Name: Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę otrzymywania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej. Technika ta umożliwia wyznaczanie struktury białek w natywnym środowisku lipidowym przy minimalnym zużyciu próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health R01 GM108635 i U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award oraz nagrodę NSF STC 1231306. Dziękujemy A. Walkerowi za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

1. Roztwory filtrujące i lipidy
Uwaga: Wszystkie odczynniki i narzędzia używane w tym protokole powinny być tak czyste, jak to tylko możliwe, aby uniknąć wprowadzania zanieczyszczeń cząstkami stałymi do próbek, które mogą zatkać wtryskiwacz LCP.
<ol>
	<li>Przefiltruj wszystkie roztwory strącające i stopione lipidy przez filtry wirujące 5 μm. Dokładnie umyć strzykawki i użyć sprężonego powietrza do wyschnięcia. Opcjonalnie należy użyć przenośnego okapu do pomieszczenia czystego, aby zapobiec zatrzymywaniu cząstek kurzu lub włókien podczas procedur przygotowywania próbki.</li>
</ol>
2. Rekonstrukcja MP w LCP
Uwaga: Wybór najlepszego lipidu gospodarza LCP do krystalizacji zależy od docelowego MP i jest zazwyczaj identyfikowany podczas prób przesiewowych krystalizacji lipidów gospodarza14. Monoacyloglicerole (MAG) reprezentują najpowszechniejszą klasę lipidów stosowanych do krystalizacji LCP15. Protokoły opierają się na użyciu 9,9 MAG (monooleiny) jako lipidu gospodarza, ponieważ jest to najbardziej udany lipid dotej pory w krystalizacji mezo. 9.9 MAG może być zastąpiony innymi lipidami gospodarza LCP lub mieszaninami lipidów po uwzględnieniu różnic w ich zachowaniu fazowym. Na przykład w przypadku GPCR monooleina jest zwykle domieszkowana cholesterolem w celu stabilizacji receptora. Tutaj użyj mieszaniny 9:1 (w/w) 9,9 MAG:cholesterol jako lipidu gospodarza.
<ol>
	<li>Wymieszać docelowy MP, który jest oczyszczony w roztworze miceli detergentu, z odpowiednim lipidem gospodarza LCP za pomocą dwóch strzykawek (#1 i #2) i łącznika, jak opisano wcześniej13.</li>
	<li>Krótko mówiąc, załaduj strzykawkę #1 stopionym lipidem, a strzykawkę #2 roztworem MP. Stosować stosunek między lipidem a wodnym roztworem MP odpowiadający poziomowi, który jest tuż poniżej maksymalnej zdolności hydratacji odpowiedniego lipidu gospodarza LCP, np. roztwór lipidowy 3:2 v/v lipid/MP dla 9,9 MAG, roztwór lipidowy 1:1 v/v dla większości innych krótkołańcuchowych MAG (7,9 MAG, 9,7 MANG itd.).</li>
	<li>Połączyć strzykawki przez łącznik strzykawki i rozpocząć mieszanie substancji, naciskając tłoki, aby przesuwać mieszaninę tam i z powrotem między strzykawkami, aż próbka stanie się jednorodna i przezroczysta. Przygotować około 50 μl próbki LCP do pobrania pełnego zestawu danych za pomocą LCP-SFX. Ostateczna objętość próbki zwykle zwiększa się około dwukrotnie (do ~100 μl) po konsolidacji próbki i miareczkowaniu lipidów (sekcja 5).</li>
</ol>
3. Konfiguracja krystalizacji w strzykawkach
<ol>
	<li>Po utworzeniu przezroczystego i jednorodnego LCP przenieść całą próbkę do strzykawki #2. Odłączyć strzykawkę #1, trzymając łącznik połączony ze strzykawką #2.</li>
	<li>Podłączyć wyjmowaną igłę (skala 26s) do innej czystej strzykawki o pojemności 100 μl (strzykawka #3) i zassać do niej około 70 μl roztworu strącającego. Skład roztworu strącającego, który powoduje tworzenie się mikrokryształów o dużej gęstości, jest unikalny dla każdego docelowego MP i powinien zostać określony przed przystąpieniem do tych protokołów. W tym przypadku należy użyć zoptymalizowanej kompozycji roztworu strącającego, która daje prysznice mikrokryształów receptora A2A (40 mM tiocyjanian sodu, 100 mM cytrynian sodu pH 5, 26-28% PEG400).</li>
	<li>Odłączyć igłę od strzykawki #3, trzymając teflonową skuwkę wewnątrz strzykawki.</li>
	<li>Połączyć strzykawki #2 i #3 przez łącznik, upewniając się, że teflonowe skuwki są prawidłowo założone w obu strzykawkach. Ostrożnie mocno przykręć łącznik na miejsce.</li>
	<li>Ustawić sprzężone strzykawki pionowo ze strzykawką #2 na spodzie i wstrzyknąć naładowaną białkiem próbkę LCP ze strzykawki #2 do strzykawki #3 powoli i równomiernie, aż sznurek LCP dotknie tłoka strzykawki #3. Objętość wstrzykniętego LCP będzie wynosić około 1/10 początkowej objętości osadu w strzykawce #3 (~7 μl). Sprawdzić objętość za pomocą odczytu skali na obu strzykawkach (oba tłoki powinny przesunąć się o około 7 μl).</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę #2. Łącznik jest teraz podłączony tylko do strzykawki #3, która zawiera próbkę zanurzoną w roztworze strącającym.</li>
	<li>Użyj Parafilm, aby całkowicie uszczelnić strzykawkę #3, w tym interfejs strzykawki z tłokiem, otwierający koniec łącznika i nakrętkę igły. Niepełne uszczelnienie na tym etapie może spowodować zmianę warunków wytrącania i odwodnienie próbki.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3-3.7, aby ustawić krystalizację w 6 dodatkowych strzykawkach (#4-#9), wykorzystując łącznie ~50 μl próbki LCP (~7 μl LCP na każdą strzykawkę).</li>
	<li>Szczelnie zamknięte strzykawki należy przechowywać w plastikowej, zamykanej torbie z jedną lub dwiema bezbłonnikowymi chusteczkami czyszczącymi wstępnie nasączonymi wodą w celu ochrony przed odwodnieniem próbki. Szczelnie zamknąć worek i przechowywać strzykawki w inkubatorze o temperaturze 20 °C podczas wzrostu kryształów.</li>
</ol>
4. Wykrywanie kryształów
<ol>
	<li>Wyjmij strzykawki z inkubatora, aby zobrazować próbki LCP bezpośrednio wewnątrz strzykawek (#3-#9) co 12-24 godziny pod mikroskopem stereoskopowym ze światłem spolaryzowanym krzyżowo. Zidentyfikuj kryształy jako ciasno upakowane błyszczące cząstki lub, w przypadku mniejszych kryształów, jako jednolitą poświatę z włókna LCP.</li>
	<li>Zamknięte strzykawki należy umieścić z powrotem w worku i przechowywać w temperaturze 20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
5. Konsolidacja i miareczkowanie próbek za pomocą 7,9 MAG
Uwaga: Opisany tutaj etap miareczkowania lipidów służy dwóm celom: a) absorpcji nadmiaru roztworu strącającego i b) zapobieganiu zamarzaniu lipidów po wstrzyknięciu do wiązki XFEL. Gdy próbka LCP składająca się z 9,9 MAG jest wstrzykiwana do komory próżniowej w celu zebrania danych, intensywne parowanie może schłodzić próbkę do temperatur poniżej temperatury równowagi przemiany fazowej (~18 °C), przekształcając części próbki w blaszkowatą fazę krystaliczną (Lc). Te plamy fazy Lc, po uderzeniu wiązką, wytwarzają intensywne pierścienie dyfrakcyjne proszku, które mogą uszkodzić czuły detektor6, taki jak detektor pikselowy Cornell-SLAC (CSPAD). Miareczkowanie próbki 9,9 MAG z lipidem o krótszym łańcuchu (9,7 MAG lub 7,9 MAG) łagodzi ten problem, ponieważ takie mieszaniny mają niższe temperatury przemiany fazowej. W tym miejscu opisujemy miareczkowanie LCP składającego się z 9,9 MAG z 7,9 MAG. W przypadku stosowania krótszych łańcuchów MAG (9,7 MAG, 7,9 MANG itd.) lub gdy dane krystalografii szeregowej są zbierane pod ciśnieniem otoczenia, miareczkowanie w kroku 5.11 jest nadal wymagane, ale można je przeprowadzić przy użyciu oryginalnego lipidu gospodarza LCP użytego do krystalizacji.
