Name: Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj szybką jednoetapową syntezę enzymatyczną analogów trehalozy z całkowicie wodnym oczyszczaniem. Ta metoda umożliwia wydajne pozyskiwanie związków do wykrywania bakterii i badań biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu z National Institutes of Health (R15 AI117670) dla B.M.S i P.J.W., a także z Cottrell College Scholar Award od Research Corporation (20185) dla P.J.W. L.M.M. była wspierana przez Provost's Fellowship z CMU.

1. Ekspresja i oczyszczanie TreT z Top10 E. coli
UWAGA: Prosimy o kontakt z autorami w celu uzyskania szczepu E. coli z ekspresją TreT (plazmid pBAD TreT, zawierający gen T. tenax tret pod kontrolą białka AraC, przekształconego w Top10 E. coli 19) oraz towarzyszącej mu umowy o transferze materiału. Poniższy protokół zazwyczaj podaje wydajność białka na poziomie około 4 mg/l.
<ol>
	<li>Przygotuj 3 ml nocnej hodowli E. coli z ekspresją TreT.
	<ol>
		<li>Streak Top10 E. coli transformowane wektorem ekspresyjnym pBAD-TreT na płytce agarowej z bulionu lizogennego (LB) zawierającej 100 μg / ml ampicyliny.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez około 48 godzin.</li>
		<li>Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić 3 ml płynnej pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w probówce hodowlanej.</li>
		<li>Umieścić probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C x 175 obr./min na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukuj ekspresję białka w E. coli wykazującej ekspresję TreT.
	<ol>
		<li>Dodaj 750 ml Terrific Bulth uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny do kolby hodowlanej Fernbacha o pojemności 2,800 ml. Przenieść 1 ml bulionu z kolby do kuwety w celu późniejszego wykorzystania jako ślepa próba.</li>
		<li>Dodać 3 ml kultury wyhodowanej przez noc w kroku 1.1.4 do kolby hodowlanej, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze i wstrząsnąć w temperaturze 37 °C x 200 obr./min. Okresowo sprawdzać absorbancję kultury przy długości fali 600 nm w porównaniu z ślepą próbą zebraną w kroku 1.2.1.</li>
		<li>Gdy absorbancja przy 600 nm osiągnie zakres 0,5-1,0, indukować ekspresję TreT poprzez dodanie 750 μl 1 M roztworu arabinozy (1 mM stężenie końcowe) do hodowli. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze i wytrząsać przez noc w temperaturze 37 °C x 200 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzać i lizować komórki E. coli wykazujące ekspresję TreT. coli.
	<ol>
		<li>Przenieść kulturę do butelki polipropylenowej i wirować przez 15 minut w temperaturze 4000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirowywać przez 15 minut w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i albo przystąpić do lizy komórek (etap 1.3.4), albo przechowywać osad przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Rozpuścić 1 mini tabletkę inhibitora proteazy w 20 ml buforu do przemywania (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8,0) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Przenieść bufor płuczący zawierający inhibitor proteazy do stożkowej probówki zawierającej osad. Wirować, aż granulka zostanie ponownie zawieszona.</li>
		<li>Przenieś ponownie zawieszone komórki do zlewki o pojemności 100 ml i poddaj je lizie za pomocą sonikacji (sekwencja impulsów 45 sekund włączenia, 45 sekund przerwy z czasem pracy 2 minuty i 15 sekund przy amplitudzie 75 procent).</li>
		<li>Przenieść lizat do metalowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i wirować przez 60 minut przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Klarować lizat, przechodząc przez filtr strzykawkowy 0,2-0,45 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Typowe stężenie otrzymanego lizatu wynosi 100 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść TreT z lizatu komórek E. coli za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC).
	<ol>
		<li>Ustaw FPLC z kolumną powinowactwa do niklu (objętość złoża 5 ml). Umyj kolumnę 10 ml wody dejonizowanej lub do momentu, gdy kolumna będzie czysta z wszelkich zanieczyszczeń. Zrównoważyć kolumnę przy użyciu 20 ml buforu do przemywania (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8,0) przy natężeniu przepływu 1 ml/min.</li>
		<li>Załadować lizat (20 ml) otrzymany z kroku 1.3.8 do kolumny i wymyć nieoznakowane białka buforem do przemywania z szybkością przepływu 1 ml/min, aż absorbancja osiągnie poziom tła (zwykle wymagane jest 80-100 ml buforu do płukania).</li>
		<li>Eluować znakowany przez Hisa TreT za pomocą liniowego gradientu buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazolu, pH 8,0) od 1-100% przez 60 minut przy natężeniu przepływu 1 ml / min. Zebrać 4 ml frakcji, aż TreT zostanie eluowany, a absorbancja osiągnie poziom wyjściowy. 
		UWAGA: Zazwyczaj do wymycia białka potrzeba 60 ml buforu elucyjnego, a białko eluuje w zakresie 60-100% buforu elucyjnego. Otrzymuje się około 10-15 ml czystego TreT w buforze elucyjnym.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie TreT, mierząc absorbancję przy 280 nm w stosunku do ślepej próby buforu elucyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymiana TreT na bufor tris(hydroksymetylo)aminometanowy (Tris) przez dializę.
