Name: Praca z komórkami słuchowymi HEI-OC1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj procedury pracy z komórkami słuchowymi HEI-OC1 myszy, wykorzystywanymi do badania efektów farmakologicznych i funkcji białka prestin. Ta metoda umożliwia standaryzację badań nad wewnętrznym uchem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH Grants R01-DC010146 i R01-DC010397. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne stanowisko National Institutes of Health.

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).</li>
<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li>
<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak istniejącego lub potencjalnego konfliktu interesów.

W niniejszym raporcie opisano, w jaki sposób hodować komórki HEI-OC1 i wykorzystywać je do oceny mechanizmów cytotoksyczności indukowanej lekami oraz do badania właściwości funkcjonalnych prestyny, molekularnego silnika OHC ślimaka. Procedury techniczne są jednak na tyle ogólne, że można je łatwo dostosować do różnych badań.
Wszystkie opisane tutaj protokoły wymagają prawidłowego stosowania dobrze znanych technik hodowli komórkowych 10. Podobnie jak w przypadku każdej innej linii ko...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) komórki pochodzą z narządu słuchowego transgenicznej myszy 1,2. Inkubacja dowolnej komórki tej transgenicznej myszy w temperaturze 33 °C/10% CO2 (warunki permisywne) indukuje ekspresję genu unieśmiertelniającego, który wyzwala dedyferencjację i przyspieszoną proliferację; przemieszczenie komórek do 39 °C/5% CO2 (warunki niedopuszczające) prowadzi do zmniejszenia proliferacji, różnicowania i, przynajmniej w przypadku HEI-OC1, śmierci komórki 2,3.
Komórki HEI-OC1 zostały sklonowane i scharakteryzowane w naszym laboratorium ponad dekadę temu, a wstępne badania wykazały, że wyrażają one specyficzne markery komórek rzęsatych ślimaka, takie jak prestyna, miozyna 7a, Atoh1, BDNF, kalbindyna i kalmodulina, ale także markery komórek wspomagających, takie jak koneksyna 26 i receptor czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-R) 2. W związku z tym zasugerowano, że HEI-OC1 może reprezentować wspólny prekursor komórek czuciowych i podtrzymujących narząd Cortiego 2. Równoległe badania dostarczyły mocnych dowodów na to, że archetypowe leki ototoksyczne, takie jak cisplatyna, gentamycyna i streptomycyna, indukowały aktywację kaspazy-3 w tych komórkach, podczas gdy leki uważane za nieototoksyczne, takie jak penicylina, nie indukowały 2,3. W związku z tym ta linia komórkowa została zaproponowana jako system in vitro do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych związanych z ototoksycznością oraz do badań przesiewowych potencjalnej ototoksyczności lub właściwości otoprotekcyjnych nowych leków farmakologicznych. Szacuje się, że komórki HEI-OC1 zostały wykorzystane w ponad stu pięćdziesięciu badaniach opublikowanych w ciągu ostatnich dziesięciu lat.
Podczas gdy przyjrzenie się potencjalnemu efektowi proapoptotycznemu różnych leków było głównym celem większości badań z udziałem tej linii komórkowej, inne ważne procesy komórkowe, takie jak autofagia i starzenie się, dopiero zaczęły być badane w komórkach HEI-OC14-7. W niedawnym badaniu z naszego laboratorium 8 wykorzystaliśmy komórki HEI-OC1 do zebrania kompleksowego zestawu danych na temat śmierci komórki, przeżycia, proliferacji, starzenia się i autofagii indukowanej przez różne leki farmakologiczne często stosowane w klinice. Porównaliśmy również niektóre odpowiedzi komórek HEI-OC1 z odpowiedziami z HEK-293 (ludzkie embrionalne komórki nerkowe) i HeLa (ludzkie komórki nabłonkowe) otrzymujące identyczne leczenie. Nasze wyniki wskazały, że komórki HEI-OC1 reagują na każdy lek w charakterystyczny sposób, z charakterystyczną zależną od dawki i czasu wrażliwością na co najmniej jeden z badanych mechanizmów. W badaniu tym podkreśliliśmy również, że prawidłowa interpretacja wyników eksperymentu będzie wymagała przeprowadzenia równoległych badań z użyciem więcej niż jednej techniki 8.
W innym badaniu badaliśmy użycie komórek HEI-OC1 do oceny funkcjonalnej odpowiedzi prestyny, białka motorycznego zewnętrznych komórek rzęsatych ślimaka (OHC) 9. Przedstawiono badania cytometrii przepływowej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej dotyczące wzorca ekspresji prestyny, a także badania pojemności nieliniowej (NLC) i zaciskania całych komórek w komórkach HEI-OC1 hodowanych w warunkach permisywnych (P-HEI-OC1) i niepermisywnych (NP-HEI-OC1). Nasze wyniki wskazały, że zarówno całkowita ekspresja prestyny, jak i lokalizacja błony plazmatycznej zwiększają się w sposób zależny od czasu w komórkach NP-HEI-OC1. Co ciekawe, odkryliśmy również, że wzrost lokalizacji prestyny na błonie komórkowej komórek NP-HEI-OC1 korelował ze spadkiem Na+K+ATPazy, która translokowała się z błony plazmatycznej do cytoplazmy bez istotnych zmian w całkowitej ekspresji komórki. Ponadto wykazaliśmy, że komórki P-HEI-OC1 mają silne NLC związane z funkcją motoryczną prestyny, która zmniejszała się wraz ze wzrostem gęstości cząsteczek prestyny obecnych na błonie plazmatycznej. Podsumowując, wyniki te silnie potwierdzają przydatność komórek HEI-OC1 do badania białek słuchowych.
W tym artykule wideo opisujemy, jak hodować komórki HEI-OC1, dlaczego wygodnie jest używać komórek rosnących w warunkach dopuszczalnych (P-HEI-OC1) do badań cytotoksyczności, jak ocenić mechanizm/mechanizmy cytotoksyczności wywołanej lekiem i jak przeprowadzić badania elektrofizjologiczne (np. patch-clamp, pojemność nieliniowa (NLC)) w celu zbadania funkcjonalnych właściwości prestyny, molekularnego silnika OHC ślimaka.