<ol>
	<li>Na około 1 godzinę przed rozpoczęciem zbierania danych należy wyjąć strzykawki z próbkami z inkubatora w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Wybierz 2-4 strzykawki do konsolidacji próbki w oparciu o podobny wygląd kryształów i podobieństwo warunków krystalizacji.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć uszczelkę Parafilm z wybranych strzykawek.</li>
	<li>Wyjąć łącznik strzykawki i przymocować czystą wyjmowaną igłę (rozmiar 26s) do pierwszej wybranej strzykawki. Delikatnie i powoli popchnąć tłok do przodu, aby wycisnąć osad przez igłę do probówki do mikrowirówki. Na tym etapie należy zachować ostrożność, ponieważ zastosowanie wysokiego nacisku na tłok na tym etapie może spowodować wyrzucenie części krystalicznego LCP wraz z roztworem strącającym, prowadząc do częściowej lub całkowitej utraty próbki.</li>
	<li>Zatrzymać tłok, gdy większość środka strącającego została usunięta, a LCP nagromadził się przy wejściu igły.</li>
	<li>Powtórzyć krok 5.4-5.5 z innymi wybranymi strzykawkami.</li>
	<li>Aby skonsolidować otrzymane próbki LCP, połącz ze sobą dwie strzykawki za pomocą czystego łącznika.</li>
	<li>Wcisnąć tłok na jednej strzykawce, aby przenieść całą próbkę z jednej strzykawki do drugiej.</li>
	<li>Odłączyć pustą strzykawkę.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.7-5.9, aby skonsolidować cały krystaliczny materiał LCP z dwóch do czterech wstępnie wybranych strzykawek w jedną strzykawkę. Usuń jak najwięcej środka strącającego.</li>
	<li>Do pustej strzykawki dodać ~5 μl 7,9 MAG lub oryginalnego lipidu gospodarza MAG o krótszym łańcuchu. Połączyć tę strzykawkę ze strzykawką ze skonsolidowaną próbką za pomocą łącznika strzykawki i wymieszać, alternatywnie wciskając tłoki strzykawki. Powtarzać, aż cały pozostały roztwór zostanie wchłonięty i utworzy się jednorodny i przezroczysty LCP. Ostateczna ilość LCP po miareczkowaniu może wahać się od 20 do 35 μl w zależności od objętości nadmiaru środka strącającego i jego składu.</li>
	<li>Przenieść całą wymieszaną próbkę LCP do jednej strzykawki i odłączyć pustą strzykawkę.</li>
</ol>
6. Charakterystyka mikrokryształów
<ol>
	<li>Przymocuj igłę do wstrzykiwania LCP (końcówka 3, rozmiar 22, długość jednego cala) do strzykawki ze skonsolidowaną próbką.</li>
	<li>Ostrożnie wysunąć ~1 μl próbki LCP na szkiełko podstawowe i przykryć ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby ułożyć próbkę w warstwie.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia próbki LCP pod mikroskopem stereoskopowym w najwyższym możliwym powiększeniu (zwykle 100x) przy użyciu oświetlenia jasnego pola i polaryzatorów krzyżowych. Jeśli to możliwe, należy wykonać dodatkowe zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego UV i aparatu SONICC (Second Order Nonlinear Imaging of Chiral Crystals)17, aby potwierdzić obecność mikrokryształów białkowych w próbce.</li>
	<li>Oszacuj rozmiar i gęstość kryształów10. Idealna gęstość kryształów do eksperymentu zbierania danych będzie zależeć od wielkości kryształu, średnicy wiązki promieniowania rentgenowskiego i średnicy strumienia LCP i powinna skutkować współczynnikiem trafień kryształów na poziomie około 10-40%.</li>
</ol>
7. Regulacja gęstości kryształów
Uwaga: Jeśli gęstość kryształów znaleziona w kroku 6.4 jest zbyt wysoka, co skutkuje dużym procentem wielokrotnych uderzeń kryształów, kryształy powinny zostać rozcieńczone zgodnie z krokami opisanymi poniżej, aby zoptymalizować próbkę do zbierania danych. Jeśli gęstość kryształów jest zbyt niska, aby można było efektywnie zbierać dane we wszystkich przygotowanych próbkach, należy ponownie zoptymalizować warunki wzrostu kryształów, ponieważ nie ma niezawodnej metody koncentracji kryształów MP w LCP.
