Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest bardzo prosta synteza hydrożeli do zastosowań w inżynierii tkankowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak możliwość utrzymania wysokiej żywotności komórek w trójwymiarowych systemach hodowli komórkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu szybkiej reakcji możemy łatwo modyfikować systemy hydrożelowe, aby poprawić ich zdolność do utrzymania żywotności komórek.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię urazów rdzenia kręgowego, ponieważ komórki umieszczone w rusztowaniu mogą odbudować uszkodzoną tkankę. Metoda ta może dostarczyć istotnych informacji na temat terapii komórkowych w ramach medycyny regeneracyjnej oraz ich zastosowania w wielu metodologiach. Może ona również zostać zastosowana w kilku innych układach, takich jak kości, serce i chrząstka.

Aby zsyntetyzować pochodną RGD-azydku, rozpuść 50 mg RGD w jednym mililitrze jednomolarnego wodorotlenku sodu. Następnie rozpuść 24 mg chlorku 4-azydobutanoylu w dwóch mililitrach tetrahydrofuranu. Dodaj powoli, kroplami, cały roztwór RGD do roztworu chlorku 4-azydobutanoylu w temperaturze 0 °C.

Pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej i mieszać przez noc. Dodać 1 mL 1 M HCl. Odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wirówki rotacyjnej.

Scharakteryzuj otrzymany produkt za pomocą spektroskopii protonowego rezonansu magnetycznego jądra, rozpuszczając próbkę w utlenku deuteru lub D2O. Aby przeprowadzić modyfikację alkiniową PAA, rozpuść 200 mg 35% wagowo roztworu PAA w 15 ml wody destylowanej. Dodaj 15,4 mg chlorowodorku propargilaminy.

Następnie rozpuść 42,8 mg HOBt w 14 ml roztworu acetonitrylu i wody destylowanej w stosunku jeden do jednego, podgrzewając do 50 °C. Dodaj cały roztwór HOBt do roztworu PAA w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 53,6 mg EDC do mieszaniny reakcyjnej.

Użyj jednomolarnego HCL, aby dostosować pH do 5,5, i mieszaj układ reakcyjny przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść 11,2 g chlorku sodu w dwóch litrach wody destylowanej. Potem dodaj 200 µL 37% wagowo HCL.

Przeprowadź dializę roztworu, używając membrany o progu odcięcia masy cząsteczkowej 3.5 kilodaltons. Proces dializy prowadź przez trzy dni. Codziennie wymieniaj roztwór do dializy na dwa litry świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 200 microliters 37%weight by weight HCL.

Przechowywać końcowy roztwór w temperaturze -80°C. Scharakteryzować funkcjonalizowany polimer za pomocą spektroskopii protonowego rezonansu magnetycznego jądra, rozpuszczając próbkę w D2O. Aby zsyntezować polimer PAA-RGD, rozpuścić 78 mg zmodyfikowanego alkinem PAA w 10 ml wody destylowanej.

Następnie rozpuścić 25 mg pochodnej RGD-azydy w pięciu mililitrach tetrahydrofuranu. Dodać cały roztwór RGD do roztworu polimeru. Następnie dodać 2,2 mg jodku miedzi.

Oraz 2,2 mg askorbinianu sodu. Gotować mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez noc w temperaturze 60 °C przy ciągłym mieszaniu. Schłodzić mieszaninę do 25 °C.

Aby przeprowadzić dializę roztworu, rozpuścić 11,2 g chlorku sodu w dwóch litrach wody destylowanej i dodać 200 µL 37% (w/w) HCl. Dializę prowadzić przez trzy dni. Roztwór do dializy wymieniać codziennie na dwa litry świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 200 µL 37% (w/w) HCl.

Następnie umieść końcowy roztwór w temperaturze -80 °C. Przeprowadź charakterystykę i przechowuj otrzymany polimer PAA-RGD w ten sam sposób, w jaki postąpiono z jego składnikami. W temperaturze pokojowej zmieszaj 40 mg karbomeru i 10 mg funkcjonalizowanego PAA w 9 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym aż do całkowitego rozpuszczenia.

Do roztworu dodać 400 mg PEG i mieszać przez 45 minut. Przerwać mieszanie i pozostawić układ do ustabilizowania na 30 minut. Następnie użyć 1 M wodorotlenku sodu, aby dostosować pH do 7.4.

Do pięciu mililitrów otrzymanej mieszaniny dodać 25 miligramów proszku agarozy. Naświetlać układ promieniowaniem mikrofalowym o mocy 500 watów przez okres od 30 sekund do jednej minuty, aż do zagotowania. Następnie podgrzać roztwór elektromagnetycznie do 80 stopni Celsjusza.

Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej, aż jej temperatura spadnie do 50 stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mililitrów PBS, aby uzyskać roztwór w stosunku objętościowym jeden do jednego. Przygotuj 12-dołkową płytkę zawierającą stalowe cylindry o średnicy 1,1 centymetra.

Pobierz 500 µL aliquotów z roztworu i umieść je w każdym stalowym cylindrze. Pozostaw płytkę w spoczynku na 45 minut, aż do całkowitej żelowania systemu. Wyjmij cylindry za pomocą szczypiec ze stali nierdzewnej, aby uzyskać hydrożele.

Zapoznaj się z protokołem tekstowym dotyczącym charakterystyki właściwości fizykochemicznych hydrożeli funkcjonalizowanych RGD. Carbomer 974P, PAA-RGD i PEG, wraz z agarozą, biorą udział w statystycznej losowej polikondensacji po naświetlaniu mikrofalowym. Grupy hydroksylowe zawarte w PEG i agarozie reagują z grupami karboksylowymi obecnymi w Carbomer 947P i PAA-RGD, tworząc hydrożele ACPEG-RGD.

Biorąc pod uwagę właściwości reologiczne, stwierdzono, że moduł zachowawczy jest o około rząd wielkości wyższy niż moduł strat, co wskazuje na materiał bardziej sprężysty niż lepki. Co więcej, wyraźnie widać, że przy niskich wartościach odkształcenia zachowanie hydrożelu jest zdominowane przez moduł sprężystości. Skaningowa mikroskopia elektronowa przedstawia morfologię próbki hydrożelu funkcjonalizowanego RGD oraz hydrożelu bez funkcjonalizacji.

Oba hydrożele wykazały, że posiadają silnie splątaną strukturę połączonych porów, przy czym niektóre większe pory zawierają mniejsze pory, a na ściankach porów widoczne są sieci włókniste. Podobne właściwości wskazują, że obecność RGD nie zmienia sieci polimerowej. Po tym opracowaniu technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie inżynierii tkankowej w celu zbadania stabilności tych systemów hodowli komórkowych w kilku innych jednostkach chorobowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat funkcjonalizacji hydrożeli w celu poprawy ich zdolności do utrzymania żywotności komórek macierzystych.