Name: Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę oceny odpowiedzi immunologicznej płuc po szczepieniu BCG u myszy, porównującą skuteczność ochronną podawania donosowego i podskórnego. Badanie identyfikuje parametry immunologiczne korelujące z ochroną, w tym rolę IL17.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez "Hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności" [numer grantu BIO2014-5258P], "Komisję Europejską" przez programy H2020 [numery grantów TBVAC2020 643381].

Wszystkie myszy były trzymane w kontrolowanych warunkach i obserwowane pod kątem jakichkolwiek oznak choroby. Prace eksperymentalne prowadzono zgodnie z europejskimi i krajowymi dyrektywami dotyczącymi ochrony zwierząt doświadczalnych oraz za zgodą właściwych lokalnych komisji etycznych.
1. Przygotowanie ilościowych zapasów glicerolu BCG Danish i Mycobacterium tuberculosis H37Rv
UWAGA: Wszystkie opisane protokoły zostały wykonane w warunkach BSL3.

<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone zapasy glicerolu szczepów BCG Danish lub H37Rv i zaszczepić 100 μl w 10 ml pożywki 7H910 uzupełnionej Tween-80 0,05% (v/v) i ADC (albumina, dekstroza, katalaza) 10% (v/v).</li>
	<li>Inkubować w warunkach statycznych przez tydzień w temperaturze 37 °C, aż kultura znajdzie się w fazie logarytmicznej.</li>
	<li>Zwiększ skalę hodowli bakteryjnej, przenosząc 10-mililitrową kulturę do 200 ml świeżej pożywki. Inkubować przez dodatkowe 20 dni w warunkach statycznych.</li>
	<li>Przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przez 15 minut przy 2500 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić osad bakteryjny w pozostałej objętości. Dodaj do każdej probówki sterylne szklane kulki o średnicy 3 mm (10 - 15 na probówkę).</li>
	<li>Wiruj energicznie przez 1 minutę w celu dysocjacji grudek bakteryjnych. Zawiesić każdą osadkę w 10 ml PBS za pomocą Tween-80 0,05% (v/v).</li>
	<li>Pozostaw probówki na 10 minut, aby osadzały się największe agregaty bakteryjne i szklane kulki.</li>
	<li>Odzyskać 9,5 ml supernatantu z każdej z 4 probówek zawierających małe grudki i pojedyncze bakterie i przenieść objętości do jednej świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (końcowa odzyskana objętość 38 ml). Wirować przez 10 minut przy 400 x g.</li>
	<li>Odzyskać 35 ml supernatantu (zawierającego głównie pojedyncze bakterie) w jednej świeżej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 15 ml PBS z glicerolem 50% (v/v), uzyskując końcowe stężenie glicerolu 15% (v/v).</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i rozprowadzić w 1 ml porcji w odpowiednich probówkach do zamrażania. Przechowywać w temperaturze -80 °C (jedna partia zawiera około 50 porcji glicerolu).</li>
	<li>Aby określić ilościowo zapasy glicerolu, rozmrozić glicerolu następnego dnia po zamrożeniu i wykonać siedem dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń w oddzielnych 1,5-mililitrowych probówkach zawierających 900 μl PBS.</li>
	<li>Płytka 100 μl każdego rozcieńczenia w stałym podłożu agarowym7H10 10 uzupełnionym ADC 10% (v/v) przygotowanym na szalkach Petriego o średnicy 55 mm.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj szklane kulki o średnicy 3 mm (ok. 10 na płytkę) i delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić objętość na płytce agarowej. Wyrzuć koraliki i uszczelnij płytkę agarową parafilmem.</li>
	<li>Inkubować przez 21 dni w temperaturze 37 °C i oznaczyć stężenie bakterii, licząc jednostki tworzące kolonie (CFU) w rozcieńczeniach, w których można dokładnie rozróżnić pojedyncze kolonie.</li>
</ol>
2. Szczepienie myszy
<ol>
	<li>Rozmrozić wstępnie oznaczoną ilościowo glicerolę BCG i rozcieńczyć ją w PBS, aby przygotować dwie zawiesiny. Obliczyć objętość końcową, biorąc pod uwagę, że dawka na zwierzę wynosi 100 μl w przypadku podawania podskórnego (10,7 jtk/ml w przypadku szczepienia podskórnego) i 40 μl w przypadku podawania donosowego (2,5 x 10,7 jtk w przypadku szczepienia donosowego).</li>
	<li>Użyj specjalistycznej stacji anestezjologicznej dla gryzoni, aby znieczulić myszy mieszaniną izofluranu i tlenu. Użyj izofluranu 5% do wywołania znieczulenia i 2% do utrzymania myszy w komorze anestezjologicznej. (Można zastosować inną akceptowaną metodę znieczulenia).</li>
	<li>W celu podania szczepionki podskórnej napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml igłą 26 G z 1 ml zawiesiny bakteryjnej (10-7 jtk/ml). Usuń pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na płaskiej powierzchni w pozycji leżącej wewnątrz kaptura z przepływem laminarnym i zaszczepij podskórnie 100 μl (10,6 CFU/dawkę) szczepionki w bok grzbietu myszy. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją, aby upewnić się, że prawidłowo dochodzi do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Zmieniać igłę strzykawki między kolejnymi podanymi dawkami myszy. Usunięto pęcherzyki powietrza, jak opisano powyżej.</li>
	<li>W przypadku podawania donosowego umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej wewnątrz kaptura.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety pobrać 20 μl zawiesiny o stężeniu 2,5 x 107 jtk/ml. Umieść inokulum kropla po kropli między dwoma nozdrzami, aż cała objętość zostanie zdeponowana, pozostawiając czas między kroplami, aby mysz mogła wdychać objętość. Uwaga: myszy mogą cierpieć na niewydolność oddechową podczas tej procedury, dlatego należy je pozostawić do przyswojenia każdej kropli przed podaniem następnej, aby zapobiec jej w takim samym stopniu jak to możliwe.</li>