<ol>
	<li>Przygotować wymaganą ilość czystego LCP do użycia do rozcieńczenia, naśladując skład LCP (ten sam lipid i środek strącający) oryginalnej próbki z kryształami, które należy rozcieńczyć.</li>
	<li>Przenieś wszystkie schludne LCP do jednej strzykawki. Odłączyć pustą strzykawkę, ale pozostawić złączkę podłączoną.</li>
	<li>Wyjąć igłę ze strzykawki, w której znajduje się próbka LCP z mikrokryształami. Połączyć strzykawkę z próbką ze strzykawką zawierającą czysty LCP przez łącznik.</li>
	<li>Wymieszać zawartość strzykawek, przepychając ją w przód i w tył przez łącznik, aż do uzyskania jednorodności.</li>
	<li>Powtórzyć sekcję 6, aby ponownie ocenić gęstość mikrokryształów w dostosowanej próbce.</li>
</ol>
8. Wczytywanie wtryskiwaczy LCP i zbieranie danych LCP-SFX
<ol>
	<li>Odłączyć łącznik od strzykawki z próbką i przymocować do strzykawki igłę ładującą 1".</li>
	<li>Przenieść 20-40 μl próbki do zbiornika wtryskiwacza LCP.</li>
	<li>Włóż wtryskiwacz LCP do komory próbki18, uruchom wtryskiwacz, wyreguluj natężenie przepływu i zbierz dane LCP-SFX.</li>
</ol>
9. Włączenie rozpuszczalnych kryształów białka do LCP
Uwaga: Użycie mediów o wysokiej lepkości, takich jak LCP, do dostarczania kryształów rozpuszczalnych białek pozwala na radykalne zmniejszenie zużycia białka w eksperymencie krystalografii seryjnej. W tych krokach opisujemy, jak włączyć kryształy rozpuszczalnych białek do LCP. Kryształy można otrzymać dowolną techniką, konsolidować razem w postaci zawiesiny krystalicznej i w razie potrzeby filtrować.
<ol>
	<li>Dostosuj gęstość kryształów w zawieszeniu, aby zapewnić współczynnik trafień kryształów na poziomie około 10-40%.</li>
	<li>Zbadać zgodność roztworu strącającego z LCP przy użyciu 7,9 MAG, 9,7 MAG lub mieszaniny 1:1 7,9 MAG i 9,9 MAG jako lipidu gospodarza.</li>
	<li>Zmieszać ~25 μl zawiesiny krystalicznej z ~25 μl lipidu gospodarza za pomocą miksera strzykawkowego, aż powstanie jednorodny LCP.</li>
	<li>Oceń rozmiar i gęstość kryształów zgodnie z opisem w sekcji 6. Załadować próbkę do wtryskiwacza LCP i zebrać dane zgodnie z opisem w rozdziale 8.</li>
</ol>

<ol><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>DePonte, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+dynamic+virtual+nozzle+for+generation+of+microscopic+droplet+streams%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+D+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams.</a> J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Fenalti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+bifunctional+peptide+recognition+at+human+%CE%B4-opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Strcut+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor.</a> Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors.</a> Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Angiotensin+Receptor+Revealed+by+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography.</a> Cell. 161 (4), 833-844 (2015).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+allosteric+regulation+of+GPCRs+by+sodium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions.</a> Science. 337 (6091), 232-236 (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Lipid+and+Temperature+as+Important+Screening+Variables+for+Crystallizing+Integral+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases.+Trials+with+Diacylglycerol+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase.</a> Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaffrey%2C+M+%22Current+Topics+in+Membranes%22">Current Topics in Membranes</a>. 63, Elsevier. (2009).</li>
<li>Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoolein%3A+a+magic+lipid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Monoolein: a magic lipid?</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+D+%22Injection+Methods+and+Instrumentation+for+Serial+X-ray+Free+Electron+Laser+Experiments%22">Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments</a>. , Arizona State University. 1-126 (2015).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+bound+to+arrestin+by+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sct+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-resolved+crystallography+of+photosystem+II+using+a+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 513, 261-265 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj protokoły zawierają ogólny zarys procedury przygotowania próbki do standardowego eksperymentu LCP-SFX z wtryskiwaczem LCP. Opierając się na naszym doświadczeniu, całkowita ilość końcowej próbki LCP z mikrokryształami wymagana do zebrania pełnego zestawu danych wynosi zwykle 50-100 μl (Tabela 1; 25-50 μl początkowej próbki LCP z białkiem), w zależności od wielkości, jakości i gęstości mikrokryształu. Ponieważ każda gazoszczelna szklana strzykawka o pojemności 100 μl może pomieścić około 7 μl LCP w postaci w pełni rozciągniętego sznurka, aby zapewnić prawidłową i równomierną dyfuzję roztworu strącającego do LCP, do każdego eksperymentu LCP-SFX należy przygotować co najmniej cztery do siedmiu próbek w strzykawkach.
Ponieważ próbka jest wytłaczana przez wąską kapilarnę o średnicy 20-50 μm, bardzo ważne jest, aby unikać w próbce jakichkolwiek obcych cząstek stałych. Pyły i włókna, które mogą być sporadycznie wprowadzane do próbki LCP lub roztworów strącających, mogą zatkać kapilarnę wtryskiwacza i wydłużyć czas przestoju podczas eksperymentu. Dlatego ważne jest, aby przed przygotowaniem próbek przefiltrować lipidy i wszystkie roztwory przez filtr porowy o wielkości 5 μm. Opcjonalnie do przygotowania próbki można użyć okapu do pomieszczenia czystego lub przenośnego okapu do pomieszczenia czystego.
Protokoły te opierają się na użyciu 9,9 MAG (monooleiny) jako lipidu gospodarza do krystalizacji MP. Nie są one jednak ograniczone do 9,9 MAG i można je łatwo dostosować do dowolnych innych lipidów gospodarza LCP lub mieszanin lipidów po uwzględnieniu różnic w zachowaniu fazy lipidowej. Większość struktur MP skrystalizowanych w LCP została uzyskana przy użyciu jednego z MAG, przy czym 9,9 MAG jest jak dotąd najbardziej udanym przedstawicielem15. Główną wadą stosowania 9,9 MAG dla SFX jest jego przejście do blaszkowatej fazy krystalicznej po schłodzeniu poniżej 18 °C, co często ma miejsce, gdy akwizycja danych odbywa się w próżni. Miareczkowanie za pomocą 7,9 MAG opisane w sekcji 5 niniejszego protokołu stanowi dobre rozwiązanie tego problemu. Z naszego doświadczenia wynika, że kryształy wytrzymują takie miareczkowanie bez żadnych negatywnych skutków. Jeśli jednak dodanie 7,9 MAG lub innego krótkołańcuchowego MAG nie jest pożądane, miareczkowanie można przeprowadzić za pomocą 9,9 MAG. W takim przypadku gaz, który stabilizuje przepływ LCP podczas wtryskiwania do próżni, powinien zostać zamieniony z helu na azot, co może zapobiec tworzeniu się krystalicznej fazy lipidowej w większości próbek, kosztem mniej stabilnego przepływu próbki.
