Name: Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD przy użyciu katalizowanej miedzią cykloaddycji alkin-azydowej i polikondensacji wspomaganej mikrofalami. Technika ta poprawia żywotność komórek w kulturach 3D i ma zastosowanie w terapii urazów rdzenia kręgowego oraz inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować prof. Maurizio Masi za owocną dyskusję i Pani Chiarze Allegretti za redakcję językową. Badania autorów są wspierane przez Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573).

Uwaga: Chemikalia są używane w takiej postaci, w jakiej zostały otrzymane. Kupowany jest liniowy RGD, ale można go wytworzyć za pomocą standardowej syntezy peptydów fazy stałejFmoc 16,19. Rozpuszczalniki są klasy analitycznej. Dializa wymaga użycia membrany o wartości odcięcia Mw równej 3 500 Da. Zsyntetyzowane związki charakteryzują się widmami 1H NMR zarejestrowanymi na spektrometrze 400 MHz przy użyciu chloroformu (CDCl3) lub tlenku deuteru (D2O) jako rozpuszczalników, a przesunięcia chemiczne są podawane jako wartości δ w częściach na milion. Ponadto hydrożele poddawane są analizie FT-IR przy użyciu techniki granulek KBr, a ich charakterystyka fizyczna obejmuje badania żelowania oceniane przy użyciu odwróconej probówki w temperaturze 37 °C.
1. Synteza chlorku 4-azydobutanoylu 1
<ol>
	<li>Rozpuścić 500 mg kwasu 4-azydobutanowego (3,90 mmol) w 10 ml dichlorometanu i 0,5 ml dimetyloformamidu.</li>
	<li>Schłodzić roztwór w temperaturze 0 °C, używając łaźni lodowej.</li>
	<li>Dodać 505 μl chlorku szczawilu (5,85 mmol) do 5 ml dichlorometanu i powoli dodawać kroplami do układu reakcyjnego, mieszając.</li>
	<li>Po 1 godzinie w temperaturze 0 °C przy użyciu łaźni lodowej powrócić do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.</li>
	<li>Otrzymany produkt scharakteryzować za pomocą 1spektroskopii H-NMR, rozpuszczając próbkę w CDCl316.</li>
</ol>
2. Synteza pochodnej RGD-azydku 2
<ol>
	<li>Rozpuścić 50 mg RGD (0,145 mmol) w 1 ml 1 M NaOH.</li>
	<li>Rozpuścić 24 mg z 1 (0,16 mmol) w 2 ml tetrahydrofuranu.</li>
	<li>Dodać cały roztwór RGD do roztworu 1 kroplami w temperaturze 0 °C za pomocą łaźni lodowej.</li>
	<li>Wróć do temperatury pokojowej i mieszaj przez noc.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1 M HCl.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.</li>
	<li>Otrzymany produkt scharakteryzować za pomocą spektroskopii 1H-NMR, rozpuszczając próbkę w D2O16.</li>
</ol>
3. Modyfikacja alkinu PAA 3
<ol>
	<li>Rozpuścić 200 mg 35% w/w roztworu PAA (2,8 mmol) w 15 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Dodać 15,4 mg chlorowodorku propargyloaminy (0,20 mmol).</li>
	<li>Rozpuścić 42,8 mg hydratu 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, 0,28 mmol) w 14 ml roztworu acetonitrylu destylowanego w stosunku 1:1 v/v, ogrzewając go do temperatury 50 °C.</li>
	<li>Dodać cały roztwór HOBt do roztworu PAA w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 53,6 mg etylodimetyloaminopropylokarbodimidu (EDC, 0,28 mmol) do mieszaniny reakcyjnej.</li>
	<li>Użyj 1 M HCl, aby dostosować pH do 5,5 i mieszać system reakcyjny przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dializuj roztwór. Rozpuścić 11,2 g chlorku sodu w 2 l wody destylowanej, a następnie dodać 0,2 ml 37% m/w HCl. Roztwór należy dializować za pomocą membrany o wartości odcięciaM w 3,5 kDa.</li>
	<li>Wykonuj dializy przez trzy dni. Codziennie zmieniaj roztwór dializacyjny na 2 l świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 0,2 ml 37% m/w HCl.</li>
	<li>Roztwór końcowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Liofilizować go w liofilizatorze zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Scharakteryzować funkcjonalizowany polimer za pomocą spektroskopii 1H-NMR, rozpuszczając próbkę w D2O16.</li>
</ol>
4. Synteza polimeru PAA-RGD 4
<ol>
	<li>Rozpuścić 78 mg modyfikowanego PAA alkinu 3 (1,083 mmol) w 10 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Rozpuścić 25 mg pochodnej azydku RGD 2 (0,0722 mmol) w 5 ml tetrahydrofuranu.</li>
	<li>Dodaj cały roztwór RGD do roztworu polimerowego.</li>
	<li>Dodać 2,2 mg jodku miedzi (0,0116 mmol) i 2,2 mg askorbinianu sodu (0,0111 mmol).</li>
	<li>Otrzymaną mieszaninę należy przepłukać przez noc w temperaturze 60 °C, mieszając.</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę do temperatury 25 °C.</li>
	<li>Dializuj roztwór. Rozpuścić 11,2 g chlorku sodu w 2 l wody destylowanej, a następnie dodać 0,2 ml 37% m/w HCl. Roztwór należy dializować za pomocą membrany o wartości odcięciaM w 3,5 kDa.</li>
	<li>Wykonuj dializy przez trzy dni. Codziennie zmieniaj roztwór dializacyjny na 2 l świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 0,2 ml 37% m/w HCl.</li>
	<li>Roztwór końcowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Liofilizować go w liofilizatorze zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Otrzymany produkt scharakteryzować za pomocą spektroskopii 1H-NMR, rozpuszczając próbkę w D2O16.</li>