	<ol>
		<li>Po przygotowaniu rurki do dializy zgodnie z instrukcją producenta należy ją zagruntować poprzez przepłukanie wodą dejonizowaną, a następnie buforem Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).</li>
		<li>Załaduj próbkę TreT do rurki dializacyjnej za pomocą strzykawki i igły. Dializować przez noc w oparciu o 2 litry buforu Tris.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie TreT, mierząc absorbancję przy 280 nm w stosunku do ślepej próby pobranej z przemywania dializami</li>.
		<li>Przenieść roztwór TreT do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przystąpić do syntezy analogu trehalozy (etap 2) lub przechowywać enzym w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: TreT jest białkiem termostabilnym. TreT był przechowywany w buforze Tris w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, nie obserwując znaczącej utraty aktywności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Jednoetapowa synteza analogów trehalozy przy użyciu enzymu TreT
UWAGA: Poniższy protokół opisuje skalę reakcji opartą na objętości 4 ml, która może dostarczyć około 15-30 mg analogu trehalozy w zależności od wydajności reakcji i masy cząsteczkowej produktu. Składniki reakcji można skalować, aby w razie potrzeby uzyskać mniej lub więcej analogu trehalozy.
<ol>
	<li>Dodaj analog glukozy (0,080 mmol, masa zależy od masy cząsteczkowej), UDP-glukoza (0,160 mmol, 97,6 mg) i MgCl2 (0,080 mmol, 16,3 mg) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Końcowe stężenia tych składników wynoszą odpowiednio 20 mM, 40 mM i 20 mM.</li>
	<li>Dodać TreT do buforu Tris (otrzymanego z kroku 1.5.4) i, jeśli to konieczne, odpowiednią objętość buforu Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0), aby uzyskać końcowe stężenie enzymu 300 μg/ml i końcową objętość 4 ml. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół lub odwrócić probówkę, aby rozpuścić ciała stałe.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 70 °C z wytrząsaniem przy 300 obr./min przez 1 godzinę, następnie umieścić probówkę na lodzie do ostygnięcia.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie analogów trehalozy z surowej mieszaniny reakcji enzymatycznych
<ol>
	<li>Wstępnie przepłukać odśrodkową jednostkę filtrującą (nominalna masa cząsteczkowa graniczna (NWML) 10 kDa) w celu usunięcia śladowych ilości glicerolu z membrany, dodając 3 ml dejonizowanej wody do odśrodkowego zespołu filtrującego i odwirowując przy 3 000 x g, aż cała ciecz przejdzie przez filtr do rurki (około 20 min). Powtórz jeszcze dwa razy. Wykonaj ten krok bezpośrednio przed lub w trakcie reakcji (krok 2.3).</li>
	<li>Po schłodzeniu mieszaniny reakcji enzymatycznej (otrzymanej z kroku 2.3) przenieść ją do wstępnie przepłukanego filtra odśrodkowego. Przepłukać probówkę reakcyjną 1 ml wody dejonizowanej i przenieść do filtra odśrodkowego. Powtórzyć płukanie probówki reakcyjnej w celu maksymalnego odzysku produktu.</li>
	<li>Odwirować filtr odśrodkowy przy 3 000 x g, aż cała ciecz przejdzie przez filtr do rurki (około 20 minut). Przepłukać górną komorę filtra odśrodkowego 3 ml wody dejonizowanej i odwirować przy 3 000 x g, aż cała ciecz przejdzie przez filtr do rurki (około 20 minut). Powtórz płukanie, aby uzyskać maksymalny odzysk produktu.</li>
	<li>Wyrzuć górną komorę filtra odśrodkowego. Dodać żywicę jonowymienną ze złożem mieszanym (3 g) do filtratu na dnie probówki (typowa objętość filtratu wynosi 8-15 ml w zależności od liczby płukań). Mieszać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę za pomocą mieszadła magnetycznego z prędkością wystarczającą do utrzymania kulek żywicy zawieszonych w roztworze.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i przefiltrować go w celu usunięcia żywicy. Dodaj 5 ml wody dejonizowanej, aby spłukać pozostałą żywicę. Zdekantować supernatant i przefiltrować go, łącząc go z roztworem produktu z pierwszej dekantacji. Powtórz płukanie żywicy, aby uzyskać maksymalny odzysk produktu.</li>
	<li>Przeanalizować reakcję za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub HPLC w celu określenia, czy osiągnięto pełną konwersję materiału wyjściowego analogu glukozy do produktu analogu trehalozy. Patrz krok 4.1 dla analizy TLC i krok 4.2 dla analizy HPLC.</li>
	<li>Usuń wodę przez liofilizację lub odparowanie obrotowe, aby uzyskać wysuszony produkt. Jeżeli podczas analizy TLC lub HPLC nie zaobserwowano nieprzereagowanego analogu glukozy, oczyszczanie chromatograficzne nie jest konieczne. Zważyć produkt w celu uzyskania wydajności reakcji i przeprowadzić analizę spektroskopową magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) (krok 4.3) w celu potwierdzenia struktury i czystości produktu.</li>
	<li>Jeśli podczas analizy TLC zaobserwowano nieprzereagowany analog glukozy, należy go oddzielić od analogu trehalozy za pomocą kolumny wykluczającej rozmiar.
