych na mikrosferach. Przeciwciała monoklonalne zostały kowalencyjnie połączone z mikrosferami polimerowymi o wielkości 4,5 μm kodowanymi barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii karmodiimidu. Zmodyfikowane mikrosfery zdeponowano w mikrostudzienkach światłowodowych w celu zmierzenia poziomu białka w ślinie za pomocą fluorescencyjnych testów immunologicznych typu sandwich.

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.

Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą mikroprzepływowego systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu oraz ocenę jego przydatności w diagnostyce alergii.

Zastosowanie technologii mikroprzepływowej Biochip do wykrywania immunoglobuliny E (sIgE) swoistej dla alergenu w surowicy

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Ten artykuł opisuje wygodną metodę monitorowania dynamicznych zmian w mianach przeciwciał dla dwóch izotypów immunoglobulin jednocześnie (IgA, IgM lub IgG) wynikających z odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Ten "Multianalitowy panel odpowiedzi immunologicznej Covid-19" wykorzystuje trzy pośrednie testy immunologiczne zbudowane na kodowanych mikrosferach, które są odczytywane za pomocą przepływowego czytnika multipleksowego z funkcją "dwukanałową".

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Multipleksowe fluorescencyjne testy immunologiczne stają się źródłem informacji do badań serologicznych. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na złożoność i czasochłonne procesy sprzężenia kulki z analizą koralików. Raport ten przedstawia półautomatyczny, powtarzalny protokół multipleksowego mikrokulkowego sprzężenia kulek, który jest porównywalny ze standardową metodą, a jednocześnie znacznie skraca czas oczekiwania na uzyskanie rezultatów.

Multipleksowy test serologiczny do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy

Poznaj metodę multipleksowego testu immunologicznego opartego na przeciwciałach ślinowych do jednoczesnego pomiaru narażenia na patogeny środowiskowe. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną analizę w naukach o narażeniu.

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

Przeglądaj więcej filmów