<table><tbody><tr>Komórki <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>WSZYSTKIE ZESTAWY TESTOWE, URZĄDZENIA&nbsp;</td></tr><tr><td>Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>I FIRMY WSKAZANE W</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>POPRZEDNIE 2 KOLUMNY TO TYLKO</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>PRZYKŁADY I KAŻDY INNY PODOBNY</td></tr><tr>PRODUKT<td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>MOŻE BYĆ UŻYWANY.</td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Dwa (2) inkubatory komórkowe, jeden pod kątem 33 & stopni; C/10% CO2 i inne przy 39 stopniach; C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych, PS, 100 mm x 20 mm z otworami wentylacyjnymi</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych , PS,&nbsp; 60 mm x 15 mm z otworami wentylacyjnymi&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkanek Cellstar&nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar kultura tkankowa&nbsp; kolby 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Płytka do hodowli komórkowych 6 dołków, z pokrywką - Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Płytka do hodowli tkankowej, 96 dołków, płaskie dno z pokrywką</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-dołkowa biała, przezroczyste dno</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowa probówka stożkowa z nakrętką Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe polipropylenowe z nakrętką-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania proliferacji komórek MTT TACS</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Astestping&nbsp; zestaw</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania proliferacji komórek BrdU&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania zielonej cytotoksyczności Cell-Tox</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instrument FACSAriaIII&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne</td><td>&nbsp; FACSAriaIII</td><td>Ze wzbudzeniem 488 nm (niebieski laser)</td></tr><tr><td>Cyfrowy skaner blot</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka do elektroforezy i bibuły</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Czytnik płytek z oprogramowaniem Soft Max Pro 5.2</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz krosowy</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do przygotowania elektrody krosowe</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

