Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

Ogólnym celem tej pracy jest zademonstrowanie krytycznych etapów potrzebnych do syntezy materiałów kopolimerowych blokowych metodą anionowej polimeryzacji z otwarciem pierścienia oraz pokazanie niezbędnego przebiegu badań nad formulacją miceli kopolimeru blokowego leku hydrofobowego. Protokół ten demonstruje prawidłowe wykonanie niezbędnych kroków i procedur do syntezy kopolimeru blokowego metodą polimeryzacji anionowej. Dużą zaletą polimeryzacji anionowej z otwieraniem pierścienia jest synteza materiałów o dobrej wydajności i niskiej dyspersji zanieczyszczeń.

A także skalowalność procesu. To ekscytujący czas dla dostarczania leków polimerowych. Z wieloma lekami opartymi na preparatach i blokowych micelach kopolimerowych, które są obecnie w późnej fazie rozwoju przedklinicznego lub klinicznego.

Przygotować odczynniki i materiały do transferu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zważyć glikol metoksypolietylenowy o masie cząsteczkowej 5 000. Dodać mPEG do wysuszonej kolby zawierającej mieszadło i uszczelnić adapter do spłukiwania przegrodą u góry.

Podłączyć kolbę do kolektora i zalać kolbę argonem na dwie do trzech minut. Przekręć zawór do pozycji podciśnienia, aby ustawić kolbę. Obrócić kolbę ręcznie i równomiernie wysuszyć naczynie reakcyjne za pomocą suszarki lub opalarki, aż mPEG się rozpuści.

Po jednej minucie przerwij podciśnienie, przekręcając zawór na kolektorze w kierunku pozycji argonu za pomocą kilku szybkich trzasków, aby schłodzić kolbę. Utrzymuj makroinicjator polimerowy w próżni przez około dwie godziny, a następnie w argonie przed rozpoczęciem reakcji. Następnie pod maską zamontuj dwa aparaty do destylacji wysokopróżniowej, które zostały wcześniej wysuszone w piecu.

Jedno urządzenie służy do destylacji DMSO, a jedno urządzenie służy do destylacji monomeru, eteru fenylogliceryjskiego. Podłączyć oddzielne kolby do dwóch aparatów i zainstalować każdą z nich na półkulistym kominku grzewczym lub w kąpieli olejowej. Podłącz zimną wodę do górnej części każdego urządzenia i do kolektora.

Upewnij się, że każde urządzenie jest bezpieczne i dobrze uszczelnione. Włącz podciśnienie za pomocą zaworu. Ustaw ogrzewanie za pomocą regulatora temperatury i zacznij mieszać roztwory.

Po dwóch godzinach cyrkulacyjnej destylacji DMSO zamknij zawór wysokiego podciśnienia, aby zebrać około 20 mililitrów roztworu. Następnie uwolnij frakcję do kolby i powtórz operację jeszcze raz, aby zapewnić czystość pożądanej frakcji, która jest później zbierana. Podgrzej kolbę zawierającą mPEG w próżni za pomocą opalarki, aż polimer się rozpuści, a następnie ponownie przysiądź z argonem.

Po dwóch godzinach zamknij zawór wysokiego podciśnienia i zbierz objętość rozpuszczalnika. Przestań ogrzewać i odłącz podciśnienie od kolektora. Uwolnij argon do komory, jak opisano wcześniej.

Pod dodatnim ciśnieniem argonu połączyć jedną stronę kaniuli z cylindrem miarowym lub bezpośrednio z kolbą zawierającą mPEG, również pod wpływem argonu, a drugi koniec ostrożnie zanurzyć we świeżo destylowanej frakcji. Podłącz dodatkowy bełkot do kolby, zamknij przepływ argonu i używaj tylko ciśnienia argonu z aparatu destylacyjnego. Aby uniknąć wypadków spowodowanych ciśnieniem argonu, otwórz szklany kran na jedną do dwóch sekund i zamknij ponownie, aby kontynuować przepływ DMSO, aż do zakończenia pełnego transferu.

Następnie, pod wpływem argonu, połącz jedną stronę kaniuli z wysuszonego cylindra miarowego, uszczelnionego przegrodą, z roztworem podstawowym 0,3 molowego naftalenu potasu. Następnie dodaj dodatkowy bełkot do cylindra z podziałką, zamknij przepływ argonu do cylindra i pod dodatnim ciśnieniem argonu przenieś pięć mililitrów 0,3 molowego naftalenu potasu przez kańulację z roztworu podstawowego do cylindra z podziałką. Włóż kolejną igłę z kolektora do cylindra i wyjmij dodatkową bełkotkę.

Wyjąć kaniulę połączoną z roztworem podstawowym, ostrożnie, szybko włożyć ją do kolby reakcyjnej i podłączyć dodatkowy bełkot. Następnie, jak opisano wcześniej, dodawaj bazę kropla po kropli, aż roztwór stanie się ciemny. Po powolnym zaniku koloru dodaj kolejną porcję, aż ciemny kolor pojawi się ponownie, i powtarzaj aż do pełnego transferu.