</ol>
5. Synteza hydrożelu funkcjonalizowanego RGD
<ol>
	<li>Przygotuj PBS. Rozpuścić 645 mg soli PBS w 50 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Zmieszać 40 mg karbomeru i 10 mg funkcjonalizowanego PAA 4 w 9 ml PBS (krok 5.1), w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia (30 min).</li>
	<li>Dodać 400 mg PEG do roztworu i mieszać przez 45 minut.</li>
	<li>Przerwij mieszanie i pozwól systemowi osiąść przez 30 minut.</li>
	<li>Użyj 1 N NaOH, aby dostosować pH do 7,4.</li>
	<li>Do 5 ml otrzymanej mieszaniny dodać 25 mg proszku agarozy.</li>
	<li>Naświetlić system promieniowaniem mikrofalowym o mocy 500 W aż do wrzenia, zwykle przez czas od 30 sekund do 1 minuty, a następnie podgrzać elektromagnetycznie do temperatury 80 °C.</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę wystawioną na działanie temperatury pokojowej do momentu, gdy jej temperatura spadnie do 50 °C i dodać 5 ml PBS (krok 5.1) w celu uzyskania roztworu w stosunku objętościowym 1:1.</li>
	<li>Przygotować 12 płytek wielodołkowych zawierających stalowe cylindry o średnicy 1,1 cm.</li>
	<li>Pobrać 500 μl podwielokrotności z roztworu i umieścić je w każdym stalowym cylindrze.</li>
	<li>Pozostawić w spoczynku na 45 minut do całkowitego zżelowania systemu.</li>
	<li>Usuń butle za pomocą kleszczy ze stali nierdzewnej, aby uzyskać hydrożele.</li>
</ol>
6. Ładowanie narzędzia terapeutycznego (leku lub komórek)
<ol>
	<li>Powtórz kroki 5.1-5.7.</li>
	<li>Gdy mieszanina (już w stanie zolu) osiągnie temperaturę 37 °C, dodać 5 ml roztworu zawierającego pożądany roztwór leku lub hodowlę komórkową, w celu uzyskania końcowego układu w stosunku objętościowym 1:1.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.9-5.12, aby uzyskać sieci polimerowe z biozwiązkami fizycznie uwięzionymi w żelu.</li>
</ol>
7. Charakterystyka hydrożelu
<ol>
	<li>Analiza FT-IR
	<ol>
		<li>Po utworzeniu żelu namocz jeden ze zsyntetyzowanych hydrożeli w 2,5 ml wody destylowanej na 24 godziny.</li>
		<li>Usunąć podłoże wodne, w którym zanurzony jest hydrożel i liofilizować płynemN2.</li>
		<li>Próbkę hydrożelu zalaminować zgodnie z techniką granulek KBr.
		<ol>
			<li>Dodaj szpatułkę pełną KBr do zaprawy agatowej. Weź niewielką ilość próbki hydrożelu (około 0,1-2% ilości KBr lub tylko tyle, aby pokryć końcówkę szpatułki) i wymieszaj z proszkiem KBr.</li>
			<li>Zmiel mieszaninę, aż proszek będzie drobny i jednorodny.</li>
			<li>Użyj zestawu granulek KBr, aby uformować pelety IR. Wyciskać proszek za pomocą ręcznej prasy laboratoryjnej: przez 3 minuty przy nacisku równym 5 ton, a następnie przez 3 min przy nacisku 10 ton.</li>
			<li>Zwolnij ciśnienie, aby uzyskać końcowy granulat o jednorodnym i przezroczystym wyglądzie. Włóż osad do uchwytu na próbki IR i uruchom widmo16.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania żelowania
	<ol>
		<li>Napełnić probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml 900 μl PBS i wyrównać do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Dodać 100 μl przygotowanego roztworu polimeru do uzyskania hydrożelu i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwróć probówkę i obserwuj, czy żel przepływa po 1, 2, 5, 10 i 20 minutach. Zapisz czas, w którym żel nie płynie, jako czas żelowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in Regenerative Medicine.</a> Adv. Mater. 21 (32-33), 3307-3329 (2009).</li>
<li>Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+options+for+drug+delivery+to+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Current options for drug delivery to the spinal cord.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10 (3), 385-396 (2013).</li>
<li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell%2Fmatrix+interface+to+control+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+spinal+cord+by+transplantation+of+neural+stem+cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat. Mater. 12 (5), 458-465 (2013).</li>
<li>Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+drug+delivery+system+with+predictable+and+tunable+drug+release+and+degradation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (6), 2318-2323 (2013).</li>
<li>Rossi, F., van Griensven, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Functionalization+as+a+Powerful+Tool+to+Improve+Scaffold+Performances%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances.</a> Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2043-2051 (2014).</li>
<li>Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+peptide+functionalized+thiol-ene+hydrogels+as+culture+substrates+for+understanding+valvular+interstitial+cell+activation+and+de+novo+tissue+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition.</a> Acta Biomater. 8 (9), 3201-3209 (2012).</li>