	<li>Ponownie napełnij mikropipetę kolejnymi 20 μl i powtórz operację. Jeśli mysz zacznie budzić się ze znieczulenia po pierwszym zaszczepieniu, umieść ją w komorze anestezjologicznej przed drugim. Umieść mysz z powrotem w klatce i upewnij się, że prawidłowo dochodzi do siebie po znieczuleniu.</li>
</ol>
3. Wyzwanie donosowe myszy ze szczepem H37Rv
<ol>
	<li>Rozmrozić wstępnie oznaczoną ilościowo glicerolę H37Rv i rozcieńczyć ją w PBS, aby przygotować zawiesinę bakteryjną o stężeniu 2 500 CFU na ml. Obliczyć końcową objętość, biorąc pod uwagę, że dawka na zwierzę wynosi 40 μl.</li>
	<li>H37Rv jest inokulowany donosowo, jak opisano w 2,5 - 2,7. Końcowa dawka prowokacyjna na mysz wynosi 10,2 jtk/40 μl.</li>
</ol>
4. Analiza indukowanej odpowiedzi immunologicznej w płucach
<ol>
	<li>Zawiesina komórkowa płuc 
	UWAGA: Ocena indukowanej szczepionką adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej w płucach wymaga wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. W tym celu używamy dysocjatora tkankowego, takiego jak GentleMACS.
	<ol>
		<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy (lub inną akceptowaną humanitarną metodologię) i upewnij się, że mysz nie dotyka gałki ocznej, aby potwierdzić brak odruchu mrugania.</li>
		<li>Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym wyciągnij płuca za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy i umieść je na czystej powierzchni. Oczyść płuca, usuwając tchawicę i tkankę łączną, a następnie przenieś płuca do 1,5 ml probówki z PBS (trzymaj na lodzie do czasu przetworzenia).</li>
		<li>Aby wytworzyć zawiesinę komórkową, umieść płuca w odpowiedniej probówce do dysocjacji narządów (probówka z dysocjatorem C) zawierającej 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 i 1,8 mM buforu CaCl2.</li>
		<li>Dodać 100 μl kolagenazy D 100 mg/ml (stężenie końcowe 2 mg/ml) i 40 μl DNAzy I 20 000 j.m./ml (160 j.m./ml stężenie końcowe. 
		UWAGA: Roztwory podstawowe kolagenazy D lub DNazyI przygotowuje się rozpuszczając liofilizowane enzymy odpowiednio w PBS lub glicerolu 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7,5 y MgCl2 1 mM.</li>
		<li>Umieść rurkę w dysocjatorze tkankowym i użyj predefiniowanego programu m_lung_01 do fragmentacji płuc. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.</li>
		<li>Umieść probówkę w dysocjatorze i użyj predefiniowanego programu m_lung_02 do całkowitej homogenizacji płuc do pojedynczej zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Przepuścić zawiesinę komórkową przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm zamontowane w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyj sitko 10 ml pożywki RPMI 1640.</li>
		<li>Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu lizującego erytrocyty, wymieszać przez wirowanie i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 10 ml pożywki RPMI 1640 i wirować komórki przez 5 minut w sile 400 x g.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS), 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml streptomycyny, 100 IU/ml penicyliny i 50 μM 2-merkaptoetanolu. 
		UWAGA: FCS inaktywuje się przez inkubację w temperaturze 56°C przez 30 minut.</li>
		<li>Policz komórki i dodaj kompletną pożywkę RPMI 1640, aby osiągnąć końcową gęstość komórkową 107 komórek/ml. 
		UWAGA: Do zliczania komórek używamy automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej na sterylnej płytce z dnem U 96 dołków (106 komórek / dołek).</li>
		<li>Dodać 50 μl/studzienkę kompletnej pożywki RPMI 1640 z 15 μg/ml komercyjnej pochodnej białka oczyszczonego H37Rv (PPD) (stężenie końcowe 5 μg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie supernatantu do oznaczania cytokin metodą ELISA
	<ol>
		<li>Inkubować płytkę z 4.1.14 przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Odwirować płytkę przez 5 minut przy 400 x g i odzyskać 100 μl supernatantu.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć supernatanty 1/10 i 1/2 w buforze do oznaczania odpowiednio IFNγ i IL17A. Oznacz stężenia cytokin za pomocą dostępnych w handlu zestawów ELISA, zgodnie z instrukcjami producenta (zestawy rozwojowe ELISA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie wewnątrzkomórkowe w celu oznaczenia komórek CD4 + wytwarzających cytokiny za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Inkubować płytkę z 4.1.14 przez 18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Dodać 1,5 μl Brefeldin A 1 mg/ml (bulion rozpuszczony w DMSO) do każdego dołka (10 μg/ml stężenie końcowe) i inkubować przez dodatkowe sześć godzin.</li>
		<li>Odwirować płytkę z 4.3.2 przez 1 minutę przy 3200 x g i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 50 μl anty-mysiego CD4-FITC rozcieńczonego w RPMI 1640 z 10% FCS (1/500) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować płytkę z 4.3.4 przez 1 minutę przy 3 200 x g, odrzucić supernatant i dodać 100 μl/basenik roztworu utrwalającego. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie 150 μl/popłuczynę roztworu przepuszczalnego. 
		UWAGA: 10x skoncentrowany bulion rozcieńcza się w wodzie dejonizowanej, aby przygotować 1x roztwór roboczy.</li>