praca z komórkami słuchowymi hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 to jedna z niewielu linii komórek słuchowych myszy dostępnych do celów badawczych. Pierwotnie zaproponowany jako system in vitro do badań przesiewowych leków ototoksycznych, komórki te zostały wykorzystane do badania aktywowanych przez leki szlaków apoptotycznych, autofagii, starzenia, mechanizmu ochrony komórek, reakcji zapalnych, różnicowania komórek, genetycznych i epigenetycznych skutków leków farmakologicznych, skutków niedotlenienia, stresu oksydacyjnego i endoplazmatycznego retikulum oraz ekspresji kanałów molekularnych i receptorów. Wśród kilku innych ważnych markerów komórek rzęsatych ślimaka, komórki HEI-OC1 endogennie eksprymują prestynę, paradygmatyczne białko motoryczne zewnętrznych komórek rzęsatych. W związku z tym mogą być bardzo przydatne do wyjaśnienia nowych aspektów funkcjonalnych tego ważnego białka słuchowego. Komórki HEI-OC1 są bardzo wytrzymałe, a ich hodowla zwykle nie powoduje dużych powikłań. Wymagają jednak pewnych specjalnych warunków, takich jak unikanie stosowania popularnych koktajli przeciwbakteryjnych zawierających streptomycynę lub inne antybiotyki, a także inkubacja w temperaturze 33 °C w celu stymulacji proliferacji komórek i inkubacja w temperaturze 39 °C w celu wywołania różnicowania komórek. W tym miejscu opisujemy, jak hodować komórki HEI-OC1 i jak je wykorzystywać w niektórych typowych testach, takich jak proliferacja komórek, żywotność, śmierć, autofagia i starzenie się, a także jak wykonywać pomiary pojemności patch-clamp i nieliniowe.

W kilku niedawnych publikacjach przedstawiliśmy kompleksowy zestaw badań mających na celu ocenę odpowiedzi komórek HEI-OC1 na kilka powszechnie stosowanych leków farmakologicznych, a także zbadanie funkcji prestyny 8,9. W badaniach tych wykorzystaliśmy wszystkie protokoły opisane w poprzednich sekcjach.
Jednym z wyników tych wcześniejszych badań było to, że komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach niepermisywnych (39 °C/1...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) jest jedną z niewielu linii komórek słuchowych myszy dostępnych obecnie do celów badawczych. Protokół ten opisuje, jak pracować z komórkami HEI-OC1 w celu zbadania cytotoksycznego działania leków farmakologicznych, a także właściwości funkcjonalnych białek ucha wewnętrznego.