<li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Controlled+Photocleavage+for+the+Orthogonal+and+Sequential+Release+of+Multiple+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 52 (51), 13803-13807 (2013).</li>
<li>Larrañeta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Preparation+of+Hydrogel-Forming+Microneedle+Arrays+for+Transdermal+Drug+Delivery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Mater.+Eng%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications.</a> Macromol. Mater. Eng. 300 (6), 586-595 (2015).</li>
<li>Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Hydrogel+Synthesis%3A+A+New+Method+for+Crosslinking+Polymers+in+Aqueous+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions.</a> Macromol. Rapid Comm. 33 (4), 332-336 (2012).</li>
<li>Perale, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+drug+delivery+hydrogel+system+for+spinal+cord+injury+repair+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies.</a> J. Control. Release. 159 (2), 271-280 (2012).</li>
<li>Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Library+of+Tunable+Agarose+Carbomer-Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications%3A+The+Role+of+Cross-Linkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (4), 2211-2221 (2012).</li>
<li>Frith, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+injectable+hydrogel+incorporating+mesenchymal+precursor+cells+and+pentosan+polysulphate+for+intervertebral+disc+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9430-9440 (2013).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 40 (11), (2001).</li>
<li>Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-assisted+synthesis+and+click+chemistry+as+simple+and+efficient+strategy+for+RGD+functionalized+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels.</a> Tetrahedron Lett. 55 (50), 6817-6820 (2014).</li>
<li>Ossipov, D. A., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28vinyl+alcohol%29-based+hydrogels+formed+by+%26%2334%3Bclick+chemistry%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by &#34;click chemistry&#34.</a> Macromolecules. 39 (5), 1709-1718 (2006).</li>
<li>Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+and+Amphiphilic+Polyethylene+Glycol-Based+Hydrogels+with+Tunable+Degradability+Prepared+by+%26%2334%3BClick%26%2334%3B+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by &#34;Click&#34; Chemistry.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 4012-4021 (2012).</li>
<li>Hou, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+synthetic+route+for+RGD+tripeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Prep.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">New synthetic route for RGD tripeptide.</a> Prep. Biochem. Biotechnol. 36 (3), 243-252 (2006).</li>
<li>Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Degradation+of+Agar-Carbomer+Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (1), 398-408 (2012).</li>
<li>Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+drug+delivery+using+chemoselective+functionalization+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels.</a> Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).</li>
<li>Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+Polymer+Library+for+Developing+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiac+Patches%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches.</a> Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+hydrogel-Nanoparticles+release+system+for+sustained+combination+therapies+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord.</a> Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 8 (24), 1128-1137 (2003).</li>
<li>Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+approach+to+functional+hyaluronic+acid+hydrogels+using+orthogonal+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions.</a> Chem. Commun. 46 (44), 8368-8370 (2010).</li>
<li>Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+performance+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+cell-degradable+polymer-peptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (14), 3564-3574 (2011).</li>
<li>Caron, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+three+dimensional+biomimetic+hydrogel+to+deliver+factors+secreted+by+human+mesenchymal+stem+cells+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury.</a> Biomaterials. 75, 135-147 (2016).</li>
<li>Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+spacer+arm+length+between+adhesion+ligand+and+alginate+hydrogel+on+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Polym%22%5BJournal%5D)">Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation.</a> Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).</li>
<li>Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Y+%22J.Biomed.+Eng%22">J.Biomed. Eng</a>. 32 (2), 387-392 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują konfliktu interesów i nie otrzymali żadnego wynagrodzenia w związku z przygotowaniem tego manuskryptu.