		<li>Zawieś komórki w 50 μl anty mysiego IFNγ-APC i anty-mysiego IL17A-APC. Cy7 rozcieńczony w roztworze przepuszczalnym (1/250 oba przeciwciała).</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie 150 μl/przemycie roztworu permeabilizacyjnego.</li>
		<li>Zawieś komórki w 200 μl PBS w celu akwizycji cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza immunoglobulin w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL)
<ol>
	<li>Pobieranie próbek BAL
	<ol>
		<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy (lub inną akceptowaną humanitarną metodologię) i upewnij się, że mysz nie dotyka gałki ocznej, aby potwierdzić brak odruchu mrugania.</li>
		<li>Odsłoń tchawicę za pomocą odpowiednio precyzyjnych sterylnych kleszczy i nożyczek i wykonaj małe nacięcie w tchawicy, uważając, aby nie wyciąć jej całkowicie. Należy uważać, aby nie spowodować krwawienia, które mogłoby zanieczyścić próbkę BAL.</li>
		<li>Wprowadzić do tchawicy kaniulę połączoną ze sterylną strzykawką o pojemności 1 ml z 800 μl lodowatego PBS.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć PBS do płuc, a następnie odzyskać objętość BAL, bardzo powoli cofając tłok strzykawki, aby uniknąć zapadnięcia się płuc. 
		UWAGA: Odzysk od 500 do 600 μl jest zadowalający.</li>
		<li>Przenieść objętość BAL do probówki o pojemności 1,5 ml i upewnić się, że BAL pozostaje niezabarwiony, co wskazuje, że nie jest zanieczyszczony krwią (przechowywać na lodzie do czasu przetworzenia).</li>
		<li>Odwirować próbki BAL przez 5 minut przy 400 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
		<li>Przechowywać supernatanty w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie IgA w supernatantach BAL 
	UWAGA: Wszystkie użyte odczynniki mają temperaturę RT.
	<ol>
		<li>96-dołkowe płytki z płaskiego dna polistyrenu o wysokim stopniu wiążącego białka pokryć 100 μl PPD rozcieńczonego w PBS (10 μg/ml) do oznaczania IgA swoistego dla M. tuberculosis lub 100 μl supernatantu BAL rozcieńczonego 10 razy w PBS w celu oznaczenia całkowitej IgA.</li>
		<li>Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i postukaj płytką o ręcznik papierowy, aby wyschł. Przemyć 200 μl/studzienkę PBS.</li>
		<li>Blok z 200 μl/basenik albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 1% (w/v) w PBS-Tween-80 0,05% (v/v) (bufor blokujący).</li>
		<li>Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć raz 200 μl/studzienkę PBS-Tween-80 0,05% (v/v) (bufor do mycia).</li>
		<li>Dodać 100 μl nierozcieńczonego supernatantu BAL do studzienek pokrytych PPD. Inkubować dwie godziny w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Jeżeli oznaczanie całkowitej IgA odbywa się równolegle z oznaczaniem IgA specyficznej dla PPD, podczas tej inkubacji należy pozostawić studzienki całkowitej IgA ze 100 μl buforu do przemłukiwania.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie 200 μl/studzienkę buforu do mycia.0170004</li>
		<li>Dodać 100 μl anty-mysiej IgA sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczonej w buforze blokującym (1/10 000).</li>
		<li>Inkubować 1 godzinę RT.</li>
		<li>Przemyć pięć razy 200 μl/studzienkę buforu do płukania.</li>
		<li>Dodać 100 μl/basenik 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB). Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Dodać 100 μl/basenikH2SO4 0,5N. Odczytać płytkę w spektrofotometrze o długości fali 450 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Oznaczanie obciążenia bakteryjnego w płucach
<ol>
	<li>Homogenizacja i posiew płuc
	<ol>
		<li>Cztery tygodnie po prowokacji poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy (lub inną akceptowaną humanitarną metodologię) i upewnij się, że mysz jest martwa, dotykając gałki ocznej, aby potwierdzić brak odruchu mrugania.</li>
		<li>Umieść mysz w pozycji leżącej, zamocowaną na płaskiej i zdezynfekowanej powierzchni wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie i usuń skórę z okolicy klatki piersiowej, aby pozostawić widoczny obszar klatki piersiowej.</li>
		<li>Wytnij żebra i zbierz płuca i serce za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy. Umieść narządy na czystej powierzchni.</li>
		<li>Oczyść płuca, usuwając serce, tchawicę i tkankę łączną, a następnie przenieś płuca do 1,5 ml probówki z 1 ml wody dejonizowanej (trzymaj na lodzie do czasu przetworzenia).</li>
		<li>Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś płuca każdej myszy do odpowiedniej probówki do homogenizacji narządów (M - probówka dysocjacyjna), zawierającej 1 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Umieścić probówkę w dysocjatorze tkankowym i za pomocą predefiniowanego programu RNA_1 homogenizować płuca.</li>
		<li>Wykonać pięć dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń w probówkach o pojemności 1,5 ml, zaczynając od 100 μl homogenatu płucnego rozcieńczonego w 900 μl.</li>
		<li>Rozcieńczenia płytki zgodnie z opisem w ppkt 1.11-1.14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie BCG i H37Rv za pomocą PCR 
	UWAGA: Na tabliczkach z 6.1.6 odpowiadających grupie szczepionej BCG drogą donosową, przeanalizowaliśmy reprezentatywną liczbę kolonii za pomocą rozróżniającego PCR między BCG i H37Rv, aby upewnić się, że CFU brany pod uwagę do oceny skuteczności ochronnej przyznanej przez szczepionkę odpowiadał jednoznacznie H37Rv. Ten PCR ma na celu amplifikację RD9, regionu genomowego różniącego się u BCG i M. tuberculosis, dając fragment 2618 pz dla H37Rv i 465 pz dla BCG 11.
	<ol>