	<ol>
		<li>Przygotuj kolumnę o wymiarach 1 x 100 cm zawierającą dejonizowane, nasycone wodą, bardzo drobne media wykluczające wielkość kulki poliakryloamidu P2 zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Kolumna wykluczająca rozmiar może być ponownie użyta po umyciu wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Ponownie rozpuścić wysuszony produkt reakcji enzymatycznej (otrzymany z kroku 3.7) w 0,5 ml wody dejonizowanej. Zastosuj roztwór produktu do kolumny wykluczającej rozmiar ręcznie lub za pomocą adaptera przepływu kolumny. Przepłucz fiolkę, w której znajdował się surowy produkt, innym 0,5 ml wody dejonizowanej i załaduj ją do kolumny wykluczającej rozmiar.</li>
		<li>Eluować produkt wodą dejonizowaną za pomocą przepływu grawitacyjnego i zebrać frakcje o objętości około 2 ml.</li>
		<li>Przeanalizuj ułamki za pomocą TLC (krok 4.1). Zebrać frakcje zawierające czysty analog trehalozy.</li>
		<li>Usuń wodę przez liofilizację lub odparowanie obrotowe, aby uzyskać wysuszony produkt. Zważyć produkt w celu uzyskania wydajności reakcji i przejść do analizy NMR (patrz krok 4.3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza produktów analogowych trehalozy
<ol>
	<li>Przeprowadzić analizę chromatografii cienkowarstwowej (TLC) reakcji TreT. 
	UWAGA: Ta procedura może być również używana do analizowania ułamków kolumny wykluczającej rozmiar. Może być konieczne zagęszczenie mieszaniny reakcyjnej lub frakcji kolumnowych przed analizą TLC w celu zaobserwowania barwienia związków na płytce TLC.
	<ol>
		<li>Zaznaczyć ołówkiem pasy na powierzchni płytki TLC i nanieść analit(-y) oraz odpowiedni wzorzec (wzorce) na odpowiednie paski, w tym wzorzec analogu glukozy, wzorzec analogu trehalozy (jeśli jest dostępny), mieszaninę reakcyjną (lub frakcje zebrane z oczyszczania kolumny wykluczającej rozmiar) i plamkę dodatkową. Po nałożeniu każdej próbki na płytkę TLC, pozostaw płytkę do wyschnięcia. 
		UWAGA: Do analizy reakcji zwykle na płytkę TLC nakłada się 2 μl próbki.</li>
		<li>Wywołaj płytkę TLC przy użyciu n-butanolu/etanolu/wody dejonizowanej (5:3:2).</li>
		<li>Wysuszyć rozwiniętą płytkę TLC, a następnie zanurzyć ją w 5% H2SO4 w etanolu (plama cukrowa) i podgrzać na gorącej płycie na wysokim ustawieniu, aż będzie można zobaczyć plamy zawierające cukier (zwykle 5 min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić analizę HPLC mieszanin reakcyjnych TreT przy użyciu dowolnego systemu HPLC zdolnego do oddzielania i wykrywania węglowodanów. Protokół ten obejmuje separację węglowodanów za pomocą kolumny aminopropylowej HPLC i detekcję za pomocą indeksu refrakcji.
	<ol>
		<li>Przymocować do HPLC kolumnę aminopropylową (4,6 x 250 mm) zawierającą osłonę kolumny wstępnej.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę aminopropylową z 80% acetonitrylem w wodzie dejonizowanej przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min.</li>
		<li>Załadować roztwór produktu reakcji (lub wzorca) na kolumnę aminopropylową.</li>
		<li>Eluować produkt (lub wzorzec) 80% acetonitrylem w wodzie dejonizowanej przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min i temperaturze kolumny 50 °C. Zazwyczaj stosuje się czas pracy 40 min. 
		UWAGA: Zarówno materiał wyjściowy analogu glukozy, jak i produkt analogowy trehalozy można wykryć za pomocą współczynnika załamania światła, chociaż można zastosować inne metody, takie jak wykrywanie rozpraszania światła przez parowanie (ELSD). W opisanych warunkach analogi glukozy zazwyczaj eluują się w ciągu 10-15 minut, a analogi trehalozy w ciągu 15-25 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza NMR oczyszczonych analogów trehalozy.
	<ol>
		<li>Rozpuścić oczyszczony analog trehalozy w D2O (700 μl) i przenieść roztwór do probówki NMR.</li>
		<li>Uzyskaj widma 1 H i 13C NMR zgodnie z odpowiednimi protokołami obiektu NMR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zastosowanie analogów trehalozy syntetyzowanych przez TreT do wykrywania prątków
<ol>
	<li>Syntetyzować, oczyszczać i podawać 6-TreAz do M. smegmatis (Msmeg).