Modyfikacja postpolimeryzacji PAA z ugrupowaniami alkinowymi oraz funkcjonalizacja RGD grupą azydkową gwarantują wytworzenie stabilnego wiązania między polimerem a peptydem. Rzeczywiście, triazol służy jako sztywna jednostka łącząca atomy węgla, przyłączona do 1,4 pozycji pierścienia 1,2,3-triazolowego i nie może być rozszczepiona hydrolitycznie lub w inny sposób. Ponadto triazol jest niezwykle trudny do utlenienia i redukcji, w przeciwieństwie do innych struktur cyklicznych, takich jak benzenoidy i związane z nimi heter...

Hydrożele to trójwymiarowe sieci tworzone przez hydrofilowe polimery sieciowane, naturalne lub syntetyczne, które charakteryzują się swoistą strukturą trójwymiarową. Urządzenia te stają się coraz bardziej atrakcyjne w biomedycznych obszarach dostarczania leków, inżynierii tkankowej, nośników genów oraz inteligentnych czujników.1,2Rzeczywiście, ich wysoka zawartość wody, a także właściwości reologiczne i mechaniczne sprawiają, że są one odpowiednimi kandydatami do naśladowania mikrośrodowisk tkanek miękkich i skutecznymi narzędziami do dostarczania rozpuszczalnych w wodzie cytokin lub czynników wzrostu. Jednym z najbardziej obiecujących zastosowań jest wykorzystanie ich jako wstrzykiwalnego biomateriału przenoszącego komórki i związki bioaktywne. Hydrożele mogą poprawiać przeżywalność komórek i kontrolować losy komórek macierzystych poprzez zatrzymywanie i precyzyjne dostarczanie sygnałów regulacyjnych dla komórek macierzystych w sposób fizjologicznie istotny, co zaobserwowano w in vitro oraz w in vivo doświadczenia3,4Główną zaletą tego rozwiązania jest możliwość utrzymania wstrzykniętych komórek w obrębie strefy inokulacji (in situ), minimalizując liczbę komórek opuszczających ten obszar i przenikających do krwiobiegu, co prowadziłoby do ich migracji po całym organizmie i utraty celu terapeutycznego5Stabilność trójwymiarowych sieci hydrożelowych wynika z obecności miejsc sieciowania, tworzonych przez wiązania kowalencyjne lub siły kohezyjne pomiędzy łańcuchami polimerowymi.6.
W tym ujęciu ortogonalna chemia selektywna stosowana w odniesieniu do łańcuchów polimerowych jest wszechstronnym narzędziem pozwalającym na poprawę właściwości hydrożeli7. W rzeczywistości modyfikacja polimerów odpowiednimi grupami chemicznymi może pomóc w zapewnieniu właściwych cech chemicznych, fizycznych i mechanicznych, co zwiększa żywotność komórek oraz ich wykorzystanie w formowaniu tkanek. Podobnie, wśród technik wprowadzania komórek lub czynników wzrostu do macierzy żelowej, zastosowanie peptydu RGD pozwala na poprawę adhezji i przeżywalności komórek. RGD to tripeptyd składający się z argininy, glicyny i kwasu asparaginowego, który jest zdecydowanie najskuteczniejszym i najczęściej stosowanym tripeptydem ze względu na zdolność do oddziaływania z więcej niż jednym receptorem adhezyjnym komórek oraz jego biologiczny wpływ na zakotwiczenie, zachowanie i przeżywalność komórek8,9. W niniejszej pracy badana jest synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD w celu zaprojektowania sieci charakteryzujących się wystarczającymi właściwościami biochemicznymi dla zapewnienia sprzyjającego mikrośrodowiska komórkowego.
Zastosowanie promieniowania mikrofalowego w syntezie hydrożeli oferuje prostą procedurę minimalizacji reakcji ubocznych oraz pozwala na uzyskanie wyższych szybkości reakcji i wydajności w krótszym czasie w porównaniu do konwencjonalnych procesów termicznych10. Metoda ta nie wymaga etapów oczyszczania i pozwala na otrzymanie sterylnych hydrożeli dzięki oddziaływaniom polimerów oraz brakowi rozpuszczalników organicznych w układzie reakcyjnym11. Zapewnia to zatem wysoki procent RGD powiązanych z siecią polimerową, ponieważ nie są wymagane żadne modyfikacje grup chemicznych polimeru uczestniczących w tworzeniu żelu. Grupy karboksylowe, pochodzące z PAA i karbomeru, oraz grupy hydroksylowe, pochodzące z PEG i agarozy, tworzą trójwymiarową strukturę hydrożelu w wyniku reakcji polikondensacji. Wspomniane polimery są wykorzystywane do syntezy hydrożeli w terapiach naprawczych urazów rdzenia kręgowego12. Urządzenia te, jak opisano w poprzednich pracach13,14, wykazują wysoką biokompatybilność, a także właściwości mechaniczne i fizykochemiczne zbliżone do wielu tkanek żywych oraz naturę tiksotropową. Ponadto pozostają one zlokalizowane in situ, w miejscu wstrzyknięcia.
