Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie próbek kryształów białek błonowych w lipidowej fazie kubicznej do seryjnej zbiórki danych krystalograficznych w synchrotronach oraz w laserach wolnych elektronów emitujących promienie rentgenowskie. Metoda ta powinna pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej białek błonowych, takich jak transport i transdukcja sygnałów przez błonę. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wyznaczenie struktury białek błonowych w ich natywnym środowisku lipidowym w temperaturze pokojowej, przy minimalnym zużyciu próbek i pomijalnych uszkodzeniach radiacyjnych.

Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ lipidowa faza sześcienna jest lepkim, żelopodobnym materiałem, który jest trudny w obsłudze bez specjalistycznych narzędzi i wcześniejszego doświadczenia. Rozpocznij tę procedurę od rekonstytucji białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej (ang. Lipidic Cubic Phase, LCP), używając strzykawek numer jeden i numer dwa, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po utworzeniu się przezroczystej i jednorodnej fazy LCP, przenieś całą próbkę do strzykawki numer dwa.

Odłącz strzykawkę nr 1, pozostawiając łącznik podłączony do strzykawki nr 2. Do kolejnej czystej strzykawki o pojemności 100 µL, nazwanej strzykawką nr 3, podłącz wymienną igłę. Naciągnij do niej około 70 µL roztworu precypitantu.

Odłącz igłę od strzykawki nr 3, pozostawiając teflonową sferulę wewnątrz strzykawki. Połącz strzykawki nr 2 i nr 3 za pomocą łącznika, upewniając się, że teflonowe sferule znajdują się we właściwych miejscach w obu strzykawkach. Ostrożnie i mocno dokręć łącznik.

Ustaw połączone strzykawki pionowo, tak aby strzykawka nr 2 znajdowała się na dole, a następnie powoli i jednostajnie wstrzyknij próbkę LCP zawierającą białko ze strzykawki nr 2 do strzykawki nr 3, aż nić LCP dotknie tłoka strzykawki nr 3. Wstrzyknięta objętość LCP powinna stanowić około 1/10 początkowej objętości czynnika wytrącającego w strzykawce nr 3. Zweryfikuj objętość, odczytując wartości ze skal na obu strzykawkach.

Następnie odłącz strzykawkę numer dwa. Sprzęgacz jest teraz połączony tylko ze strzykawką numer trzy, która zawiera próbkę zanurzoną w roztworze wytrącającym. Użyj Parafilmu, aby całkowicie uszczelnić strzykawkę numer trzy, w tym miejsce styku tłoka ze strzykawką, otwór sprzęgacza oraz nakrętkę igły.

Niedokładne uszczelnienie na tym etapie może spowodować zmianę warunków wytrącania oraz odwodnienie próbki. Powtórz kroki wstrzykiwania próbki LCP z białkiem, aby przygotować krystalizację w sześciu dodatkowych strzykawkach, wykorzystując łącznie około 50 µL próbki LCP. Przechowuj uszczelnione strzykawki w plastikowej torebce zamykanej, wraz z jedną lub dwiema nasączonymi wodą chusteczkami bezpyłowymi, aby zapobiec odwodnieniu próbki.

Zamknij worek i przechowuj strzykawki w inkubatorze w temperaturze 20°C podczas wzrostu kryształów. W celu detekcji kryształów wyjmuj strzykawki z inkubatora co 12 do 24 godzin, aby bezpośrednio wewnątrz strzykawek oceniać próbki LCP pod mikroskopem stereoskopowym ze światłem spolaryzowanym krzyżowo. Kryształy identyfikuj jako gęsto upakowane błyszczące cząsteczki lub, w przypadku mniejszego rozmiaru kryształów, jako jednolity blask emitowany przez filament LCP.

Włożyć szczelnie zamknięte strzykawki z powrotem do torby i przechowywać w temperaturze 20 °C do późniejszego użycia. Etap miareczkowania lipidów jest niezbędny, aby wchłonąć nadmiar roztworu wytrącającego i zapobiec zamarzaniu lipidów podczas wstrzykiwania w wiązkę rentgenowskiego laseru elektronowego. Około jednej godziny przed rozpoczęciem zbierania danych wyjąć strzykawki z próbkami z inkubatora ustawionego na 20 °C.