		<li>Przygotować główny materiał mieszankowy dla wszystkich próbek o objętościach na próbkę zgodnie ze wskazaniami, a następnie rozprowadzić w probówkach do PCR (9 μl/próbkę). 
		UWAGA: Bufor 5x: 2 μl. Starter do przodu 25 μM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 μl, Starter odwrotny 25 μM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 μl, polimeraza Taq 5 jednostek/μl: 0,04 μl, Dejonizowany H2O: 6,32 μl.</li>
		<li>Dotknij kolonii sterylną wykałaczką i zanurz wykałaczkę z próbką w probówce PCR zawierającej mieszankę wzorcową.</li>
		<li>Uruchom PCR z następującym programem: 10 min 95 °C (ten krok ma na celu wywołanie zakłócenia bakteryjnego), 10 min 95 °C (ten krok ma na celu wywołanie zakłócenia bakteryjnego), 35 cykli (30 sekund w 95 °C, 1 min w 58 °C i 4 min w 72 °C).</li>
		<li>Załaduj próbki PCR do 1% żelu agarozowego z bromkiem etydyny i uruchom próbki, aby uwidocznić fragmenty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WHO+2014+global+tuberculosis+report--further+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go.</a> Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).</li>
<li>Mangtani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+BCG+vaccine+against+tuberculosis%3A+a+systematic+review+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials.</a> Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+dose-dependent+superior+protection+compared+to+that+of+subcutaneous+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).</li>
<li>Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+intranasal+mucosal+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+improved+protection+compared+to+subcutaneous+vaccination+against+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis.</a> Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).</li>
<li>Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+intranasal+vaccination+with+Mycobacterium+bovis+BCG+against+airway+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).</li>
<li>Lagranderie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG-induced+protection+in+guinea+pigs+vaccinated+and+challenged+via+the+respiratory+route%5BTitle%5D)+AND+%22Tuber+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route.</a> Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).</li>
<li>Gopal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17-dependent+CXCL13+mediates+mucosal+vaccine-induced+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis.</a> Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).</li>
<li>Khader, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+and+IL-17+in+the+establishment+of+protective+pulmonary+CD4%2B+T+cell+responses+after+vaccination+and+during+Mycobacterium+tuberculosis+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge.</a> Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+but+Not+Subcutaneous+Delivery+of+BCG+Vaccine+Confers+Protection+to+Tuberculosis-Susceptible+Mice+by+an+Interleukin+17-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism.</a> J Infect Dis. , (2015).</li>
<li>Middlebrook, G., Cohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriology+of+tuberculosis%3A+laboratory+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Public+Health+Nations+Health%22%5BJournal%5D)">Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods.</a> Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).</li>
<li>Brosch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+evolutionary+scenario+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).</li>
<li>Kaushal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+vaccination+with+attenuated+Mycobacterium+tuberculosis+induces+strong+central+memory+responses+and+protects+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis.</a> Nat Commun. 6, 8533(2015).</li>
<li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).</li>
<li>Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transport+within+cerebral+perivascular+spaces+underlies+widespread+tracer+distribution+in+the+brain+after+intranasal+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).</li>
<li>Griffiths, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+enhances+vaccine-induced+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> PLoS One. 8 (10), e78312(2013).</li>
<li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+Th17+cells+in+Peyer%27s+patches+is+responsible+for+the+induction+of+T+cell-dependent+IgA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses.</a> Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).</li>
<li>Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lung+mucosal+Th17-mediated+responses+induce+polymeric+Ig+receptor+expression+by+the+airway+epithelium+and+elevate+secretory+IgA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels.</a> J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż obecna szczepionka przeciwko gruźlicy, BCG, jest najczęściej podawaną szczepionką w historii, gruźlica pozostaje jedną z głównych przyczyn zgonów i zachorowalności z powodu chorób zakaźnych na całym świecie. Ten paradoks tłumaczy się brakiem ochrony tej szczepionki przed gruźlicą płuc, która jest odpowiedzialną formą transmisji. Pilnie potrzebne są nowe metody szczepień skuteczne przeciwko płucnym postaciom choroby, ponieważ miałyby one największy wpływ na przenoszenie choroby na całym świecie.
<p class='jove...