Żelowa konsystencja LCP ma wielką zaletę w stosowaniu jako krystaliczny nośnik danych, ponieważ umożliwia regulację natężenia przepływu kryształów w szerokim zakresie, odpowiednim do szeregowego zbierania danych krystalograficznych w nowoczesnych źródłach XFEL i synchrotronowych. Dopasowanie natężenia przepływu kryształów do częstotliwości powtarzania impulsów XFEL powoduje radykalne zmniejszenie zużycia kryształów o rzędy wielkości w porównaniu z wtryskiwaniem cieczy. LCP jest odpowiednim podłożem nośnikowym do dostarczania nie tylko wyhodowanych w nim kryształów MP, ale także kryształów rozpuszczalnych białek21. Ostatnio wprowadzono kilka alternatywnych lepkich nośników krystalicznych 22-24, rozszerzając arsenał narzędzi i odczynników do przeprowadzania eksperymentów krystalografii seryjnej. Co więcej, krystalografia szeregowa z LCP jako medium dostarczania kryształów została zademonstrowana w konwencjonalnych źródłach synchrotronowych, przynajmniej dla dobrze dyfrakcyjnych kryształów24,25. Przyszłe modernizacje źródeł synchrotronowych, które zwiększają intensywność promieniowania rentgenowskiego o rzędy wielkości, a także ulepszenia w technologiach detektorów, sprawią, że krystalografia szeregowa stanie się jeszcze bardziej dostępną i atrakcyjną metodą określania struktury.
LCP-SFX wykazał swoją moc w określaniu struktury MP. W przypadku wymagających układów biologicznych (takich jak GPCR lub kompleksy makromolekularne), w których duże kryształy o jakości dyfrakcyjnej są trudne do wyhodowania, LCP-SFX może stanowić atrakcyjną, jeśli nie jedyną, realną opcję rozwiązania struktury o rozdzielczości atomowej. Biorąc pod uwagę wszystkie swoje zalety, tj. wykorzystanie LCP jako matrycy do krystalizacji MP i dostarczania kryształów, niskie zużycie białka, brak uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, gromadzenie danych w temperaturze pokojowej, możliwości badań czasowo-rozdzielczych26,27 i brak wymogu zbierania kryształów, LCP-SFX powinien odegrać ważną rolę w przyszłości biologii strukturalnej.

Krystalografia rentgenowska jest jak dotąd najbardziej udaną techniką rozwiązywania struktur o rozdzielczości atomowej białek błonowych (MPs). Krystalizacja z mezofaz lipidowych, znana również jako lipidowa faza sześcienna (LCP) lub krystalizacja mezo, stanowi jedno z głównych osiągnięć w krystalografii MP, które umożliwiło określenie struktury w wysokiej rozdzielczości trudnych celów, takich jak receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)1. Ostatnie postępy w narzędziach i technologiach LCP sprawiły, że technika ta jest dostępna dla dużej społeczności biologów strukturalnych na całym świecie2. Jednak w wielu przypadkach kryształy MP, które tworzą się w LCP, są zbyt małe, aby można je było wykorzystać nawet w najbardziej zaawansowanych liniach synchrotronowych mikrofokusowych, gdzie próbki ulegają poważnym uszkodzeniom radiacyjnym i pogorszeniu jakości, zanim będzie można uzyskać wystarczający sygnał o wysokiej rozdzielczości3.
Nowe podejście do zbierania danych krystalograficznych zostało umożliwione wraz z uruchomieniem pierwszego rentgenowskiego lasera na swobodnych elektronach (XFEL). Metoda opiera się na zasadzie "dyfrakcji przed zniszczeniem", najpierw wprowadzonej teoretycznie4, a następnie potwierdzonej eksperymentalnie na próbkach biologicznych w Linac Coherent Light Source (LCLS)3, światowym pionierze w dziedzinie twardych XFEL. XFEL generuje impulsy promieniowania rentgenowskiego o wysokiej jasności w ciągu kilkudziesięciu femtosekund, które ulegają dyfrakcji od nieskazitelnego kryształu, zanim atomy białka będą mogły się poruszyć w odpowiedzi na uszkodzenie przez promieniowanie. W początkowych eksperymentach mikrokryształy były w sposób ciągły dostarczane do punktu przecięcia z wiązką XFEL w strumieniu wodnym wytwarzanym przez wtryskiwacz cieczy5. Ten eksperymentalny układ jest znany jako seryjna krystalografia femtosekundowa (SFX). Główną wadą stosowania wtryskiwaczy cieczy do SFX jest ich wysokie natężenie przepływu, co w konsekwencji wymaga dziesiątek do setek miligramów oczyszczonego białka do zebrania kompletnego zestawu danych. Dzięki zastosowaniu specjalnego wtryskiwacza, który może obsługiwać żelowe próbki LCP (wtryskiwacz do mikroekstruzji LCP)6, z powodzeniem dostarczyliśmy mikrokryształy kilku różnych ludzkich GPCR wyhodowanych w matrycy LCP i uzyskaliśmy ich struktury o wysokiej rozdzielczości 6-9, przy znacznie zmniejszonym zużyciu białka do poziomu poniżej 0,3 mg na zestaw danych. Wtryskiwacz składa się ze zbiornika, który może pomieścić do 20, 40 lub 100 μl krystalicznego LCP oraz wąskiej kapilary (o średnicy 10-50 μm), przez którą próbka jest wytłaczana pod wysokim ciśnieniem (do 10 000 psi) z tłoka hydraulicznego ze stopniem o zwiększonym ciśnieniu, napędzanym cieczą z pompy HPLC (wysokowydajna chromatografia cieczowa). Strumień LCP wychodzący z dyszy kapilarnej jest stabilizowany przez równoległy przepływ niereaktywnego gazu (zwykle helu lub azotu).