	<ol>
		<li>Dodaj 6-azydo-6-deoksyglukopiranozę (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glukozę (0,040 mmol, 24,4 mg) i MgCl2 (0,020 mmol, 4,1 mg) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać TreT do buforu Tris (otrzymanego z kroku 1.5.4), aby uzyskać końcowe stężenie enzymu 300 μg/ml i końcową objętość 1 ml. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół lub odwrócić probówkę, aby rozpuścić ciała stałe.</li>
		<li>Inkubować reakcję w temperaturze 70 °C, wytrząsając przez 15 minut.</li>
		<li>Rozcieńczyć enzymatyczną mieszaninę reakcyjną 3 ml wody dejonizowanej i przenieść ją do wstępnie umytego filtra odśrodkowego (NMWL 10 kDa). Odwirować jednostkę filtrującą przy 3 000 x g, aż większość cieczy przejdzie przez filtr do probówki, około 10 minut.</li>
		<li>Wyrzuć górną komorę filtra odśrodkowego. Dodaj żywicę jonowymienną ze złożem mieszanym (0,75 g) do probówki i mieszaj/wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Zdekantować supernatant i przefiltrować go w celu usunięcia żywicy. 
		UWAGA: Kroki 5.1.1-5.1.5 zapewniają wodny roztwór 6-azydo-trehalozy (6-TreAz) o stężeniu około 5 mM w czasie krótszym niż 1 godzina. Stężenie 5 mM szacuje się na podstawie ilościowej konwersji substratu na produkt i rozcieńczenia, które ma miejsce podczas etapów oczyszczania, przy założeniu minimalnych strat produktu na tych etapach. W razie potrzeby roztwór można sterylnie przefiltrować przed dodaniem do próbki biologicznej.</li>
		<li>Dodać odpowiednią objętość roztworu produktu 6-TreAz do logarytmicznej hodowli M. smegmatis (Msmeg), zazwyczaj w celu uzyskania końcowej objętości kultury 100-1000 μL i końcowego stężenia 6-TreAz ~25 μM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez żądany czas, zwykle 60 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj chemię kliknięcia, aby skoniugować fluorofor z komórkami znakowanymi azydkiem. W tym protokole należy użyć cykloaddycji azydkowo-alkinowej katalizowanej Cu (CuAAC), aby dostarczyć fluorofor do azydków na powierzchni komórki w Msmeg.
	<ol>
		<li>Odwirować komórki przy stężeniu 3 900 x g przez 5 minut, a następnie przepłukać komórki PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej. Powtórz dwa razy.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulowane komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS, aby je utrwalić. Po 10 minutach inkubacji powtórzyć krok 5.2.1 w celu umycia komórek.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulowane komórki w 138 μl PBS.</li>
		<li>Dodać 3 μl 1 mM roztworu podstawowego alkino-karboksyrodaminy 110 (alkino-488) w DMSO.</li>
		<li>Dodać 3 μl świeżo przygotowanego 60 mM roztworu podstawowego askorbinianu sodu do wody dejonizowanej.</li>
		<li>Dodać 3 μl 6,4 mM roztworu podstawowego tris[(1-benzylo-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminy (TBTA) w tert-butanolu/dimetylosulfotlenku (DMSO) 4:1.</li>
		<li>Dodać 3 μl 50 mM roztworu podstawowego CuSO4 do wody dejonizowanej.</li>
		<li>Pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół, a następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Powtórz krok 5.2.1, aby umyć komórki. Ponownie zawiesić komórki w 150 μl PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj analizę fluorescencji komórkowej. W tym protokole użyj mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji fluorescencji komórkowej znakowanego Msmeg.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl komórek bakteryjnych zawieszonych w PBS do szkiełka mikroskopowego i delikatnie rozprowadzić płyn cienką warstwą za pomocą krawędzi szkiełka nakrywkowego. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w ciemności.</li>
		<li>Na wysuszoną próbkę dodać 10 μl podłoża montażowego, następnie nałożyć na próbkę szkiełka nakrywkowe i nałożyć klej (np. lakier do paznokci) w celu unieruchomienia.</li>
		<li>Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 100-krotnym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+on+trehalose%3A+a+multifunctional+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">New insights on trehalose: a multifunctional molecule.</a> Glycobiology. 13, 17-27 (2003).</li>
<li>Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+trehalose+in+pathogenicity%3A+some+general+rules%2C+yet+many+exceptions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions.</a> PLoS Pathog. 9, 1003447(2013).</li>
<li>Ohtake, S., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose%3A+Current+use+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trehalose: Current use and future applications.</a> J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).</li>
<li>Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222463216_Comparison_of_free_sugars_in_growing_and_desiccated_plants_of_Selaginella_lepidophylla">Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla.</a> Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).</li>
<li>Kubota, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKubota%2C+M+%22Glycoenzymes%22">Glycoenzymes</a>. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).</li>
<li>Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+analogues%3A+latest+insights+in+properties+and+biocatalytic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).</li>
<li>Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229148606_Enzymatic_synthesis_of_a_galactose-containing_trehalose_analogue_disaccharide_by_Pyrococcus_horikoshii_trehalose-synthesizing_glycosyltransferase_Inhibitory_effects_on_several_disaccharidase_activitie">Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities.</a> J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).</li>
<li>Backus, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+unnatural+trehalose+analogs+as+a+reporter+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).</li>
