Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie częstości występowania komórek macierzystych układu nerwowego w danej populacji poprzez analizę tworzenia i różnicowania neurosfer w warunkach klonalnych. Metoda ta ma kluczowe zastosowania w badaniach nad komórkami macierzystymi układu nerwowego, takich jak ocena potencjalnych markerów tych komórek, ich oczyszczanie oraz odróżnianie komórek macierzystych od progenitorów neuronalnych. Zaletą tej metody jest czas jej wykonania wynoszący 13 dni, co jest okresem krótszym niż w przypadku obecnie stosowanych metod ilościowego oznaczania częstości występowania komórek macierzystych układu nerwowego, a także fakt, że procedura jest przeprowadzana w warunkach klonalnych.

Aby rozpocząć tę procedurę, pierwszego dnia należy przygotować pożywkę wzrostową dla NSC, łącząc pożywkę DMEM F12 z B27, EGF, BFGF oraz penicyliną i streptomycyną. Następnie należy dysocjować neurosfery mysie E14.5 w 1 mL pożywki wzrostowej NSC i 1 mL 0,05 N wodorotlenku sodu przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Co jakiś czas należy pipetować komórki w górę i w dół, aby utrzymać je w zawiesinie, a następnie dodać 1 mL 0,05 N kwasu solnego w celu zneutralizowania alkaliów.

Następnie przeprowadź zliczanie komórek z wykorzystaniem barwienia trypan błękitem i hemocytometru. Po tym etapie wysiej pojedyncze komórki neurosfer mysich E14.5 w gęstości 50 komórek na mililitr lub niższej w 100 µL pożywki wzrostowej dla NSC w płytce 96-dołkowej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez jeden tydzień, aby wygenerować klonalne neurosfery.

Aby hodować neurosfery do uzyskania medium warunkującego, w trzecim dniu zdysocjować neurosfery mysie E14.5 i wysiać pojedyncze komórki w gęstości 20 000 komórek na ml w 10 ml medium wzrostowego NSC w szalce hodowlanej o średnicy 10 cm. Następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez pięć dni w celu wygenerowania masowej hodowli neurosfer. W ósmym dniu przygotować roztwór powlekający, mieszając 700 µl 0,01% poli-L-lizyny, 70 µl lamininy o stężeniu 1 mg/ml oraz 6 230 µl PBS.

Następnie pokryj szalkę hodowlaną o średnicy 10 cm siedmioma mililitrami roztworu polilizyny i lamininy przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, przenieś wszystkie hodowane neurosfery do 15 ml stożkowej probówki wirówkowej. Wiruj neurosfery z przyspieszeniem 171 ×g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie całkowicie usuń nadsącz.

Następnie przygotować pożywkę do różnicowania NSC, łącząc pożywkę DMEM F12 z B27 i FBS. Do neurosfer dodać 10 ml pożywki do różnicowania NSC i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby resuspenderować neurosfery. Następnie odessać poli-L-lizynę i lamininę z 10-centymetrowej szalki hodowlanej i wypłukać raz 10 ml PBS.

Przenieś wszystkie neurosfery do 10 centymetrowej szalki hodowlanej pokrytej poli-L-lizyną i lamininą, a następnie inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aby neurosfery przywarły do szalki. Ósmego dnia policz pod mikroskopem liczbę neurosfer powstałych w każdej studience, a następnie pokryj każdą studienkę szkiełka podstawowego z 50 studzienkami 10 mikrolitrami roztworu powlekającego z poli-L-lizyną i lamininą i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj trzy 50 mililitrowe stożkowe probówki do wirowania, z których każda powinna zawierać 30 mililitrów PBS.

Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij pokrywkę szkiełkową z 50 komorkami, zanurz ją kolejno w pierwszej, drugiej, a następnie trzeciej probówce z PBS, aby wypłukać roztwór powlekający. Następnie odessaj pozostały płyn z komorek pokrywki szkiełkowej. Ostrożnie przenieś całe pożywkę oraz neurosfery z każdej studni płytki 96-dołkowej do jednej 10 centymetrowej szalki hodowlanej.