Tutaj prezentujemy wizualne demonstracje kroków wymaganych do przygotowania i scharakteryzowania próbek do eksperymentu LCP-SFX. Dodatkowe informacje można znaleźć w opublikowanych protokołach10. Jako przykład użyjemy receptora adenozyny A2A 11 i przygotujemy kryształy tego białka w LCP do zbierania danych rentgenowskich przy użyciu podejścia SFX. Chociaż nasze protokoły są kompatybilne z każdym wtryskiwaczem zdolnym do przesyłania strumieniowego LCP w celu zbierania danych przez krystalografię szeregową w źródłach XFEL i synchrotronowych, w celach ilustracyjnych użyjemy wtryskiwacza LCP opisanego w ref. 6. Zoptymalizowane warunki strącania, które wytwarzają mikrokryształy o dużej gęstości w LCP, powinny zostać zidentyfikowane przez wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji12,13 przed przystąpieniem do tego protokołu. Typowy schemat blokowy dla tego protokołu pokazano na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>Monooleina lipidowa gospodarza LCP (9,9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Lipid hostujący białko, które ma zostać skrystalizowane</td></tr><tr><td>Monooleina lipidowa gospodarza LCP (9,9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>Żywienie lipidów dla białka, które ma zostać skrystalizowane</td></tr><tr><td>Monopalmityoleina lipidowa gospodarza LCP (9,7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Hosting lipidu dla białka, które ma zostać skrystalizowane</td></tr><tr><td>Lipid gospodarza LCP 7,9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>Hosting lipidów do tiracji, aby uniknąć tworzenia się blaszkowatej fazy krystalicznej (Lc) podczas wstrzykiwania próbki</td></tr><tr><td>Oczyszczony roztwór białkowy stężony do 20-50 mg / ml</td><td></td><td></td><td>Białko docelowe</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Służy do rozpuszczania lipidów</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Służy do mycia strzykawek</td></tr><tr><td>Eleven 100 &#956; l Gazoszczelne strzykawki Hamilton bez igieł</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>Do przygotowania LCP</td></tr><tr><td>Osiem łączników strzykawkowych</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>Do przygotowania</td></tr><tr><td>LCP Igła ładująca wtryskiwacza LCP</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 punkt styl 3, długość 1 cal</td><td>Do dozowania LCP i ładowania wtryskiwacza</td></tr><tr><td>Igła wymienna</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Do usuwania roztworu strącającego</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Służy do uszczelniania strzykawek</td></tr><tr><td>Niestrzępiące się chusteczki do czyszczenia soczewek</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Odśrodkowe rurki filtracyjne, Ultrafree-MC, 0,5 ml, Durapore 5 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Służy do filtrowania roztworów strącających i lipidów</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, 1 cal x 3 cale&nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Dwie butelki do mycia z cienkimi końcówkami. Jeden wypełniony mili-Q lub wodą destylowaną, drugi metanolem</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>Służą one do czyszczenia strzykawek, igieł i łącznika. Najpierw stosuje się metanol, a następnie wodę.</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Do suszenia strzykawek, igieł, tulejek i łączników</td></tr><tr><td>Okulary ochronne Puszki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>z powietrzem pod ciśnieniem Office</td><td>Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>Do czyszczenia strzykawek</td></tr><tr><td>Suchy blok grzewczy z cyfrowym regulatorem temperatury</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>Służy do rozmrażania lipidów</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Roztwory do wirowania</td></tr><tr><td>Clean Room Mini - 12-calowy przenośny okap nadciśnieniowy z filtrem HEPA</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Przygotowanie próbki czyszczącej</td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowy wyposażony w polaryzator liniowy i analizator obrotowy&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Mikroskop UV do sprawdzania gęstości kryształów</td></tr><tr><td></td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>Opcjonalnie, do celów obrazowania kryształów</td></tr><tr><td>Imager SHG</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>Opcjonalnie, do celów obrazowania kryształów</td></tr></tbody></table>

otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Białka błonowe (MPs) są niezbędnymi składnikami błon komórkowych i głównymi celami leków. Racjonalne projektowanie leków opiera się na precyzyjnych informacjach strukturalnych, zwykle uzyskiwanych za pomocą krystalografii; Posłowie są jednak trudni do skrystalizowania. Niedawny postęp w oznaczaniu struktury MP znacznie skorzystał na opracowaniu metod krystalizacji lipidowej fazy sześciennej (LCP), które zazwyczaj dają dobrze dyfrakcyjne, ale często małe kryształy, które ulegają uszkodzeniom radiacyjnym podczas tradycyjnego zbierania danych krystalograficznych w źródłach synchrotronowych. Opracowanie nowej generacji źródeł lasera rentgenowskiego na swobodnych elektronach (XFEL), które wytwarzają niezwykle jasne impulsy femtosekundowe, umożliwiło zbieranie danych o temperaturze pokojowej z mikrokryształów bez uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem lub przy ich znikomym znaczeniu. Nasze ostatnie wysiłki w zakresie połączenia technologii LCP z seryjną krystalografią femtosekundową (LCP-SFX) zaowocowały strukturami o wysokiej rozdzielczości kilku ludzkich receptorów sprzężonych z białkiem G, które stanowią niezwykle trudny cel do określenia struktury. W technice LCP-SFX, LCP jest rekrutowany jako matryca zarówno do wzrostu, jak i dostarczania mikrokryształów MP do przecięcia strumienia wtryskiwacza z wiązką XFEL w celu zbierania danych krystalograficznych. Wykazano, że LCP-SFX może znacznie poprawić rozdzielczość dyfrakcji, gdy dostępne są tylko kryształy poniżej 10 μm lub gdy zastosowanie mniejszych kryształów w temperaturze pokojowej może przezwyciężyć różne problemy związane z większymi kryształami chłodzonymi kriogenicznie, takie jak akumulacja defektów, wysoka mozaikowość i artefakty kriochłodzenia. Przyszły postęp w dziedzinie źródeł promieniowania rentgenowskiego i technologii detektorów powinien sprawić, że krystalografia szeregowa stanie się bardzo atrakcyjna i możliwa do wdrożenia nie tylko w XFEL, ale także na bardziej dostępnych liniach synchrotronowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły wizualne dotyczące przygotowania, charakterystyki i dostarczania mikrokryształów w LCP do eksperymentów krystalografii seryjnej. Protokoły te obejmują metody przeprowadzania eksperymentów krystalizacji w strzykawkach, wykrywania i charakteryzowania próbek kryształów, optymalizacji gęstości kryształów, ładowania LCP z mikrokryształami do urządzenia iniektorowego i dostarczania próbki do wiązki w celu zebrania danych.

Poniżej opisujemy reprezentatywne wyniki uzyskane z próbek przygotowanych zgodnie z powyższymi protokołami, co pozwoliło nam na zebranie danych SFX i rozwiązanie struktur o wysokiej rozdzielczości pięciu ludzkich GPCR: receptora serotoninowego 5-HT2B w kompleksie z agonistą ergotaminą8 (PDB ID 4NC3), receptora wygładzonego (SMO) w kompleksie z antagonistą cyklopaminą6 (PDB ID 4O9R), receptora δ-opioidowego w kompleksie z bifunkcyjnym ligandem peptydowym DIPP-NH27(PDB ID 4RWD), receptora angiotensyny w kompleksie z blokerem ZD71559 (PDB ID 4YAY) oraz kompleksu rodopsyny z arrestyną19 (PDB ID 4ZWJ); a także dwóch testowych białek rozpuszczalnych: lizozymu (PDB ID 4ZIX) i fikocyjaniny (PDB ID 4ZIZ).
5-HT2B pośredniczy w różnych ośrodkowych i obwodowych funkcjach fizjologicznych neuroprzekaźnika serotoniny. Receptor ten został wykorzystany do opracowania i walidacji metody LCP-SFX poprzez porównanie struktury uzyskanej w temperaturze pokojowej w LCLS ze strukturą schłodzoną kriogenicznie, rozwiązaną metodą tradycyjnej mikrokrystalografii w Advanced Photon Source (APS). Przygotowano i wykorzystano do zbierania danych SFX łącznie ok. 100 µl próbki LCP z mikrokryształami białka (średnia wielkość ok. 5 µm), a struktura LCP-SFX 5HT2B została pomyślnie rozwiązana w rozdzielczości 2.8 Å (Ryc. 2)8. Dodatkowe przydatne szczegóły dotyczące przygotowania próbek i zbierania danych znajdują się w Tabeli 1.