Praca z komórkami słuchowymi HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych procedur pracy z komórkami HEI-OC1, które mogą być wykorzystywane do badania wpływu leków farmakologicznych na komórki słuchowe oraz wspierania charakterystyki funkcjonalnej białka motorycznego prestyny. Komórki HEI-OC1 są używane przez wielu badaczy na całym świecie w różnych eksperymentach o zróżnicowanych celach, z wykorzystaniem odmiennych technik. Mamy nadzieję, że opisane tutaj procedury zapewnią wspólną bazę, która pozwoli na porównywalność tych badań.Oczywiście, opisane procedury eksperymentalne mogą zostać dodatkowo udoskonalone. Jednak różnice względem metod przedstawionych w niniejszym opracowaniu mogą mieć kluczowe znaczenie dla zrozumienia i wyjaśnienia potencjalnie sprzecznych wyników. W niniejszej demonstracji opiszemy sposób pracy z komórkami HEI-OC1, począwszy od rozmrożenia mrożonej aliquoty, aż do przygotowania próbek gotowych do przeprowadzenia różnych badań z wykorzystaniem powszechnie dostępnych technik.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyjąć fiolkę z kriokonserwowanymi komórkami HEI-OC1 z ciekłego azotu i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Należy zanurzyć tylko dolną połowę fiolki i pozostawić ją do rozmrożenia, aż w fiolce pozostanie jedynie niewielka ilość lodu. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przetrzeć zewnętrzną powierzchnię fiolki 70% alkoholem.Następnie pobrać komórki z ampułki pipetą i powoli, kropla po kropli, przenieść całą objętość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml uprzednio ogrzanej pożywki wzrostowej, takiej jak DMEM uzupełniony o 10% FBS. Następnie usunąć DMSO poprzez wirowanie probówki przez pięć minut. Po pięciu minutach odlać nadsącz i resuspenderć komórki w dziewięciu ml świeżej pożywki wzrostowej.Rozdziel grudki lub płaty komórek, pipetując zawiesinę komórkową trzy do czterech razy, tak aby końcówka pipety dotykała dna probówki. Następnie przenieś całą objętość komórek zawieszonych w pożywce wzrostowej do niepowlekanej plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 100 mm. Inkubuj komórki w temperaturze 33 °C w atmosferze 10% CO2.Na tym etapie należy usunąć stare pożywkę i przemyć komórki dwiema mililitrami PBS. Następnie monowarstwę komórek należy pokryć 0,25% trypsyny. Komórki należy obserwować pod mikroskopem odwróconym do momentu, aż 40% z nich odklei się od podłoża.W razie potrzeby delikatnie kołysz naczyniem hodowlanym, aby uwolnić pozostałe przytwierdzone komórki. Resuspenduj komórki i usuń trypsynę poprzez wirowanie probówki przez pięć minut. Następnie odlej nadsącz i resuspenduj komórki w dziewięciu mililitrach świeżej pożywki wzrostowej. Następnie rozbij grudki lub płaty komórek, kilkukrotnie (od trzech do czterech razy) przepompowując zawiesinę komórek między pipetą a pożywką, tak aby końcówka pipety dotykała dna probówki.Następnie wysiej komórki w szalki hodowlane o średnicy 100 mm. Inkubuj je w temperaturze 33 °C w atmosferze 10% CO2 i pasażuj tyle razy, ile będzie to konieczne dla planowanych eksperymentów lub w celu wytworzenia nowego zapasu. W celu dyferencjacji inkubuj komórki HEI-OC1 w warunkach dopuszczalnych, aż osiągną około 80% konfluencji.Następnie inkubować komórki w temperaturze 39 °C w atmosferze 5% CO2 przez dwa do trzech tygodni, wymieniając medium co drugi dzień w celu usunięcia martwych komórek. Rozpocząć tę procedurę od policzenia komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i dostosować stężenie komórek do wymaganej wartości. Następnie wysiać komórki do przezroczystej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem, białej płytki 96-dołkowej lub płytki 6-dołkowej.Jeśli wymaga tego konkretny test, inkubować komórki przez noc w celu przyczepienia substratu przed podaniem wybranych leków. Następnie zmierzyć efekt działania leków za pomocą cytometrii przepływowej lub innej odpowiedniej techniki. Aby zebrać komórki, przemyć je dwukrotnie 10 mililitrami PBS pozbawionego wapnia i magnezu.Dodaj dwa mililitry roztworu odspajającego bez enzymów i inkubuj komórki przez trzy minuty w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Użyj mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić stopień odspojenia komórek. W razie potrzeby delikatnie przesuń naczynie hodowlane, aby odspoić więcej komórek, uważając, by go nie potrząsać.Następnie dodaj 10 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS i delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół pięć razy. Po tym czasie obejrzyj komórki pod mikroskopem. Jeśli ponad 80% komórek jest już odseparowanych, dalsze pipetowanie nie jest konieczne.Jeśli komórki nadal tworzą skupiska, należy kontynuować delikatne pipetowanie, aż ponad 80% komórek przestanie występować w skupiskach. Kontrola optyczna komórek powinna wykazać obecność wielu pojedynczych, okrągłych komórek z gładkimi krawędziami błony. Następnie należy przejść do pomiarów metodą patch-clamp oraz NLC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach niepermisywnych wykazały wysoce istotny spadek żywotności oraz równie istotny wzrost śmiertelności w porównaniu do komórek hodowanych w warunkach permisywnych. Ponieważ wpływ leków na komórki obumierające lub o obniżonej żywotności może różnić się od wpływu tych samych leków na komórki zdrowe, w każdym badaniu cytotoksyczności przeprowadzanym na komórkach NP-HEI-OC1 należy poświęcić znaczną uwagę odróżnieniu efektów działania leku od efektów warunków hodowli. W związku z tym zalecamy stosowanie komórek HEI-OC1 hodowanych w warunkach permisywnych w eksperymentach, które nie wymagają specyficznie komórek zróżnicowanych.Przedstawione tutaj obrazy konfokalne potwierdzają ekspresję słuchowego białka motorycznego prestyny w komórkach HEI-OC1 hodowanych w temperaturze 33 °C oraz 39 °C. Należy zauważyć, że prestyna lokalizuje się immunologicznie głównie w cytoplazmie komórek HEI-OC1 rosnących w warunkach dopuszczalnych, natomiast w komórkach bardziej zróżnicowanych jest ona bardziej skoncentrowana w błonie komórkowej. Badania cytometrią przepływową wykazały wyraźny wzrost ekspresji prestyny w obu warunkach, co sugeruje, że translokacji towarzyszyła synteza większej liczby cząsteczek prestyny.Z drugiej strony badania elektrofizjologiczne wykazały silną NLC w komórkach HEI-OC1 hodowanych w temperaturze 33 °C, przy czym wartość szczytowa malała, a napięcie przy pojemności szczytowej przesuwało się w stronę wartości bardziej zdepolaryzowanych w miarę przenoszenia komórek do warunków niepermisywnych przez jeden i dwa tygodnie. Co ciekawe, wyniki te sugerują, że funkcja motoryczna może zostać upośledzona, jeśli gęstość cząsteczek prestyny w błonie plazmatycznej jest zbyt wysoka. Należy pamiętać, że opisane tutaj protokoły wymagają prawidłowego zastosowania uznanych technik hodowli komórkowych.Należy również pamiętać o unikaniu stosowania antybiotyków. Ponadto warto mieć na uwadze, że fenotyp i odpowiedź komórek HEI-OC1 będą w znacznym stopniu zależeć od parametrów hodowli.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Implanty ślimakowe (CI) umożliwiają słyszenie poprzez bezpośrednią stymulację elektryczną nerwu słuchowego. Jednak słaba rozdzielczość częstotliwości i intensywności ogranicza jakość słyszenia w przypadku implantów ślimakowych. W tym miejscu opisujemy optogenetyczną stymulację nerwu słuchowego u myszy jako alternatywną strategię badań słuchowych i rozwoju przyszłych implantów ślimakowych.