Gruźlica (TB) jest jedną z głównych chorób zakaźnych powodujących więcej zgonów niż HIV na świecie, a w połączeniu z rosnącym wzrostem szczepów wielolekoopornych sprawia, że gruźlica jest alarmującym globalnym problemem zdrowotnym1. Nowe narzędzia diagnostyczne, skuteczniejsze i mniej toksyczne leki oraz nowe bezpieczne i skuteczne szczepionki przeciwko gruźlicy są pilną potrzebą, zwłaszcza w krajach rozwijających się.
Live atenuated Bacille Calmette-Guerin (BCG) jest obecnie jedyną licencjonowaną szczepionką przeciwko gruźlicy, która jest podawana śródskórnie po urodzeniu od lat siedemdziesiątych na całym świecie. Uważa się, że BCG jest skuteczna w zapobieganiu ciężkim postaciom choroby (zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i gruźlica prosówkowa) u dzieci, ale wykazała niespójną skuteczność przeciwko gruźlicy płuc odpowiedzialnej za przenoszenie choroby 2.
Szczepienie płucne, które naśladuje naturalną drogę zakażenia gruźlicą, stanowi atrakcyjne podejście do pobudzania lokalnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. W związku z tym różne prace przedkliniczne na różnych odpowiednich modelach zwierzęcych gruźlicy wykazały większą skuteczność szczepionki po szczepieniu płucnym w porównaniu z drogą podskórną lub śródskórną 3-6. Niemniej jednak mechanizmy ochronne wywoływane przez szczepienie płucne nie są dobrze poznane. W ostatnich latach kilka prac wskazywało na odpowiedź za pośrednictwem IL17 jako ważny czynnik specyficznej dla gruźlicy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej, ponieważ w modelach mysich z niedoborem szczepionki błony śluzowej IL17 skuteczność ochronna wywołana szczepionką jest upośledzona 7,8.
Ostatnio po raz pierwszy wykazaliśmy, że donosowe podawanie BCG chroniło myszy DBA/2, szczep myszy charakteryzujący się brakiem ochrony po podskórnej immunizacji BCG 9. Wyniki te sugerują, że szczepienie przeciwko gruźlicy układu oddechowego może być bardziej skuteczne w zmniejszaniu częstości występowania gruźlicy w krajach endemicznych, w których śródskórne BCG jest uważane za nieskuteczne w walce z gruźlicą płuc.