W niniejszej pracy grupy karboksylowe PAA zostają zmodyfikowane grupą alkinową (Rysunek 1), a związek RGD-azydowy jest syntetyzowany z wykorzystaniem reaktywności grupy końcowej -NH2 tripeptydu z przygotowanym związkiem chemicznym o strukturze (CH2)n-N3 (Rysunek 2). Następnie zmodyfikowane PAA reaguje z pochodną RGD-azydową poprzez reakcję klik CuAAC15-17 (Rysunek 3). Zastosowanie katalizatora miedzi(I) prowadzi do znaczącej poprawy zarówno szybkości reakcji, jak i regioselektywności. Reakcja CuAAC jest powszechnie stosowana w syntezie organicznej oraz w nauce o polimerach. Łączy ona wysoką wydajność i wysoką tolerancję grup funkcyjnych i nie jest wpływana przez zastosowanie rozpuszczalników organicznych. Wysoka selektywność, krótki czas reakcji i prosta procedura oczyszczania pozwalają na otrzymywanie polimerów gwiazd 모양, kopolimerów blokowych lub łańcuchów z przyszczepionymi pożądanymi fragmentami18. Ta strategia klikowa umożliwia modyfikację polimerów po polimeryzacji w celu dostosowania właściwości fizykochemicznych do końcowego zastosowania biochemicznego. Warunki eksperymentalne CuAAC są łatwo reprodukowalne (reakcja jest niewrażliwa na wodę, natomiast utlenianie miedzi może zachodzić w minimalnym stopniu), a natura powstałego triazolu zapewnia stabilność produktu. Zastosowanie miedzi może być uznane za punkt krytyczny ze względu na jej potencjalny toksyczny wpływ na komórki i biologiczne mikrośrodowisko, jednak jako metoda oczyszczania stosuje się dializę, aby umożliwić całkowite usunięcie pozostałości katalitycznych. Na koniec zmodyfikowane RGD-PAA jest wykorzystywane w syntezie hydrożelu (Rysunek 4), a następnie badane są właściwości fizykochemiczne otrzymanych sieci w celu sprawdzenia potencjalnej funkcjonalności tych systemów jako nośników komórek lub leków.
<img alt="Schemat reakcji modyfikacji polimeru; PAA i propargylamina tworzą PAA-alkin; metoda EDC, HOBt." src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Synteza PAA modyfikowanego alkyną. Schemat funkcjonalizacji PAA grupą alkynową; „n” oznacza monomery z grupą karboksylową reagujące z propargylaminą. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Reakcja syntezy chemicznej, chlorek 4-azidobutanoylu z RGD, tworzący pochodną RGD-azydkową; schemat wzoru." src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Synteza RGD-azydku. Synteza pochodnej RGD-azydkowej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Proces chemii klikalnej RGD; azyd RGD, PAA-alkin; schemat; reakcja azydowo-alkinowa katalizowana miedzią." src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reakcja klikalna. Schemat reakcji klikalnej pomiędzy pochodną azydową RGD a PAA-alkinem. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przygotowania hydrożelu z Carbomer 974P, PAA-RGD, PEG, PBS, agaroza, proces ogrzewania do 80°C." src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Synteza hydrożelu. Procedura syntezy hydrożelu funkcjonalizowanego RGD. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Roztwór poli(kwasu akrylowego) średni Mw ~100 000, 35% wag. w H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) 2,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomeer 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Invitrogen Corp.</td><td>16500-500</td><td>Peptyd UltraPure Agaroza</td></tr><tr><td>RGD</td><td>abcam</td><td>ab142698</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-azydobutanowy</td><td>Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>Chlorek szczawilu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>Chlorowodorek propargiloaminy 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>Jodek miedzi(I)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoria Widma</td> <td>Membran Dializy</td>, Inc.<td>132725</td><td>Spectra/Por 3 Membrana dializacyjna&nbsp; Standardowe rury RC MWCO: 3,5 kD</td></tr></tbody></table>