Wybierz od dwóch do czterech strzykawek do konsolidacji próbek, kierując się podobnym wyglądem kryształów oraz zbliżonymi warunkami krystalizacji. Ostrożnie usuń uszczelnienie z Parafilmu z wybranych strzykawek. Zdejmij łącznik strzykawki i przymocuj czystą, wymienną igłę do pierwszej wybranej strzykawki.

Powoli i delikatnie pchnij tłok do przodu, aby wycisnąć czynnik wytrącający przez igłę do probówki do mikrocentryfugi. Zachowaj ostrożność na tym etapie, ponieważ zastosowanie zbyt dużego nacisku na tłok może spowodować wypchnięcie części LCP zawierającego kryształy wraz z roztworem czynnika wytrącania, co doprowadzi do częściowej lub całkowitej utraty próbki. Przerwij ruch tłoka, gdy większość czynnika wytrącania zostanie usunięta, a LCP zgromadzi się przy wjściu do igły.

Wykonaj ten proces dla pozostałych wybranych strzykawek. Aby połączyć otrzymane próbki LCP, połącz dwie strzykawki za pomocą czystej złączki. Naciśnij tłok w jednej strzykawce, aby przenieść całą próbkę z jednej strzykawki do drugiej.

Odłącz pustą strzykawkę. Powtarzaj ten krok, aż cały materiał LCP zawierający kryształy zostanie zgromadzony w jednej strzykawce. Usuń jak największą ilość osadnika.

Do pustej strzykawki należy dodać około 5 µL 7.9 MAG lub pierwotnego lipidu gospodarza MAG o krótszym łańcuchu. Strzykawkę tę należy połączyć ze strzykawką zawierającą skonsolidowaną próbkę za pomocą łącznika do strzykawek, a następnie wymieszać, naprzemiennie naciskając tłoki strzykawek. Proces ten należy powtarzać do czasu wchłonięcia całego pozostałego roztworu i utworzenia się jednorodnej i przezroczystej fazy LCP.

Przenieś całą zmieszaną próbkę LCP do jednej strzykawki i odłącz pustą strzykawkę. Do strzykawki z połączoną próbką przymocuj igłę ładującą wstrzykiwacza LCP. Ostrożnie nanieś około 1 µL próbki LCP na szkiełko przedmiotowe i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.

Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkę, aby zakleszczyć próbkę. Wykonaj zdjęcia próbki LCP pod mikroskopem stereoskopowym przy najwyższym możliwym powiększeniu, stosując oświetlenie w polu jasnym oraz polaryzatory skrzyżowane. Jeśli to możliwe, wykonaj dodatkowe zdjęcia przy użyciu mikroskopu i systemu obrazowania z fluorescencją UV, aby potwierdzić obecność mikrokryształów białka w próbce.

Oszacuj wielkość i gęstość kryształów. Idealna gęstość kryształów dla eksperymentu zbierania danych będzie zależeć od wielkości kryształów, średnicy wiązki promieni rentgenowskich oraz średnicy strumienia LCP i powinna skutkować częstotliwością trafień kryształów na poziomie około 10 do 40%. Na koniec załaduj injektor LCP i przeprowadź seryjną krystalografię femtosekundową LCP, czyli zbieranie danych LCP SFX, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawione tutaj mikrokryształy receptora serotoninowego w kompleksie z ergotaminą zostały obrazowane w trybie mikroskopu w polu jasnym oraz w trybie mikroskopu polaryzacyjnego z polaryzatorem skrzyżowanym.

Struktura kompleksu receptora serotoninowego z ergotaminą została uzyskana metodą LCP SFX. Przedstawione tutaj mikrokryształy receptora wygładzającego w kompleksie z cyklopaminą zostały zobrazowane przy użyciu mikroskopu w trybie polaryzacyjnym. Struktura kompleksu receptora z cyklopaminą została uzyskana metodą LCP SFX.

Po opanowaniu tej procedury można ją przeprowadzić w mniej niż dwie godziny, pod warunkiem właściwego wykonania. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w strukturę białek błonowych, po niewielkiej modyfikacji może być również zastosowana do innych białek. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na proces odkrywania leków, ponieważ struktury o wysokiej rozdzielczości stanowią doskonałe matryce dla standardowych oddziaływań ligand-białko i pomagają w projektowaniu bardziej efektywnych leków.