<li>Swarts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mycobacterial+trehalome+with+bioorthogonal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).</li>
<li>Rose, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+trehalose+analogs+as+potential+inhibitors+of+mycobacterial+cell+wall+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis.</a> Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+trehalose-based+compounds+and+their+inhibitory+activities+against+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis.</a> Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).</li>
<li>Gobec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis%2C+biochemical+evaluation+and+antimycobacterial+action+of+phosphonate+inhibitors+of+antigen+85C%2C+a+crucial+enzyme+involved+in+biosynthesis+of+the+mycobacterial+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall.</a> Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).</li>
<li>Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/264303743_ChemInform_Abstract_Regioselective_Protection_and_Functionalization_of_Trehalose">Regioselective protection and functionalization of trehalose.</a> Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).</li>
<li>Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).</li>
<li>Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+studies+toward+Mycobacterium+tuberculosis+sulfolipid-I%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I.</a> J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).</li>
<li>Chaen, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273977592_Efficient_Enzymatic_Synthesis_of_Disaccharide_ALPHA-D-Galactosyl_ALPHA-D-Glucoside_by_Trehalose_Phosphorylase_from_Thermoanaerobacter_brockii">Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii.</a> J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).</li>
<li>Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+acceptor+specificity+of+trehalose+phosphorylase+for+the+production+of+trehalose+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Progr%22%5BJournal%5D)">Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs.</a> Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).</li>
<li>Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+trehalose+synthesizing+pathway+in+the+hyperthermophilic+Crenarchaeon+Thermoproteus+tenax%3A+the+unidirectional+TreT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway.</a> Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).</li>
<li>Urbanek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+trehalose+analogues%3A+rapid+access+to+chemical+probes+for+investigating+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria.</a> ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+Huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28I%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li>
<li>Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose-recycling+ABC+transporter+LpqY-SugA-SugB-SugC+is+essential+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analogi trehalozy mogą mieć wpływ na różne dziedziny, od konserwowania żywności i farmaceutyków po diagnostykę i leczenie zakażeń mikrobiologicznych 6. Istniejące wieloetapowe metody syntezy chemicznej są przydatne do wytwarzania złożonych analogów trehalozy z wieloma miejscami modyfikacji (np. naturalnie występującymi złożonymi glikolipidami prątków). Jednak metody te są niezmiennie długotrwałe i nieefektywne, nawet gdy są stosowane do syntezy stosunkowo prostych monopodstawionych analog...

Trehaloza jest symetrycznym, nieredukującym disacharydem składającym się z dwóch reszt glukozy połączonych wiązaniem 1,1-α,α-glikozydowym (Rysunek 1A). Chociaż trehaloza nie występuje u ludzi i innych ssaków, jest powszechnie spotykana u bakterii, grzybów, roślin i bezkręgowców 1. Główną rolą trehalozy w większości organizmów jest ochrona przed stresami środowiskowymi, takimi jak odwodnienie 1. Ponadto niektóre ludzkie patogeny wymagają trehalozy do przejawiania wirulencji, w tym wywołująca gruźlicę Mycobacterium tuberculosis, która wykorzystuje trehalozę jako mediator biosyntezy otoczki komórkowej oraz jako blok budulcowy do konstrukcji immunomodulujących glikolipidów 2.
<img alt="Schemat strukturalny trehalozy i jej analogów; modyfikacje chemiczne w celu zwiększenia stabilności lub poprawy detekcji." src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Trehaloza i analogi trehalozy. (A) Struktury naturalnej trehalozy oraz nienaturalnego analogu trehalozy, gdzie X oznacza modyfikację strukturalną. (B) Przykłady analogów trehalozy opisanych w literaturze, które mają potencjalne zastosowania w biokonserwacji i obrazowaniu biologicznym.
Ze względu na swoją unikalną strukturę i funkcje fizjologiczne, trehaloza przyciągnęła znaczną uwagę w kontekście zastosowań bio(techno)logicznych i biomedycznych 3. Właściwości ochronne trehalozy obserwowane w naturze — np. jej niezwykła zdolność do pomagania w utrzymaniu życia w roślinach „zmartwychwstających”, które przeszły ekstremalne odwodnienie 4 — skłoniły do jej szerokiego zastosowania w biokonserwacji. Trehaloza była wykorzystywana do konserwacji szerokiej gamy próbek biologicznych, takich jak kwasy nukleinowe, białka, komórki i tkanki 3. Na przykład trehaloza jest stosowana jako dodatek stabilizujący w wielu dostępnych na rynku produktach farmaceutycznych, w tym w kilku przeciwnowotworowych przeciwciałach monoklonalnych 3. Ponadto trehaloza jest używana jako słodzik w przemyśle spożywczym i jest szeroko stosowana do konserwacji produktów zarówno w przemyśle spożywczym, jak i kosmetycznym. Wprowadzenie trehalozy do tego typu zastosowań komercyjnych było początkowo ograniczone przez brak możliwości pozyskania dużych ilości czystej trehalozy ze źródeł naturalnych lub poprzez syntezę. Ostatnio jednak opracowano wydajny proces enzymatyczny do ekonomicznej produkcji trehalozy ze skrobi, co przyczyniło się do jej powszechnego zastosowania komercyjnego 5.