Optogenetyczna stymulacja nerwu słuchowego

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Obecne protokoły utrzymania nieśmiertelnych, multipotencjalnych komórek progenitorowych (iMOP) i różnicowania otycznego są otyczne.  Zwrócono uwagę na warunki hodowli i markery molekularne, które wskazują na różnicowanie w nabłonek czuciowy i neurony zwojowe spirali (SGN).

Inicjowanie różnicowania w unieśmiertelnionych multipotencjalnych komórkach progenitorowych uszu

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy protokół dla Mikroskopii Konduktancji Jonów Sondy Skaczącej (HPICM), techniki bezkontaktowej sondy skanującej, która umożliwia nanoskalowe obrazowanie wiązek stereorzęsek w żywych słuchowych komórkach rzęsatych.

Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków

Miniaturowe świnie (mini-świnki) są idealnym dużym modelem zwierzęcym do badań nad implantami ślimakowymi. Operacja wszczepienia implantu ślimakowego u miniaturowych świń może być wykorzystana do dostarczenia wstępnych dowodów na bezpieczeństwo i potencjalną wydajność nowatorskich układów elektrod i metod chirurgicznych w żywym systemie podobnym do ludzkiego.

Miniaturowa świnia: duży model zwierzęcy do badań nad implantami ślimakowymi

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Poznaj procedury pracy z komórkami słuchowymi HEI-OC1 myszy, wykorzystywanymi do badania efektów farmakologicznych i funkcji białka prestin. Ta metoda umożliwia standaryzację badań nad wewnętrznym uchem.

Praca z komórkami słuchowymi HEI-OC1

Przeglądaj więcej filmów