<table><tbody><tr><td>Rosół Middlebrook 7H9</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Wzbogacanie</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane o średnicy 3 mm</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml 26GA 0,45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>Dysocjator GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Rurki C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M Rurki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro; m Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący czerwone krwinki</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x skoncentrowany</td></tr><tr><td>roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x skoncentrowana</td></tr><tr><td>surowica cielęca płodu</td><td>Biologiczna Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Ręczny automatyczny licznik komórek</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Czujniki licznika komórek, 40 i mikro; m</td><td>Milipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IFN-&gamma; Zestaw rozwojowy ELISA&nbsp;</td>Zestaw rozwojowy <td>MABTECH</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD 553047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-Mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0,60 x 30 mm. 23G x 1 1/4"</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Stosowany jako kaniula tchawicy do</td></tr><tr><td>wysokobiałkowych 96-dołkowych płytek polistyrenowych wiążących wysokobiałkowe MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgA (&alfa;-łańcuch specyficzny)&minus; Przeciwciało przeciwko peroksydazie</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polimeraza</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>Zestaw zawiera bufor 5x</td></tr></tbody></table>

skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym bcg myszom

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Pomimo globalnego zasięgu śródskórnych szczepień BCG, gruźlica pozostaje jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób zakaźnych na świecie. Dane przedkliniczne wskazują, że szczepionki przeciwko gruźlicy płuc są obiecującą strategią zapobiegania chorobom płuc, które są odpowiedzialne za przenoszenie. W niniejszej pracy opisano metodologię zastosowaną do wykazania w modelu mysim korzyści płynących ze szczepienia donosowego BCG w porównaniu z podskórnym. Nasze dane wykazały większą skuteczność ochronną po donosowym podaniu BCG. Ponadto nasze wyniki wskazują, że szczepienie płucne wywołuje wyższą odpowiedź immunologiczną w płucach, w tym odpowiedzi Th1 i Th17, a także wzrost stężenia immunoglobuliny A (IgA) w drogach oddechowych. Nasze dane wskazują na korelację między skutecznością ochronną a obecnością komórek wytwarzających IL17 w płucach po prowokacji Mycobacterium tuberculosis, co sugeruje rolę tej cytokiny w odpowiedzi ochronnej zapewnianej przez szczepienie płucne. Na koniec szczegółowo opisujemy globalny przepływ pracy, który opracowaliśmy w celu zbadania szczepień układu oddechowego w modelu mysim, które można ekstrapolować na inne szczepionki przeciw gruźlicy, oprócz BCG, ukierunkowane na odpowiedź śluzówkową lub inne drogi podania płucnego, takie jak dotchawicza lub aerozol.