synteza hydrożeli funkcjonalizowanych rgd jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Wykorzystanie polimerów jako biomateriałów przyniosło znaczące korzyści w zastosowaniach terapeutycznych. W szczególności możliwość modyfikacji i funkcjonalizacji łańcuchów polimerowych związkami, które są w stanie poprawić biokompatybilność, właściwości mechaniczne lub żywotność komórek, pozwala na projektowanie nowych materiałów, aby sprostać nowym wyzwaniom w dziedzinie biomedycyny. Dzięki strategiom funkcjonalizacji polimerów, chemia kliknięć jest potężnym narzędziem do poprawy kompatybilności komórek i właściwości dostarczania leków przez urządzenia polimerowe. Podobnie, fundamentalna potrzeba stosowania sterylnych narzędzi w biomedycynie w celu uniknięcia potencjalnych niepożądanych skutków ubocznych, takich jak toksyczność lub zanieczyszczenie środowiska biologicznego, powoduje rosnące zainteresowanie strategią wspomaganą mikrofalami.
Połączenie chemii kliknięć i metody wspomaganej mikrofalami jest odpowiednie do produkcji biokompatybilnych hydrożeli o pożądanych funkcjach i ulepszonych parametrach w zastosowaniach biomedycznych. Praca ta ma na celu syntezę hydrożeli funkcjonalizowanych RGD. RGD (kwas arginyloglicylasparaginowy) to tripeptyd, który może naśladować białka adhezyjne komórek i wiązać się z receptorami na powierzchni komórki, tworząc przyjazne mikrośrodowisko dla komórek w sieci polimerowej 3D hydrożeli. Funkcjonalizacja RGD zachodzi poprzez cykloaddycję 1,3-dipolarną Huisgena. Niektóre grupy karboksylowe PAA są modyfikowane ugrupowaniem alkinowym, podczas gdy RGD jest funkcjonalizowany kwasem azydologicznym jako końcową resztą sekwencji peptydowej. Wreszcie, oba produkty są stosowane w katalizowanej miedzią reakcji kliknięcia w celu trwałego połączenia peptydu z PAA. Ten zmodyfikowany polimer jest używany z karbomerem, agarozą i glikolem polietylenowym (PEG) do syntezy matrycy hydrożelowej. Struktura 3D powstaje w wyniku reakcji estryfikacji obejmującej grupy karboksylowe z PAA oraz grupy karbomerowe i hydroksylowe z agarozy i PEG poprzez polikondensację wspomaganą mikrofalami. Wydajność mechanizmu żelowania zapewnia wysoki stopień funkcjonalności RGD. Ponadto procedura ładowania związków terapeutycznych lub narzędzi biologicznych w tej sfunkcjonalizowanej sieci jest bardzo prosta i powtarzalna.