Receptor Smoothened (SMO) jest członkiem klasy F GPCR i molekularnym celem teratogenu cyklopaminy, o dobrze udokumentowanych funkcjach w rozwoju embrionalnym i wzroście nowotworów. Początkowo uzyskano stosunkowo duże kryształy SMO/cyklopaminy o średnich wymiarach 120×10×5 µm, które następnie wykorzystano do zbierania danych w źródle synchrotronowym przy użyciu konwencjonalnej krystalografii opartej na goniometrze. Jednakże duże kryształy te wykazywały słabą dyfrakcję na linii wiązki mikroogniskowej (o średnicy 10 µm) z powodu dużej mozaikowości (powyżej 2-3 stopni), co prawdopodobnie wynikało z akumulacji defektów wzrostu kryształów lub efektów związanych z chłodzeniem kriogenicznym. Technika LCP-SFX umożliwiła jednak zebranie wysokiej jakości danych dyfrakcyjnych w LCLS z kryształów o rozmiarze 5 µm w temperaturze pokojowej. Strukturę rozwiązano metodą wymiany molekularnej przy anizotropowej rozdzielczości 3,4, 3,2 i 4,0 Å wzdłuż trzech głównych osi, co pozwoliło na jednoznaczne zidentyfikowanie położenia cyklopaminy w kieszeni wiążącej6 (Rysunek 3).
Opiaty alkaloidowe, takie jak morfina, celujące w receptor µ-opioidowy (µ-OR), są szeroko stosowane w leczeniu silnego bólu. Jednakże ich intensywne użycie prowadzi do nabytej tolerancji i uzależnienia. Wykazano, że jednoczesne podawanie morfin z antagonistami receptora δ-opioidowego (δ-OR) zapobiega wyżej wymienionym efektom ubocznym, co stymuluje poszukiwanie związków o mieszanej funkcji antagonisty δ-OR i agonisty µ-OR. Uzyskaliśmy wstępne dane dyfrakcyjne dla δ-OR w kompleksie z bifunkcyjnym tetrapeptydem DIPP-NH2, wykorzystując kryształy chłodzone kriogenicznie, które dyfrakowały do 3,3 Å w synchrotronowym źródle promieniowania X przy zastosowaniu konwencjonalnej strategii zbierania danych opartej na goniometrze. Dane te ujawniły częściowo niejednoznaczną gęstość elektronową dla liganda peptydowego. Następnie uzyskano dane dyfrakcyjne XFEL w temperaturze pokojowej i wyznaczono strukturę o rozdzielczości 2,7 Å, wykazującą wyraźną gęstość dla liganda i receptora7. Struktura ta stworzyła możliwość dalszego zrozumienia funkcji i selektywności receptora opioidowego oraz dostarczyła cennych informacji dla opracowania nowych leków przeciwbólowych.
Receptor angiotensyny II typu 1 (AT1R) jest białkiem GPCR pełniącym funkcję głównego regulatora ciśnienia tętniczego krwi. Skrystalizowaliśmy AT1R w kompleksie z antagonistą ZD7155 w LCP. Zoptymalizowane kryształy osiągnęły maksymalny rozmiar 40×4×4 µm3, przy czym najlepsza dyfrakcja w źródle synchrotronowym osiągnęła jedynie ~4 Å. Poprzez zmianę warunków krystalizacji otrzymaliśmy liczne drobne kryształy (10×2×2 µm3), które posłużyły do wyznaczenia struktury w temperaturze pokojowej z rozdzielczością 2,9 Å przy użyciu promieniowania XFEL. Zebrano łącznie 2 764 739 obrazów z detektora w celu stworzenia kompletnego zbioru danych z około 65 µl LCP zawierającego kryształy, co odpowiadało około 0,29 mg białka9. Z całkowitej liczby klatek 457 275 zidentyfikowano jako trafienia kryształów, co odpowiada współczynnikowi trafień na poziomie 17%, z czego 73 130 klatek (16% trafień) zostało pomyślnie zaindeksowanych i zintegrowanych.
Białka GPCR sygnalizują poprzez dwie główne ścieżki pośredniczone przez białka G lub arrestyny. Struktura receptora β2-adrenergicznego związanego z heterotrymericznym białkiem Gs została rozwiązana kilka lat temu20, podczas gdy struktura GPCR w kompleksie z arrestyną pozostawała nieuchwytna. Uzyskaliśmy małe kryształy białka fuzyjnego rodopsyny i arrestyny w LCP, które osiągały 25-30 µm w najdłuższym wymiarze, jednak mimo rozległej optymalizacji dyfrakcja w źródłach synchrotronowych osiągała jedynie rozdzielczość ~7 Å. Stosując metodę LCP-SFX, w ciągu 12 godzin czasu wiązki XFEL zebraliśmy 22 262 sygnałów z kryształów, z których 18 874 wzorów zostało pomyślnie zaindeksowanych i zintegrowanych do anizotropowych limitów rozdzielczości 3.8 Å / 3.8 Å / 3.3 Å19. Kompleks rodopsyna-arrestyna jest bardzo trudnym kompleksem białkowym, który opierał się próbom wyznaczenia struktury przy użyciu tradycyjnych podejść. Pomyślne wyznaczenie tej struktury zademonstrowało ogromny potencjał metody LCP-SFX w rozwiązywaniu trudnych problemów i zapewniło wyjątkową okazję do zbadania mechanizmu sygnalizacji preferującej arrestyny w GPCR.