Chemicznie zmodyfikowane pochodne trehalozy, nazywane w niniejszym opracowaniu analogami trehalozy, zyskują coraz większą uwagę w kontekście różnorodnych zastosowań (ogólna struktura przedstawiona na Rysunku 1A; konkretne przykłady analogów trehalozy przedstawione na Rysunku 1B) 6. Na przykład lakto-trehaloza jest analogiem trehalozy, w którym jedna z jednostek glukozy została zastąpiona galaktozą, w związku z czym grupa hydroksylowa w pozycji 4 posiada odwróconą konfigurację stereochemiczną. Lakto-trehaloza wykazuje takie same właściwości stabilizujące jak trehaloza, lecz jest odporna na degradację przez enzymy jelitowe, co czyni ją atrakcyjną jako bezkaloryczna dodatka do żywności 6, 7.
Zainteresowanie naszej grupy analogami trehalozy wiąże się przede wszystkim z ich wartością jako sond i inhibitorów specyficznych dla prątków. Grupy Barry'ego i Davisa opracowały koniugowany z fluoresceiną analog keto-trehalozy, nazwany FITC-keto-trehalose, który wykazał zdolność do metabolicznego znakowania ściany komórkowej żywych M. tuberculosis, umożliwiając jego wykrycie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej 8. Laboratorium Bertozzi opracowało mniejsze analogi azydotrehalozy (TreAz), które mogły metabolicznie znakować ścianę komórkową, a następnie zostać wykryte przy użyciu chemii klik i analizy fluorescencyjnej 9. Postępy te wskazują na możliwość wykorzystania sond opartych na trehalozie jako środków diagnostyki obrazowej gruźlicy. Analogi trehalozy były również badane jako inhibitory M. tuberculosis ze względu na ich potencjał do zaburzania szlaków w bakterii, które są niezbędne dla jej żywotności i wirulencji 10,11,12.
Do tej pory główną przeszkodą w opracowywaniu analogów trehalozy do zastosowań bio(techno)logicznych i biomedycznych był brak wydajnych metod syntetycznych. Dwie tradycyjne drogi otrzymywania analogów trehalozy opierają się na syntezie chemicznej (Rycina 2). Jedna z dróg polega na desymetryzacji/modyfikacji naturalnej trehalozy, natomiast druga polega na rozpoczęciu procesu od odpowiednio funkcjonalizowanych monosacharydowych bloków budulcowych i przeprowadzeniu glikozylowania chemicznego w celu utworzenia wiązania 1,1-α,α-glikozydowego. Podejścia te, omówione niedawno w artykułach przeglądowych 13, 14, okazały się przydatne w wieloetapowej syntezie niewielkich ilości złożonych naturalnych produktów zawierających trehalozę, takich jak sulfolipid-1 z M. tuberculosis 15. Jednak oba podejścia są zazwyczaj niewydajne, czasochłonne, niedostępne dla osób niebędących chemikami, a dodatkowo nie są uważane za przyjazne dla środowiska. Zatem w przypadku syntezy niektórych typów analogów trehalozy strategie te nie są idealne.
<img alt="Synteza chemiczna i enzymatyczna analogów trehalozy; schemat ze ścieżkami reakcji i modyfikacjami." src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Metody syntezy analogów trehalozy. Metody chemiczne syntezy analogów trehalozy, przedstawione po lewej stronie, wykorzystują wieloetapowe procedury obejmujące trudne kroki ochrony/deprotekcji, desymetryzacji i/lub glikozylacji. Synteza enzymatyczna, przedstawiona po prawej stronie, wykorzystuje enzymy do stereoselektywnej konwersji prostych, niechronionych substratów w analogi trehalozy w roztworze wodnym. Opisany tutaj protokół enzymatyczny wykorzystuje enzym syntazę trehalozy (TreT) do konwersji analogów glukozy i UDP-glukozy w analogi trehalozy w jednym kroku. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">Kieruj się tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wydajna droga biokatalityczna do analogów trehalozy ułatwiłaby produkcję, ocenę i zastosowanie tej obiecującej klasy cząsteczek. Choć komercyjny proces enzymatyczny produkcji trehalozy5 nie nadaje się do syntezy analogów, ponieważ wykorzystuje skrobię jako substrat, w naturze istnieją inne szlaki biosyntezy, które można wykorzystać do syntezy analogów trehalozy. Jednak badania w tym obszarze, które zostały niedawno omówione w przeglądzie 6, były ograniczone. W jednym raporcie wykorzystano metodę inspirowaną szlakiem biosyntezy trehalozy u Escherichia coli w celu otrzymania pojedynczego analogu fluoro-trehalozy z odpowiadającej mu fluoro-glukozy. Podejście to wymaga jednak trójenzymowego układu o ograniczonej wydajności i uniwersalności 8. Innym badanym podejściem jest wykorzystanie trehalozofosforylazy (TreP) w kierunku odwrotnym, co w zasadzie pozwala na jednokrokową syntezę analogów trehalozy z analogów glukozy i glukozo-1-fosforanu 6, 16, 17. Chociaż podejście to może być obiecujące w przyszłości, zarówno inwertujące, jak i retencyjne TreP wykazują obecnie wady w syntezie analogów. Na przykład inwertujące TreP wymagają niezwykle kosztownej cząsteczki donora (β-D-glukozo-1-fosforanu), a retencyjne TreP charakteryzują się niską wydajnością ekspresji enzymu/stabilnością oraz ograniczoną promiskuitetnością substratową. Zanim synteza analogów wspomagana przez TreP stanie się praktyczna, konieczne będą znaczące ulepszenia (np. poprzez inżynierię enzymatyczną).