Pochodna alkiniowa PAA jest efektywnie syntetyzowana z kwasu poliakrylowego i propargylaminy, co przedstawiono na Rysunku 1, gdzie n oznacza monomery, których grupy karboksylowe reagują z aminą. Tożsamość produktu potwierdzono za pomocą spektroskopii 1H-NMR. Rysunek 5 przedstawia widmo 1H-NMR PAA zmodyfikowanego wiązaniem potrójnym.
<img alt="Widmo NMR, struktura chemiczna, piki spektralne, analiz...

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest bardzo prosta synteza hydrożeli do zastosowań w inżynierii tkankowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak możliwość utrzymania wysokiej żywotności komórek w trójwymiarowych systemach hodowli komórkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu szybkiej reakcji możemy łatwo modyfikować systemy hydrożelowe, aby poprawić ich zdolność do utrzymania żywotności komórek.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię urazów rdzenia kręgowego, ponieważ komórki umieszczone w rusztowaniu mogą odbudować uszkodzoną tkankę. Metoda ta może dostarczyć istotnych informacji na temat terapii komórkowych w ramach medycyny regeneracyjnej oraz ich zastosowania w wielu metodologiach. Może ona również zostać zastosowana w kilku innych układach, takich jak kości, serce i chrząstka.Aby zsyntetyzować pochodną RGD-azydku, rozpuść 50 mg RGD w jednym mililitrze jednomolarnego wodorotlenku sodu. Następnie rozpuść 24 mg chlorku 4-azydobutanoylu w dwóch mililitrach tetrahydrofuranu. Dodaj powoli, kroplami, cały roztwór RGD do roztworu chlorku 4-azydobutanoylu w temperaturze 0 °C.Pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej i mieszać przez noc. Dodać 1 mL 1 M HCl. Odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wirówki rotacyjnej.Scharakteryzuj otrzymany produkt za pomocą spektroskopii protonowego rezonansu magnetycznego jądra, rozpuszczając próbkę w utlenku deuteru lub D2O. Aby przeprowadzić modyfikację alkiniową PAA, rozpuść 200 mg 35% wagowo roztworu PAA w 15 ml wody destylowanej. Dodaj 15,4 mg chlorowodorku propargilaminy.Następnie rozpuść 42,8 mg HOBt w 14 ml roztworu acetonitrylu i wody destylowanej w stosunku jeden do jednego, podgrzewając do 50 °C. Dodaj cały roztwór HOBt do roztworu PAA w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 53,6 mg EDC do mieszaniny reakcyjnej.Użyj jednomolarnego HCL, aby dostosować pH do 5,5, i mieszaj układ reakcyjny przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść 11,2 g chlorku sodu w dwóch litrach wody destylowanej. Potem dodaj 200 µL 37% wagowo HCL.Przeprowadź dializę roztworu, używając membrany o progu odcięcia masy cząsteczkowej 3.5 kilodaltons. Proces dializy prowadź przez trzy dni. Codziennie wymieniaj roztwór do dializy na dwa litry świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 200 microliters 37%weight by weight HCL.Przechowywać końcowy roztwór w temperaturze -80°C. Scharakteryzować funkcjonalizowany polimer za pomocą spektroskopii protonowego rezonansu magnetycznego jądra, rozpuszczając próbkę w D2O. Aby zsyntezować polimer PAA-RGD, rozpuścić 78 mg zmodyfikowanego alkinem PAA w 10 ml wody destylowanej.Następnie rozpuścić 25 mg pochodnej RGD-azydy w pięciu mililitrach tetrahydrofuranu. Dodać cały roztwór RGD do roztworu polimeru. Następnie dodać 2,2 mg jodku miedzi.Oraz 2,2 mg askorbinianu sodu. Gotować mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez noc w temperaturze 60 °C przy ciągłym mieszaniu. Schłodzić mieszaninę do 25 °C.Aby przeprowadzić dializę roztworu, rozpuścić 11,2 g chlorku sodu w dwóch litrach wody destylowanej i dodać 200 µL 37% (w/w) HCl. Dializę prowadzić przez trzy dni. Roztwór do dializy wymieniać codziennie na dwa litry świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 200 µL 37% (w/w) HCl.Następnie umieść końcowy roztwór w temperaturze -80 °C. Przeprowadź charakterystykę i przechowuj otrzymany polimer PAA-RGD w ten sam sposób, w jaki postąpiono z jego składnikami. W temperaturze pokojowej zmieszaj 40 mg karbomeru i 10 mg funkcjonalizowanego PAA w 9 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym aż do całkowitego rozpuszczenia.Do roztworu dodać 400 mg PEG i mieszać przez 45 minut. Przerwać mieszanie i pozostawić układ do ustabilizowania na 30 minut. Następnie użyć 1 M wodorotlenku sodu, aby dostosować pH do 7.4.Do pięciu mililitrów otrzymanej mieszaniny dodać 25 miligramów proszku agarozy. Naświetlać układ promieniowaniem mikrofalowym o mocy 500 watów przez okres od 30 sekund do jednej minuty, aż do zagotowania. Następnie podgrzać roztwór elektromagnetycznie do 80 stopni Celsjusza.Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej, aż jej temperatura spadnie do 50 stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mililitrów PBS, aby uzyskać roztwór w stosunku objętościowym jeden do jednego. Przygotuj 12-dołkową płytkę zawierającą stalowe cylindry o średnicy 1,1 centymetra.Pobierz 500 µL aliquotów z roztworu i umieść je w każdym stalowym cylindrze. Pozostaw płytkę w spoczynku na 45 minut, aż do całkowitej żelowania systemu. Wyjmij cylindry za pomocą szczypiec ze stali nierdzewnej, aby uzyskać hydrożele.Zapoznaj się z protokołem tekstowym dotyczącym charakterystyki właściwości fizykochemicznych hydrożeli funkcjonalizowanych RGD. Carbomer 974P, PAA-RGD i PEG, wraz z agarozą, biorą udział w statystycznej losowej polikondensacji po naświetlaniu mikrofalowym. Grupy hydroksylowe zawarte w PEG i agarozie reagują z grupami karboksylowymi obecnymi w Carbomer 947P i PAA-RGD, tworząc hydrożele ACPEG-RGD.Biorąc pod uwagę właściwości reologiczne, stwierdzono, że moduł zachowawczy jest o około rząd wielkości wyższy niż moduł strat, co wskazuje na materiał bardziej sprężysty niż lepki. Co więcej, wyraźnie widać, że przy niskich wartościach odkształcenia zachowanie hydrożelu jest zdominowane przez moduł sprężystości. Skaningowa mikroskopia elektronowa przedstawia morfologię próbki hydrożelu funkcjonalizowanego RGD oraz hydrożelu bez funkcjonalizacji.Oba hydrożele wykazały, że posiadają silnie splątaną strukturę połączonych porów, przy czym niektóre większe pory zawierają mniejsze pory, a na ściankach porów widoczne są sieci włókniste. Podobne właściwości wskazują, że obecność RGD nie zmienia sieci polimerowej. Po tym opracowaniu technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie inżynierii tkankowej w celu zbadania stabilności tych systemów hodowli komórkowych w kilku innych jednostkach chorobowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat funkcjonalizacji hydrożeli w celu poprawy ich zdolności do utrzymania żywotności komórek macierzystych.