Wreszcie, poza kryształami białek błonowych hodowanymi w fazie lipidowej, nasza metoda przygotowania i dostarczania próbek została z sukcesem zaadaptowana do kryształów białek rozpuszczalnych, w których LCP służy jako medium nośne do dostarczania kryształów, co pozwoliło nam drastycznie zmniejszyć zużycie białka wymagane do oznaczenia struktury. Metodą tą rozwiązano struktury dwóch białek modelowych, lizozymu i fikocyjaniny, odpowiednio w rozdzielczości 1,89 Å i 1,75 Å, zużywając mniej niż 0,1 mg każdego z białek21.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Receptor serotoninowy 2B</td>
			<td>Receptor Smoothened </td>
			<td>Receptor opioidowy δ </td>
			<td>Receptor angiotensyny II typu 1</td>
			<td>Rhodopsyna-Arrestyna </td>
			<td>Lizozym</td>
			<td>Fikocyjanina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Id PDB</td>
			<td>4NC3</td>
			<td>4O9R</td>
			<td>4RWD</td>
			<td>4YAY</td>
			<td>4ZWJ</td>
			<td>4ZIX</td>
			<td>4ZIZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita ilość użytej próbki*, μl</td>
			<td>100</td>
			<td>83</td>
			<td>50</td>
			<td>65</td>
			<td>75</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zużyta całkowita ilość białka, μg</td>
			<td>300</td>
			<td>500</td>
			<td>300</td>
			<td>290</td>
			<td>340</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia wielkość kryształów, μm</td>
			<td>5×5×5</td>
			<td>&lt;5</td>
			<td>5×2×2</td>
			<td>10×2×2</td>
			<td>5-10</td>
			<td>5×2×2</td>
			<td>10×10×5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wskaźnik trafień, %</td>
			<td>3.6</td>
			<td>7.8</td>
			<td>5.9</td>
			<td>17</td>
			<td>0.45</td>
			<td>40</td>
			<td>6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowity czas gromadzenia danych, h</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
			<td>4.6</td>
			<td>6.4</td>
			<td>12</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba zaindeksowanych wzorów</td>
			<td>32,819</td>
			<td>61,964</td>
			<td>36,083 </td>
			<td>73,130</td>
			<td>18,874</td>
			<td>54,544</td>
			<td>6,629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa przestrzenna</td>
			<td>C 2 2 21</td>
			<td>P 21</td>
			<td>C 2</td>
			<td>C 2 </td>
			<td>P 21 21 21</td>
			<td>P 43 21 2</td>
			<td>H 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdzielczość, Å</td>
			<td>2.8</td>
			<td>3.2 / 3.4 / 4.0</td>
			<td>2.7</td>
			<td>2.9</td>
			<td>3.3 / 3.8 / 3.8</td>
			<td>1.89</td>
			<td>1.75</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Po miareczkowaniu lipidów
Tabela 1. Podsumowanie statystyk przygotowania próbek i zbierania danych dla reprezentatywnych struktur rozwiązanych metodą LCP-SFX.
Ilość próbki wymagana do eksperymentu LCP-SFX zależy od jakości dyfrakcji kryształów, gęstości kryształów, średnicy dyszy wtryskiwacza, a także od rozmiaru wiązki XFEL, jej natężenia i częstotliwości powtarzania impulsów.
<img alt="Schemat krystalizacji białka; kroki obejmują rekonstytucję LCP, detekcję kryształów, dane SFX." src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat typowej procedury przygotowania próbki do LCP-SFX. Przygotowanie próbki rozpoczyna się od krystalizacji białka docelowego w LCP w szczelnych szklanych strzykawkach. Po uzyskaniu kryształów, LCP zawierający kryształy jest konsolidowany w jednej strzykawce i miareczkowany dodatkowym lipidem w celu zaabsorbowania nadmiaru roztworu precypitantu. Następnie kryształy są charakteryzowane przy użyciu różnych metod mikroskopowych przed zbiorem danych XFEL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie krystalizacji białka; mikroskopia optyczna i struktura molekularna, pasek skali 50μm." src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny wynik, struktura 5-HT2B w kompleksie z ergotaminą. (a) Mikrokryształy 5-HT2B/ergotaminy obrazowane w trybie mikroskopii w polu jasnym8. Rycina ta została powtórnie wykorzystana z referencji 8 za zgodą na prawa autorskie od Science. (b) Mikrokryształy 5-HT2B/ergotaminy obrazowane w trybie mikroskopii w świetle spolaryzowanym skrzyżowanym8. Rycina ta została powtórnie wykorzystana z referencji 8 za zgodą na prawa autorskie od Science. (c) Schematyczny model struktury 5-HT2B/ergotaminy uzyskany metodą LCP-SFX. Lipidy wbudowane w model przedstawiono w formie prętów. Ligand ergotamina przedstawiony jest w formie sfer. Linie ciągłe wskazują przybliżone granice błony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie struktury białka i mikroskopia fluorescencyjna, analiza biomolekularna, wizualizacja struktury." src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywny wynik: struktura SMO w kompleksie z cyklopaminą. Panel lewy: mikrokryształy SMO/cyklopaminy zobrazowane przy użyciu mikroskopu w trybie polaryzacji skrzyżowanej6. Rysunek został wykorzystany z referencji 6 za zgodą na prawa autorskie z Nature Communications. Panel prawy: schematyczna reprezentacja struktury SMO/cyklopaminy uzyskana metodą LCP-SFX. Ligand cyklopamina przedstawiony jest w formie sferycznej. Linie ciągłe wskazują przybliżone granice błony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie próbek kryształów białek błonowych w lipidowej fazie kubicznej do seryjnej zbiórki danych krystalograficznych w synchrotronach oraz w laserach wolnych elektronów emitujących promienie rentgenowskie. Metoda ta powinna pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej białek błonowych, takich jak transport i transdukcja sygnałów przez błonę. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wyznaczenie struktury białek błonowych w ich natywnym środowisku lipidowym w temperaturze pokojowej, przy minimalnym zużyciu próbek i pomijalnych uszkodzeniach radiacyjnych.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ lipidowa faza sześcienna jest lepkim, żelopodobnym materiałem, który jest trudny w obsłudze bez specjalistycznych narzędzi i wcześniejszego doświadczenia. Rozpocznij tę procedurę od rekonstytucji białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej (ang. Lipidic Cubic Phase, LCP), używając strzykawek numer jeden i numer dwa, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po utworzeniu się przezroczystej i jednorodnej fazy LCP, przenieś całą próbkę do strzykawki numer dwa.Odłącz strzykawkę nr 1, pozostawiając łącznik podłączony do strzykawki nr 2. Do kolejnej czystej strzykawki o pojemności 100 µL, nazwanej strzykawką nr 3, podłącz wymienną igłę. Naciągnij do niej około 70 µL roztworu precypitantu.Odłącz igłę od strzykawki nr 3, pozostawiając teflonową sferulę wewnątrz strzykawki. Połącz strzykawki nr 2 i nr 3 za pomocą łącznika, upewniając się, że teflonowe sferule znajdują się we właściwych miejscach w obu strzykawkach. Ostrożnie i mocno dokręć łącznik.Ustaw połączone strzykawki pionowo, tak aby strzykawka nr 2 znajdowała się na dole, a następnie powoli i jednostajnie wstrzyknij próbkę LCP zawierającą