Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Ogólnym celem tej techniki jest skuteczne wychwytywanie żywotnych krążących komórek nowotworowych lub CTC z krwi pełnej. Te CTC mogą być umieszczane w hodowli lub wykorzystywane do dalszych analiz, które wymagają próbek nieutrwalonych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów.

Może być również stosowany do śledzenia postępu choroby, odpowiedzi na terapię i oceny ryzyka nawrotu. Zaletą tej techniki jest możliwość bezznacznikowego wychwytywania żywych CTC z dowolnego guza litego przy jednoczesnym zachowaniu niezależności od ekspresji biomarkerów. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł uwolnienia CTC z filtra, ponieważ chcieliśmy przeprowadzić dalszą analizę RNA i hodowlę CTC, zamiast hodować je in situ na filtrze.

Aby rozpocząć eksperyment, zważ wystarczającą ilość PIPAAm, aby przygotować 10% roztwór wagowy na objętość w 15-mililitrowej probówce zawierającej butanol. Obracaj probówkę, aż roztwór będzie klarowny. Następnie pokrój plastikowe szkiełka mikroskopowe na kwadraty o wymiarach około 12 milimetrów na 12 milimetrów za pomocą nożyczek.

Następnie, za pomocą ostrych nożyczek o prostych krawędziach, pokrój wafel mikrofiltracyjny z porami szczelinowymi na kwadraty o wymiarach osiem milimetrów na osiem milimetrów i umieść te kawałki bezpośrednio na plastikowych kwadratach. Za pomocą taśmy z folii poliamidowej przymocuj przycięte filtry do plastikowych kwadratów, tylko na krawędzi i rogu filtra, tak aby co najmniej siedem milimetrów na siedem milimetrów powierzchnia filtra nie była pokryta taśmą. Umieść mikrofiltr, który jest przymocowany do plastikowego kwadratu, na uchwycie próżniowym wirówki.

Zaprogramuj powlekarkę wirową zgodnie z następującym przepisem. Następnie, za pomocą standardowej plastikowej pipety transferowej, dozuj wystarczającą ilość 10% wag na objętość roztworu PIPAAm, aby całkowicie pokryć powierzchnię mikrofiltra i uruchomić powlekarkę wirową. Po zakończeniu powlekania wyjmij mikrofiltr z powłoką PIPAAm z powlekarki wirowej i pozostaw filtr przymocowany do plastikowego kwadratu na czas przechowywania.

Przejdź do montażu kasety filtracyjnej i ponownie nawodnij mikrofiltr pokryty PIPAAm w temperaturze pokojowej, umieszczając mikrofiltr na szalce Petriego. Dodaj 1X PBS, aż mikrofiltr zostanie całkowicie zanurzony. Po etapie hydratacji uwolnij filtr z plastikowego kwadratu, obierając lub odcinając taśmę z folii poliimidowej od filtra.

Następnie zmontuj mikrofiltr w kasecie filtracyjnej, umieszczając mikrofiltr między górnym i dolnym elementem akrylowym wzdłuż elementów PDMS, które działają jak uszczelka. Następnie zaciśnij akrylową kasetę za pomocą klipsów, aby zabezpieczyć filtr, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Podgrzej trzy mililitry pożywki do hodowli komórkowych McCoya do 37 stopni Celsjusza.

Dodaj 7,5 mililitra zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS do 7,5 mililitra próbki krwi i odessaj tę rozcieńczoną krew do 25-mililitrowej strzykawki. Po zidentyfikowaniu górnej części kasety, połącz kasetę filtracyjną ze strzykawką i umieść ją na pompie strzykawki. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu 75 mililitrów na godzinę.

Umieść rurkę o pojemności 50 mililitrów na dole, aby zebrać przepływ i uruchomić pompę. Po zakończeniu filtracji odłącz kasetę filtracyjną, zwracając uwagę, po której stronie znajduje się góra, po której znajdują się ogniwa uwięzione w powierzchni pokrytej PIPAAm. Odessać jeden mililitr ciepłej pożywki hodowlanej do nowej strzykawki.

Ponownie określ górną część kasety, a następnie ponownie połącz kasetę filtracyjną ze strzykawką zawierającą medium i zaczep dolny koniec kasety tak, aby powierzchnia filtra pokryta PIPAAm była skierowana w stronę przeciwną do strzykawki. Następnie umieść strzykawkę z powrotem na pompie strzykawkowej i przytrzymaj sześciodołkową płytkę tuż pod kasetą filtracyjną. Ustaw natężenie przepływu i uruchom pompę.

Przepuść całe medium przez filtr i zbierz przepływ na szalce Petriego. Poczekaj, aż całe medium przejdzie przez pompę, a następnie zatrzymaj pompę i wyjmij strzykawkę i kasetę filtracyjną z pompy. Następnie odłącz kasetę filtracyjną od strzykawki i otwórz ją, aby wyjąć filtr z kasety.

Umieść filtr powierzchnią PIPAAm skierowaną w dół na tej samej szalce Petriego, która służy do zbierania przepływu wstecznego podczas uwalniania komórek z porów. Dodaj resztę ciepłej pożywki i umieść szalkę Petriego w inkubatorze do hodowli nastawionym na 37 stopni Celsjusza. Po wyjęciu filtra z kasety bardzo ważne jest, aby umieścić go na płytce komórkami skierowanymi w dół i, jeśli to konieczne, delikatnie potrząśnąć nim w mediach, aby upewnić się, że ogniwa są odłączone od filtra.

Po 24 godzinach w hodowli ostrożnie wyjmij mikrofiltr za pomocą kleszczy i wyrzuć filtr. Delikatnie zawiesić erytrocyty i komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Bardzo ważne jest, aby zachować szczególną delikatność podczas ponownego zawieszania erytrocytów i PBMC, aby uniknąć pipetowania CTC.

Ostrożnie usuń całą pożywkę zawierającą zawieszone erytrocyty i PBMC, pozostawiając przyczepione komórki rakowe i zastąp komórki świeżą pożywką, wstępnie podgrzaną do 37 stopni Celsjusza. Kontynuuj ocenę żywotności CTC. Wykorzystując krew zdrowych dawców wzbogaconą hodowanymi komórkami rakowymi, technika reakcji termicznej uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych lub CTC osiągnęła skuteczność wychwytywania, uwalniania i pobierania odpowiednio 94%82% i 77%.

Skuteczność uwalniania i pobierania filtrów niepowlekanych była znacznie niższa. Przeprowadzono test żywych zmarłych w celu oceny żywotności komórek przed skokiem do krwi i po uwolnieniu. Komórki pozostały żywotne po uwolnieniu i szybko się rozwijały w hodowli.

Komórki SKBr-3 pobrano z krwi za pomocą filtra szczelinowego pokrytego powłoką PIPAAm i posiano na płytce 48-dołkowej. Po 16 godzinach w hodowli komórki nowotworowe przylegają do płytki hodowlanej wraz z hipotonicznymi erytrocytami i leukocytami, które osadzają się na dnie płytki. Po umyciu usunięto nieprzylegające komórki, pozostawiając na płytce tylko przylegające komórki nowotworowe.

Te same filtry mogą być używane do wychwytywania komórek stałych, zarówno do liczenia, jak i charakterystyki molekularnej CTC w celu śledzenia postępu raka i lepszego leczenia raka. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się CTC, umożliwiając funkcjonalną charakterystykę tych komórek w celu zbadania przyszłych celów leków, jednocześnie robiąc krok w kierunku medycyny spersonalizowanej.