the-synthesis-rgd-functionalized-hydrogels-as-tool-for-therapeutic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Obecne modele hodowli dwuwarstwowych nie pozwalają na funkcjonalne badania in vitro, które naśladują mikrośrodowiska in vivo. Wykorzystując glikol polietylenowy i metodę szablonowania tlenku, protokół ten opisuje rozwój ultracienkiej biomimetycznej błony podstawnej o regulowanej sztywności, porowatości i składzie biochemicznym, która ściśle naśladuje matryce zewnątrzkomórkowe in vivo.

Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

Ten protokół opisuje syntezę i formułowanie wstrzykiwalnych, supramolekularnych biomateriałów hydrożelowych polimerowo-nanocząsteczkowych (PNP). Przedstawiono zastosowania tych materiałów do dostarczania leków, stabilizacji biofarmaceutycznej oraz enkapsulacji i dostarczania komórek.

Supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe do wstrzykiwań do zastosowań w dostarczaniu komórek i leków

Protokół przedstawiony tutaj pokazuje syntezę silnego kleju hydrożelowego żelu o-nitrozobenzaldehydu (żelatyna-NB). Żelatyna-NB ma szybką i wydajną zdolność adhezji tkanek, co może tworzyć silną barierę fizyczną chroniącą powierzchnie ran, dlatego oczekuje się, że znajdzie zastosowanie w dziedzinie biotechnologii naprawy urazów.

Synteza mocnego kleju hydrożelowego, żelatyny O-nitrozobenzaldehydu

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do osadzania bezkomórkowych reakcji syntezy białek w makroskalowych matrycach hydrożelowych bez potrzeby stosowania zewnętrznej fazy płynnej.

Metody osadzania bezkomórkowych reakcji syntezy białek w hydrożelach w makroskali

Poznaj metodę syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD przy użyciu katalizowanej miedzią cykloaddycji alkin-azydowej i polikondensacji wspomaganej mikrofalami. Technika ta poprawia żywotność komórek w kulturach 3D i ma zastosowanie w terapii urazów rdzenia kręgowego oraz inżynierii tkankowej.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Przeglądaj więcej filmów