Niniejsza praca opisuje porównanie dwóch dróg podania BCG: podskórnej oraz donosowej. Droga podskórna jest porównywalna z drogą śródskórną, która jest obecnie stosowaną na całym świecie kliniczną drogą podawania BCG. Donosowa droga szczepienia ma na celu naśladowanie naturalnej drogi zakażenia M. tuberculosis, w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej bezpośrednio w płucach, które są głównym narządem docelowym tego patogenu.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Szczegółowo opisujemy metodologię stosowaną do porównania skuteczności ochronnej i odpowiedzi immunologicznej płuc indukowanej przez donosowe i podskórne szczepienie z BCG w modelu mysim. Nasze wyniki pokazują korzyści płynące ze szczepienia płuc i sugerują rolę odpowiedzi za pośrednictwem IL17 w ochronie indukowanej szczepionką.

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie odpowiedzi immunologicznych w płucach po immunizacji przeciwko gruźlicy, w tym ochronnej skuteczności szczepionki w obliczu wyzwania donosowego oraz lokalnej odpowiedzi immunologicznej płuc wywołanej szczepionką. Metodyka ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie szczepionek przeciw gruźlicy, w tym w identyfikacji obronnych odpowiedzi immunologicznych płuc wywoływanych przez szczepionki płucne w celu optymalnej ochrony immunologicznej płuc. Jedną z zalet tej metody jest możliwość indywidualnej oceny odpowiedzi immunologicznej płuc u zwierzęcia równolegle z oceną skuteczności ochronnej.co pozwala na zidentyfikowanie konkretnych parametrów odpornościowych korelujących z ochroną. W celu podania podskórnego szczepionki BCG, najpierw należy napełnić jednofazową strzykawkę 1 ml wyposażoną w igłę 26G jednym mililitrem zawiesiny szczepionki BCG i usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie znieczuloną mysz należy umieścić w pozycji brzusznej w komorze z laminarnym przepływem powietrza i podać zwierzęciu podskórnie 100 µL bakterii w tylny bok.W celu podania donosowego nabierz do mikropipety 20 µL zawiesiny BCG i umieść znieczuloną mysz w pozycji grzbietowej wewnątrz komory. Podawaj inokulum kroplowo pomiędzy dwa otwory nosowe, aż do momentu podania całej objętości 20 µL, zachowując przerwy między kroplami, aby umożliwić myszy wdech zawiesiny. Następnie ponownie nabierz do mikropipety kolejne 20 µL bakterii i powtórz procedurę podania.W celu przeprowadzenia wyzwania donosowego szczepem prątków gruźlicy H37Rv, w odpowiednim punkcie czasowym eksperymentu po szczepieniu, zaszczep zwierzęta poprzez podanie donosowe 40 µL zawiesiny bakterii H37Rv, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Aby pobrać próbkę płukania pęcherzykowo-oskrzelowego lub próbkę z pęcherzyków płucnych, najpierw za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek odsłoń tchawicę. Następnie wykonaj niewielkie nacięcie w tchawicy, uważając, aby nie wyciąć tkanki całkowicie, i wprowadź kaniulę połączoną ze sterylną strzykawką 1 mL zawierającą 800 µL lodowatego PBS.Po wprowadzeniu kaniuli ostrożnie wypełnij płuca PBS, a następnie powoli odciągnij tłok, aby odzyskać co najmniej 500 do 600 µL płynu z płukania. Przenieś zawiesinę do probówki 1,5 mL umieszczonej w lodzie i upewnij się, że jest ona bezbarwna, co świadczy o braku zanieczyszczenia krwią. Próbki przechowywać w lodzie do czasu przetworzenia kulek.Aby określić ładunek bakteryjny i odpowiedź immunologiczną w płucach, unieruchom mysz za pomocą szpilek w pozycji grzbietnej na płaskiej i zdezynfekowanej powierzchni wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, a następnie wykonaj nacięcie skóry w górnej części klatki piersiowej. Następnie odchyl skórę, aby odsłonić obszar klatki piersiowej i rozetnij płuca. Używając sterylnych nożyczek i pęsety, pobierz płuca oraz serce, a następnie umieść organy na czystej powierzchni.Następnie należy usunąć serce, tchawicę oraz tkankę łączną. Każde płuco należy umieścić w osobnej probówce 1,5 mL zawierającej 1 mL wody dejonizowanej w lodzie w celu późniejszego oznaczenia ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych komórkowych. W porównaniu z drogą podskórną, donosowa droga szczepienia zapewnia znacznie większą skuteczność ochronną w płucach.Analiza reprezentatywnej liczby kolonii z grupy szczepionej donosowo BCG za pomocą PCR specyficznego dla regionu genomu RD9 wykazała, że wszystkie kolonie dają fragment o długości 0,4 kilo-par zasad, co odpowiada szczepowi H37Rv. Donosowe podanie BCG wywołuje wyższy poziom IL17 i interferonu gamma w płucach, co ujawnia korelację między skutecznością ochronną zapewnioną przez szczepienie donosowe BCG a indukowaną szczepionką odpowiedzią immunologiczną w płucach przed zakażeniem, objawiającą się wyższym stężeniem zarówno całkowitych IgA, jak i IgA specyficznych dla oczyszczonego pochodnej białka H37Rv w próbkach płukania u osobników szczepionych donosowo. Dalsza analiza komórek produkujących cytokiny w płucach po zakażeniu gruźlicą wykazała, że podczas gdy komórki produkujące interferon gamma były wykrywane we wszystkich grupach zainfekowanych, komórki CD4+ produkujące IL17A znaleziono wyłącznie w grupie szczepionej donosowo BCG, co dowodzi istotnej korelacji między obecnością IL17 a redukcją obciążenia bakteryjnego w płucach.Po zastosowaniu tej procedury możliwe jest porównanie miejscowych odpowiedzi immunologicznych w płucach przy użyciu różnorodnych biologicznie szczepionek przeciw gruźlicy, a także w zależności od różnych dróg podania i punktów czasowych po zakażeniu. Ponadto metodologia ta może zostać wykorzystana do oceny immunogenności szczepień po zakażeniu, co mogłoby pozwolić na identyfikację odpowiedzi immunologicznych korelujących z ochroną.Ważne jest, aby prace z Mycobacterium Tuberculosis prowadzić w laboratoriach wolnych od BSL, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ostrożności.

