Praca z komórkami słuchowymi HEI-OC1

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie podstawowych procedur pracy z komórkami HEI-OC1, które mogą być wykorzystane do badania wpływu leków farmakologicznych na komórki słuchowe i pomocy w funkcjonalnej charakterystyce białka motorycznego prestyny. Komórki HEI-OC1 są wykorzystywane przez wielu badaczy na całym świecie w różnych eksperymentach o różnych celach i przy użyciu różnych technik. Miejmy nadzieję, że opisane tutaj procedury zapewnią wspólną podstawę, która umożliwi porównanie tych badań.

Oczywiście, te eksperymentalne procedury mogą być jeszcze udoskonalane. Jednak różnice w stosunku do tych opisanych tutaj mogą być kluczem do zrozumienia i wyjaśnienia potencjalnie sprzecznych wyników. W tej demonstracji opiszemy, jak pracować z komórkami HEI-OC1, zaczynając od zamrożonej podwielokrotności do posiadania próbek gotowych do przeprowadzenia różnych badań przy użyciu powszechnie dostępnych technik.

Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij fiolkę z kriokonserwowanymi komórkami HEI-OC1 z ciekłego azotu i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zanurzyć tylko dolną połowę fiolki i pozostawić do rozmrożenia do momentu, aż w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przetrzeć zewnętrzną część fiolki 70% alkoholem.

Następnie odpipetować komórki z fiolki i powoli dostarczać całą objętość kropla po kropli do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej, takiej jak DMEM uzupełnionej 10% FBS. Następnie usuń DMSO, odwirowując probówkę przez pięć minut. Po pięciu minutach wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w dziewięciu mililitrach świeżej pożywki wzrostowej.

Zdezagregować grudki lub arkusze komórek poprzez topnienie i refluksowanie zawieszonych komórek między pipetą a pożywką trzy do czterech razy, przy czym końcówka pipety dotyka dna probówki. Następnie umieść całkowitą objętość komórek zawieszonych w pożywce wzrostowej w nieprzetworzonym plastikowym naczyniu do hodowli komórek o średnicy 100 milimetrów. Inkubuj komórki w temperaturze 33 stopni Celsjusza z 10% CO2.

Na tym etapie usuń starą pożywkę i umyj komórki dwoma mililitrami PBS. Następnie przykryj monowarstwę komórek 0,25% trypsyną. Zbadaj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu, gdy 40% z nich zostało odłączonych.

W razie potrzeby delikatnie kołysz naczyniem hodowlanym, aby uwolnić pozostałe przyczepione komórki Ponownie zawieś komórki i usuń trypsynę, odwirowując probówkę przez pięć minut. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w dziewięciu mililitrach świeżej pożywki wzrostowej. Następnie należy zdezagregować grudki lub arkusze komórek poprzez topnienie i refluksowanie zawieszonych komórek między pipetą a pożywką, trzy do czterech razy, tak aby końcówka pipety dotykała dna probówki.

Przystąp do wysiewu komórek w szalkach do hodowli komórkowych o średnicy 100 milimetrów. Inkubuj je w temperaturze 33 stopni Celsjusza z 10% CO2 i dziel tyle razy, ile jest to konieczne do planowanych eksperymentów lub do wytworzenia nowego stada. W celu różnicowania inkubuj komórki HEI-OC1 w warunkach permisywnych, aż osiągną około 80% konfluencji.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 39 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez dwa do trzech tygodni i zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aby usunąć martwe komórki. Rozpocznij tę procedurę od zliczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do wymaganej wartości. Następnie umieść komórki w 96-dołkowej przezroczystej płaskiej płytce dennej, 96-dołkowej płytce o białych ściankach lub płytce sześciodołkowej.

Jeśli jest to wymagane przez konkretny test, należy inkubować komórki przez noc w celu przyłączenia substratu przed potraktowaniem ich interesującymi lekami. Następnie zmierz wynik leczenia za pomocą cytometrii przepływowej lub innej odpowiedniej techniki. Aby zebrać komórki, umyj je dwukrotnie 10 mililitrami PBS wolnego od wapnia i magnezu.

Dodaj dwa mililitry bezenzymatycznego roztworu detachera i inkubuj komórki przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić oderwanie komórek. W razie potrzeby delikatnie przesuń naczynie do hodowli komórkowych, aby odłączyć więcej komórek, i uważaj, aby nią nie potrząsnąć.

Następnie dodaj 10 mililitrów DMEM plus 10% FBS i delikatnie pipetuj komórki w górę iw dół, pięć razy. Następnie przyjrzyj się komórkom pod mikroskopem. Jeśli więcej niż 80% komórek jest już rozdzielonych, dalsze pipetowanie nie jest potrzebne.

Jeśli komórki nadal znajdują się w skupiskach, kontynuuj delikatne pipetowanie, aż ponad 80% komórek przestanie być w skupiskach. Kontrola optyczna komórek powinna pokazać wiele pojedynczych okrągłych komórek o gładkich krawędziach błony. Następnie przystąp do pomiarów patch-clamp i NLC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach niepermisywnych wykazały bardzo istotny spadek żywotności komórek i równie istotny wzrost śmierci komórki w stosunku do hodowli komórek w warunkach permisywnych. Ponieważ wpływ leku na komórki już umierające lub o zmniejszonej żywotności może być inny niż wpływ tego samego leku na zdrowe komórki, należy dołożyć znacznych starań w celu odróżnienia skutków działania leku od skutków warunków hodowli w każdym badaniu cytotoksyczności przeprowadzonym na komórkach NP-HEI-OC1. Dlatego zalecamy stosowanie komórek HEI-OC1 hodowanych w dopuszczalnych warunkach do eksperymentów, które nie wymagają specyficznie zróżnicowanych komórek.

Pokazane tutaj obrazy konfokalne potwierdzają ekspresję białka motorycznego słuchowego prestyny w komórkach HEI-OC1 hodowanych w temperaturze 33 stopni Celsjusza i 39 stopni Celsjusza. Należy zauważyć, że prestyna immunolokalizuje się głównie w cytoplazmie komórek HEI-OC1 rosnących w warunkach permisywnych i jest bardziej skoncentrowana na błonie plazmatycznej w bardziej zróżnicowanych komórkach. Badania cytometrii przepływowej wykazały wyraźny wzrost ekspresji prestyny w obu warunkach, co sugeruje, że translokacji towarzyszyła synteza większej liczby cząsteczek prestyny.

Z drugiej strony, badania elektrofizjologiczne wykazały solidny NLC w ogniwach HEI-OC1 rosnących w temperaturze 33 stopni Celsjusza, z wartością szczytową, która spadła, i napięciem przy pojemności szczytowej, które przesunęło się do bardziej zdepolaryzowanych wartości, gdy ogniwa zostały przeniesione do warunków niedozwolonych na jeden i dwa tygodnie. Co ciekawe, wyniki te sugerują, że funkcje motoryczne mogą być zagrożone, jeśli gęstość cząsteczek prestyny w błonie komórkowej jest zbyt wysoka. Należy pamiętać, że opisane tutaj protokoły wymagają prawidłowego stosowania dobrze znanych technik hodowli komórkowych.

Pamiętaj też, aby unikać stosowania antybiotyków. Ponadto należy pamiętać, że fenotyp i odpowiedź komórek HEI-OC1 będą silnie zależały od parametrów hodowli.