Aby zapewnić pobranie tylko jednej neurosfery za każdym razem, ustaw kolumnę pipety na 2 µL; pod mikroskopem pobierz przykładową neurosferę, używając mikropipety P10 z założoną końcówką 10 µL. Neurosfery mogą być pobierane pod mikroskopem, w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub na blacie laboratoryjnym. Następnie przenieś neurosferę na środek dołka powlekanej szkiełka nakrywkowe z 50 komorami.

Powtarzać procedury do momentu, aż w każdej studni szkiełka podstawowego z komorami znajdzie się neurosfera. Następnie do każdej studni szkiełka podstawowego z komorami dodać 10 µL medium do różnicowania NSC. Umieścić szkiełko podstawowe z komorami w 10 cm szalce hodowlanej.

W szalce o średnicy 10 cm można umieścić do dwóch szkiełek podstawowych z komorami. Wzdłuż krawędzi szalki należy nalać PBS, aby zapobiec wysychaniu pożywki do różnicowania NSC. Szkiełko z komorami należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.

Dziewiątego dnia przenieść medium warunkujące z kultury neurosfer do 15 mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Za pomocą 20 mililitrowej sterylnej strzykawki przepuścić medium warunkujące przez filtr 0,2 mikrometra, aby usunąć komórki lub zanieczyszczenia. Następnie przenieść przefiltrowane medium warunkujące z powrotem do 10 centymetrowej szalki hodowlanej.

Następnie za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe z komorą na przygotowanym medium w pozycji odwróconej, tak aby próbki neurosfer były skierowane w dół. Inkubuj szkiełko nakrywkowe z komorą przez trzy dni w temperaturze 37°C i 5% CO2. W 12. dniu ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z komorą z 10 cm szalki hodowlanej, używając sterylnej pęsety.

Ostrożnie zanurz szkiełko nakrywkowe w PBS, aby wypłukać pożywkę kondycjonowaną. Następnie zdejmij uszczelkę silikonową ze szkiełka nakrywkiego; wykonaj tę czynność delikatnie i powoli, aby uniknąć pęknięcia szkiełka. Zwróć uwagę, po której stronie przylegają zróżnicowane neurosfery.

Następnie nanieś pipetą 1 mm 4% paraformaldehydu na kawałek folii parafinowej wyciętej do rozmiaru szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej tak, aby neurosfery były skierowane w dół i miały kontakt z paraformaldehydem, a następnie utrwal neurosfery przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W tym przypadku pojedyncze neurosfery zostały wyselekcjonowane i poddane różnicowaniu w 50-dołkowym szkiełku nakrywkowym z komorami przez trzy dni.

Jest to reprezentatywny obraz tripotentnej neurosfery barwionej dapi oraz immunobarwionej na GFAP, TUJ1 i O4. Obraz ten pokazuje nałożenie sygnałów dapi, GFAP, TUJ1 oraz O4. Niniejszy protokół służy do oceny zdolności LeX, znanego markera NSC, do wzbogacania populacji NSC. Wykres ten przedstawia procent unipotentnych, bipotentnych i tripotentnych neurosfer wygenerowanych przez komórki LeX-dodatnie i LeX-ujemne. Komórki LeX-dodatnie generują znacznie więcej neurosfer tripotentnych niż komórki LeX-ujemne.

Tabela ta pokazuje, że częstotliwość NSC komórek LeX dodatnich i LeX ujemnych obliczono jako iloczyn NFU i procentu neurosfer tripotencjalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, w jaki sposób można hodować i różnicować neurosfery w warunkach klonalnych w celu wyliczenia częstotliwości neuralnych komórek macierzystych. Podczas wykonywania tej metody ważne jest stosowanie świeżo przygotowanych mediów wzrostowych i różnicujących oraz świeżo przygotowanego roztworu powlekającego, aby zapewnić optymalne warunki wzrostu i różnicowania neurosfer.

Po opanowaniu techniki metoda ta może być przeprowadzona w ciągu 13 dni, co stanowi krótszy czas w porównaniu z obecnymi metodami szacowania częstotliwości występowania neuralnych komórek macierzystych. Metodę tę można stosować wraz z obecnymi metodami, takimi jak test tworzenia kolonii neuralnych, w celu wzbogacenia populacji o nowe komórki macierzyste i zidentyfikowania definitywnego markera neuralnych komórek macierzystych.