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy protokół testowania skuteczności bezkomórkowej szczepionki przeciw krztuścowi przeciwko zakażeniu Bordetella pertussis u myszy. Po szczepieniu myszy poddano infekcji, a ich homogenat tkankowy poddano hodowli w celu analizy kolonii bakteryjnych jako odczytu odporności ochronnej wywołanej szczepionką.

Ocena odporności indukowanej szczepionką przeciwko infekcji bakteryjnej w modelu mysim

Ten film demonstruje donosową immunizację BCG u myszy, aktywując zarówno wrodzoną, jak i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną, prowadząc do rozwoju rezydujących w płucach limfocytów T pamięci i efektorowych limfocytów B, zwiększając w ten sposób ochronę przed infekcjami Mycobacterium.

Immunizacja donosowa BCG w modelu mysim

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Obecna praca ilustruje wygodę stosowania immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i zapewnienia ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc u myszy.

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

Długoterminowy test immunologiczny związany z interferonem γ enzymem jest używany jako miara odpowiedzi pamięci centralnej i koreluje z ochronnymi odpowiedziami na szczepionkę przeciw prątkom. Dzięki temu testowi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są stymulowane antygenami prątkami i interleukiną-2 przez 14 dni, umożliwiając różnicowanie i ekspansję limfocytów T pamięci centralnej.

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Prezentowana jest nowatorska technika szybkiego wyświetlania antygenu na powierzchni bakteryjnej, która polega na powierzchniowej biotynylacji, a następnie ekspozycji na interesujące białka podczas fuzji z monomeryczną awidyną. Ładowanie BCG wybranymi antygenami skutecznie poprawia jego immunogenność, co sugeruje, że dekoracja powierzchni może zastąpić tradycyjne podejścia genetyczne.

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.

Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Tutaj prezentujemy alternatywny protokół aktywnego wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy C57BL/6, przy użyciu immunogennej epitopowej oligodendrocytów glikoproteiny mielinowej (MOG)35-55 zawieszonej w niekompletnym adiuwancie Freunda zawierającym zabity termicznie Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

Poznaj metodę oceny odpowiedzi immunologicznej płuc po szczepieniu BCG u myszy, porównującą skuteczność ochronną podawania donosowego i podskórnego. Badanie identyfikuje parametry immunologiczne korelujące z ochroną, w tym rolę IL17.

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

Przeglądaj więcej filmów