Jak opisano wcześniej, przenieś żądaną objętość monomeru do reakcji, aby osiągnąć stopień polimeryzacji eteru glikolu polifenolowego wynoszący około 18 do 20 jednostek. Pozostaw reakcję na 48 godzin w temperaturze 80 stopni Celsjusza, w atmosferze argonu z ciągłym mieszaniem, aby zapewnić całkowitą polimeryzację. Ugasić reakcję przez dodanie kropli jednego normalnego kwasu solnego i metanolu, jak obserwuje się przez zanik koloru.

Ekstrahować naftalen z roztworu DMSO za pomocą heksanu. Usuń około 70 mililitrów DMSO przez destylację w próżni. Ostudzić roztwór gnojowicy i dodać 15 mililitrów THF.

Usunąć sól z roztworu zawiesiny przez odwirowanie z prędkością 5 000 g przez dziesięć minut. Przenieś supernatant i dodaj kroplami do 500 mililitrów zimnego eteru dietylowego. Zebrać osad przez filtrację lub odwirowanie.

Po dwukrotnym powtórzeniu wytrącania wysuszyć osad w temperaturze pokojowej pod maską, przez noc, a następnie pod próżnią w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin, uzyskując wydajność 85%Kopolimer jest teraz gotowy do charakteryzacji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozpuść 12 miligramów doksorubicyny w jednym mililitrze acetonitrylu. Dodaj 10 mikrolitrów trietyloaminy i pozwól roztworowi mieszać w ciemności przez dwie godziny.

Rozpuść 45 miligramów kopolimeru w jednym mililitrze THF i mieszaj przez ten sam czas. Dodać roztwór kopolimeru do roztworu doksorubicyny i przepłukać kopolimer zawierający resztki kopolimeru dodatkową objętością THF. Następnie dodaj mieszaninę kopolimeru i leku kroplami do 20-mililitrowego oleju zawierającego 15 mililitrów 0,9% soli fizjologicznej, mieszając.

Przenieś roztwór do worka dializacyjnego i dializ z 500 mililitrami 0,9% soli fizjologicznej. Przenieść dialilat do 15-mililitrowej probówki i odwirować przy 5 000 razy g przez 15 minut. Następnie przenieść supernatant do systemu ultrafiltracji, który zawiera membranę do dializy.

Włóż mieszadło do systemu ultrafiltracji, zamknij pokrywę i otwórz na strumień azotu. Stęż roztwór miceli kopolimeru blokowego do objętości czterech mililitrów i dodaj sześć mililitrów świeżej soli fizjologicznej. Następnie ponownie zagęścić roztwór miceli kopolimeru blokowego do 4 mililitrów, przepłukać komorę 0,5 mililitra soli fizjologicznej i dodać do roztworu.

Powstały roztwór należy przechowywać w brązowych podłogach w temperaturze pokojowej w ciemności, przed dalszym użyciem. Anionowa polimeryzacja eteru fenyloglicerolu z otwarciem pierścienia na makroinicjatorze mPEG została wykorzystana do przygotowania amfifilowego kopolimeru diblokowego przez głębokie protonowanie grupy hydroksylowej mPEG. Zastosowanie naftalenu potasu jako anionu rodnikowego, a następnie polimeryzacja monomeru eteru fenyloglicerolu.

Charakterystyka kopolimeru blokowego za pomocą chromatografii żelowej i analizy spektroskopii protonowej NMR potwierdziła wąski rozkład masy cząsteczkowej ze stopniem polimeryzacji eteru fenyloglicerolu wynoszącym 15 jednostek. W dorobku prawnym amfifilowe kopolimery blokowe łączą się, tworząc micele, które składają się z hydrofobowego rdzenia otoczonego hydrofilową powłoką. Transmisyjna mikroskopia elektronowa potwierdziła morfologię sferyczną, a dynamiczne rozpraszanie światła wykazało średnicę hydrodynamiczną 25 nanometrów.

Doksorubicynę udało się zatorbować w micelach kopolimeru blokowego. W porównaniu z wolnym protonowanym lekiem w roztworze, samowygaszanie doksorubicyny, obserwowane za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej, potwierdziło włączenie leku do miceli polimerowych, o zdolności ładowania leku do 14%Profil uwalniania doksorubicyny z miceli kopolimeru blokowego wskazywał na dobrą stabilność tego preparatu przy neutralnym pH. I przedłużone uwalnianie leku przez cztery dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Po opanowaniu technika ta może pomóc stażystom w naukach farmaceutycznych w przygotowaniu syntetycznych kopolimerów diblokowych do zastosowania w dostarczaniu leków. Opisana tu procedura może być stosowana do syntezy szerokiej gamy kopolimerów, których inicjatorem jest PEG. Położono tu nacisk na zapewnienie dobrych praktyk laboratoryjnych, które zapewniają warunki bezwodne i skutkują wysoką jakością materiałów.

Po obejrzeniu tego filmu powinienem dobrze zrozumieć, jak pracować w warunkach bezwodnych i powinienem być w stanie zastosować te kroki do syntezy poliestru PEG lub materiałów poliestrowych PEG. Podejmując się któregokolwiek z opisanych badań, należy pamiętać, że pracujesz w kontrolowanych warunkach, z potencjalnie niebezpiecznymi rozpuszczalnikami organicznymi i innymi czynnikami. Ponadto wszystkie leki są toksyczne i należy się z nimi obchodzić z zachowaniem niezbędnych środków ostrożności.

Na przykład noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego, butów z zakrytymi palcami, a także noszenie maski, gdy chcesz zważyć leki.