białko ze strzykawki nr 2 do strzykawki nr 3, aż nić LCP dotknie tłoka strzykawki nr 3. Wstrzyknięta objętość LCP powinna stanowić około 1/10 początkowej objętości czynnika wytrącającego w strzykawce nr 3. Zweryfikuj objętość, odczytując wartości ze skal na obu strzykawkach.Następnie odłącz strzykawkę numer dwa. Sprzęgacz jest teraz połączony tylko ze strzykawką numer trzy, która zawiera próbkę zanurzoną w roztworze wytrącającym. Użyj Parafilmu, aby całkowicie uszczelnić strzykawkę numer trzy, w tym miejsce styku tłoka ze strzykawką, otwór sprzęgacza oraz nakrętkę igły.Niedokładne uszczelnienie na tym etapie może spowodować zmianę warunków wytrącania oraz odwodnienie próbki. Powtórz kroki wstrzykiwania próbki LCP z białkiem, aby przygotować krystalizację w sześciu dodatkowych strzykawkach, wykorzystując łącznie około 50 µL próbki LCP. Przechowuj uszczelnione strzykawki w plastikowej torebce zamykanej, wraz z jedną lub dwiema nasączonymi wodą chusteczkami bezpyłowymi, aby zapobiec odwodnieniu próbki.Zamknij worek i przechowuj strzykawki w inkubatorze w temperaturze 20°C podczas wzrostu kryształów. W celu detekcji kryształów wyjmuj strzykawki z inkubatora co 12 do 24 godzin, aby bezpośrednio wewnątrz strzykawek oceniać próbki LCP pod mikroskopem stereoskopowym ze światłem spolaryzowanym krzyżowo. Kryształy identyfikuj jako gęsto upakowane błyszczące cząsteczki lub, w przypadku mniejszego rozmiaru kryształów, jako jednolity blask emitowany przez filament LCP.Włożyć szczelnie zamknięte strzykawki z powrotem do torby i przechowywać w temperaturze 20 °C do późniejszego użycia. Etap miareczkowania lipidów jest niezbędny, aby wchłonąć nadmiar roztworu wytrącającego i zapobiec zamarzaniu lipidów podczas wstrzykiwania w wiązkę rentgenowskiego laseru elektronowego. Około jednej godziny przed rozpoczęciem zbierania danych wyjąć strzykawki z próbkami z inkubatora ustawionego na 20 °C.Wybierz od dwóch do czterech strzykawek do konsolidacji próbek, kierując się podobnym wyglądem kryształów oraz zbliżonymi warunkami krystalizacji. Ostrożnie usuń uszczelnienie z Parafilmu z wybranych strzykawek. Zdejmij łącznik strzykawki i przymocuj czystą, wymienną igłę do pierwszej wybranej strzykawki.Powoli i delikatnie pchnij tłok do przodu, aby wycisnąć czynnik wytrącający przez igłę do probówki do mikrocentryfugi. Zachowaj ostrożność na tym etapie, ponieważ zastosowanie zbyt dużego nacisku na tłok może spowodować wypchnięcie części LCP zawierającego kryształy wraz z roztworem czynnika wytrącania, co doprowadzi do częściowej lub całkowitej utraty próbki. Przerwij ruch tłoka, gdy większość czynnika wytrącania zostanie usunięta, a LCP zgromadzi się przy wjściu do igły.Wykonaj ten proces dla pozostałych wybranych strzykawek. Aby połączyć otrzymane próbki LCP, połącz dwie strzykawki za pomocą czystej złączki. Naciśnij tłok w jednej strzykawce, aby przenieść całą próbkę z jednej strzykawki do drugiej.Odłącz pustą strzykawkę. Powtarzaj ten krok, aż cały materiał LCP zawierający kryształy zostanie zgromadzony w jednej strzykawce. Usuń jak największą ilość osadnika.Do pustej strzykawki należy dodać około 5 µL 7.9 MAG lub pierwotnego lipidu gospodarza MAG o krótszym łańcuchu. Strzykawkę tę należy połączyć ze strzykawką zawierającą skonsolidowaną próbkę za pomocą łącznika do strzykawek, a następnie wymieszać, naprzemiennie naciskając tłoki strzykawek. Proces ten należy powtarzać do czasu wchłonięcia całego pozostałego roztworu i utworzenia się jednorodnej i przezroczystej fazy LCP.Przenieś całą zmieszaną próbkę LCP do jednej strzykawki i odłącz pustą strzykawkę. Do strzykawki z połączoną próbką przymocuj igłę ładującą wstrzykiwacza LCP. Ostrożnie nanieś około 1 µL próbki LCP na szkiełko przedmiotowe i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkę, aby zakleszczyć próbkę. Wykonaj zdjęcia próbki LCP pod mikroskopem stereoskopowym przy najwyższym możliwym powiększeniu, stosując oświetlenie w polu jasnym oraz polaryzatory skrzyżowane. Jeśli to możliwe, wykonaj dodatkowe zdjęcia przy użyciu mikroskopu i systemu obrazowania z fluorescencją UV, aby potwierdzić obecność mikrokryształów białka w próbce.Oszacuj wielkość i gęstość kryształów. Idealna gęstość kryształów dla eksperymentu zbierania danych będzie zależeć od wielkości kryształów, średnicy wiązki promieni rentgenowskich oraz średnicy strumienia LCP i powinna skutkować częstotliwością trafień kryształów na poziomie około 10 do 40%. Na koniec załaduj injektor LCP i przeprowadź seryjną krystalografię femtosekundową LCP, czyli zbieranie danych LCP SFX, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawione tutaj mikrokryształy receptora serotoninowego w kompleksie z ergotaminą zostały obrazowane w trybie mikroskopu w polu jasnym oraz w trybie mikroskopu polaryzacyjnego z polaryzatorem skrzyżowanym.Struktura kompleksu receptora serotoninowego z ergotaminą została uzyskana metodą LCP SFX. Przedstawione tutaj mikrokryształy receptora wygładzającego w kompleksie z cyklopaminą zostały zobrazowane przy użyciu mikroskopu w trybie polaryzacyjnym. Struktura kompleksu receptora z cyklopaminą została uzyskana metodą LCP SFX.Po opanowaniu tej procedury można ją przeprowadzić w mniej niż dwie godziny, pod warunkiem właściwego wykonania. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w strukturę białek błonowych, po niewielkiej modyfikacji może być również zastosowana do innych białek. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na proces odkrywania leków, ponieważ struktury o wysokiej rozdzielczości stanowią doskonałe matryce dla standardowych oddziaływań ligand-białko i pomagają w projektowaniu bardziej efektywnych leków.

preparation-delivery-protein-microcrystals-lipidic-cubic-phase-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.

Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Powodzenie eksperymentu z seryjną krystalografią femtosekundową z rozdzielczością czasową zależy od efektywnego dostarczania próbki. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizujące wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny z wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Metodologia opiera się na homogenizacji próbki za pomocą nowatorskiego łącznika trójdrożnego i wizualizacji za pomocą szybkiej kamery.

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przygotować próbki krystalografii seryjnej do zbierania danych na wtryskiwaczu o wysokiej lepkości, Lipidico, niedawno uruchomionym w australijskim synchrotronie.

Protokół iniekcji lipidico do pomiarów krystalografii seryjnej w australijskim synchrotronie

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę otrzymywania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej. Technika ta umożliwia wyznaczanie struktury białek w natywnym środowisku lipidowym przy minimalnym zużyciu próbki.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Przeglądaj więcej filmów