Obecnie najbardziej praktycznym podejściem do enzymatycznej syntezy analogów trehalozy jest zastosowanie enzymu syntazy trehalozy (TreT), który przekształca glukozę i glukozę z urydynodifosforanem (UDP-glukozę) w trehalozę w jednym etapie 6. Niedawno zgłosiliśmy zastosowanie TreT z Thermoproteus tenax — enzymu termostabilnego i jednokierunkowego 18 — do syntezy analogów trehalozy z analogów glukozy i UDP-glukozy (Rysunek 3) 19. Enzym ten działa wyłącznie w kierunku syntetycznym, co pozwala uniknąć problemu degradacji trehalozy występującego w systemie TreP. Ta jednowzorowa reakcja może zostać ukończona w ciągu 1 godziny, a szeroka gama analogów trehalozy została uzyskana z wysoką wydajnością (do &gt;99% w analizie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)) z łatwo dostępnych substratów będących analogami glukozy (patrz Tabela 1 w sekcji Wyniki Reprezentatywne).
<img alt="Schemat konwersji UDP-glukozy do analogów trehalozy przy użyciu enzymu TreT w 70°C w celu glikozylacji." src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Jednostopniowa synteza analogów trehalozy katalizowana przez TreT. Enzym TreT z T. tenax może stereoselektywnie łączyć łatwo dostępne analogi glukozy i UDP-glukozę, tworząc analogi trehalozy w jednym etapie. R1-R4 = zmienna modyfikacja strukturalna, np. modyfikacje azydowe, fluorowe, deoksy-, tio-, stereochemiczne lub znakowanie izotopowe; Y = zmienny heteroatom, np. tlen lub siarka, bądź heteroatom znakowany izotopowo.
W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół procesu syntezy TreT, obejmujący ekspresję i oczyszczanie TreT z E. coli, zoptymalizowane warunki reakcji TreT oraz ulepszoną metodę oczyszczania prowadzoną w całości w fazie wodnej. Ten zmodyfikowany protokół umożliwia szybką i wydajną syntezę oraz oczyszczanie różnorodnych analogów trehalozy w skali półpreparatywnej (10-100 mg). Demonstrujemy również zastosowanie tego protokołu do przygotowania i podania sondy na bazie trehalozy prątkom w czasie krótszym niż 1 godzina, co umożliwiło szybką detekcję fluorescencyjną komórek prątków.

<table><tbody><tr><td>Agar LB</td><td>Research Products International</td><td>L24021</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria</td><td>Research Products International</td><td>L24045</td><td></td></tr><tr><td>Terrific</td><td>Bulion Research Products International</td><td>T15050</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30256</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 0,45 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09719D</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy minitabletki, wolne od EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna powinowactwa do niklu HisTrap HP, 5 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base ultrapure</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy, MWCO 12&ndash; 14 000</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-16</td><td></td></tr><tr><td>Analogi glukozy</td><td>CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td><td></td><td>Przykłady dostawców, którzy oferują wiele analogów glukozy</td></tr><tr><td>6-Azido-6-deoksyglukopiranoza (6-GlcAz)</td><td>CarboSynth</td><td>MA02620</td><td></td></tr><tr><td>UDP-Glukoza</td><td>abcam Biochemicals</td><td>ab120384</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 filtr odśrodkowy</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rex RG 501-X8 żywica jonowymienna ze złożem mieszanym</td><td>Bio-Rad</td><td>444-9999</td><td></td></tr><tr><td>Extra-Fine Bio-Gel P2 media</td><td>Bio-Rad</td><td>150-4118</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do chromatografii cienkowarstwowej z żelem krzemionkowym na bazie szkła</td><td>EMD Millipore</td><td>1056280001</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>EMD Milipore</td><td>AX0145</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru, 99,8%</td> <td>Acros Organics</td><td>351430075</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna aminopropylowa HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58338</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Para-formaldehyd</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Alkine-488</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761621</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metylo]amina (TBTA)</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Podłoże montażowe</td><td>Southern Biotechnology</td><td>10001</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Chemicznie modyfikowane wersje trehalozy, lub analogi trehalozy, mają zastosowanie między innymi w biologii, biotechnologii i naukach farmaceutycznych. Na przykład analogi trehalozy z wykrywalnymi znacznikami były używane do wykrywania Mycobacterium tuberculosis i mogą mieć zastosowanie jako środki do diagnostyki obrazowej gruźlicy. Poszukiwane są również hydrolitycznie stabilne wersje trehalozy ze względu na ich potencjał do stosowania jako bezkaloryczne substancje słodzące i środki bioprotekcyjne. Pomimo atrakcyjności tej klasy związków do różnych zastosowań, ich potencjał pozostaje niewykorzystany ze względu na brak solidnej drogi ich produkcji. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół szybkiej i wydajnej jednoetapowej syntezy biokatalitycznej analogów trehalozy, który omija problemy związane z syntezą chemiczną. Dzięki wykorzystaniu termostabilnego enzymu syntazy trehalozy (TreT) firmy Thermoproteus tenax, analogi trehalozy mogą być generowane w jednym kroku z analogów glukozy i glukozy difosforanu urydyny z wysoką wydajnością (do konwersji ilościowej) w ciągu 15-60 minut. Prosty i szybki protokół oczyszczania niechromatograficznego, który składa się z dializy spinowej i wymiany jonowej, może dostarczyć wiele analogów trehalozy o znanym stężeniu w roztworze wodnym w ciągu zaledwie 45 minut. W przypadkach, gdy nadal pozostaje nieprzereagowany analog glukozy, można przeprowadzić chromatograficzne oczyszczanie produktu analogu trehalozy. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta zapewnia "zieloną" platformę biokatalityczną do przyspieszonej syntezy i oczyszczania analogów trehalozy, która jest wydajna i dostępna dla osób niebędących chemikami. Aby zilustrować możliwość zastosowania tej metody, opisujemy protokół syntezy, całkowicie wodnego oczyszczania i podawania prątkom sondy chemicznej na bazie trehalozy, z których wszystkie zajęły mniej niż 1 godzinę i umożliwiły wykrywanie fluorescencji prątków. Przewidujemy, że w przyszłości protokół ten będzie mógł, między innymi, znaleźć zastosowanie do szybkiej syntezy sond na bazie trehalozy do diagnostyki gruźlicy. Na przykład krótkożyciowe analogi trehalozy modyfikowane radionuklidami (np. 18trehaloza modyfikowana F) mogą być wykorzystywane do zaawansowanych metod obrazowania klinicznego, takich jak pozytonowa tomografia emisyjna i tomografia komputerowa (PET-CT).

T. tenax TreT otrzymano z *E. coli* z wydajnością około 4 mg/L, stosując standardowe techniki ekspresji i oczyszczania białek. Pojedynczy etap chromatografii powinowactwa do niklu był wystarczający do oczyszczenia TreT z *E. coli* lizat (reprezentatywny zapis z FPLC przedstawiono w Rycina 4). Jak ustalono w naszej pierwszej publikacji na temat procesu syntezy TreT, rekombinowany T. tenax TreT jest w stanie z wysoką wydajnością przekszta...

Analogi trehalozy stają się ważnymi cząsteczkami do zastosowań bio(technicznych)logicznych i biomedycznych. Opisujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej syntezy i oczyszczania analogów trehalozy, który jest prosty, wydajny, szybki i przyjazny dla środowiska. Wykazano jego zastosowanie do szybkiej produkcji i podawania sondy do wykrywania prątków.

Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Ogólnym celem tej metody jest szybka synteza i oczyszczenie analogów trehalozy, które mają możliwe zastosowania w szerokim zakresie, od wykrywania bakterii chorobotwórczych po konserwację materiałów biologicznych. Jest to szybka i wysokowydajna metoda, która zapewnia dostęp do analogów trehalozy disacharydowej. Związki te mają różne ugruntowane i pojawiające się zastosowania w badaniach biomedycznych i biotechnologicznych.Metoda ta składa się z jednoetapowej syntezy enzymatycznej i oczyszczania całkowicie wodnego. Łącznie procedury te pomagają rozwiązać niektóre z wad tradycyjnych syntez chemicznych analogów trehalozy, które mogą być długotrwałe, mało wydajne i niekorzystne dla środowiska. Implikacje tej metody mogą rozciągać się w kierunku badania i diagnozowania gruźlicy, ponieważ zmodyfikowane analogi trehalozy zostały wykorzystane do obrazowania gruźlicy drobnoustrojów, czynnika wywołującego gruźlicę.Metoda ta może również pomóc w przyspieszeniu syntezy i oceny analogów trehalozy pod kątem innych możliwych zastosowań, takich jak konserwacja produktów biologicznych i stosowanie jako bezkaloryczne substancje słodzące. Przed rozpoczęciem zabiegu należy przygotować przez noc posiew E. coli wykazującej ekspresję TreT. Aby rozpocząć procedurę ekspresji TreT, należy umieścić 750 mililitrów pożywki wzrostowej TB w kolbie hodowlanej Fernbacha o pojemności 2 800 mililitrów i sterylizować w autoklawie.Dodaj ampicylinę do bulionu, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 mikrogramów na mililitr. Zaopatrzyć się w kuwety do spektroskopii UV-vis i napełnić jedną kuwetę bulionem z kolby jako ślepą próbę. Następnie dodać trzy mililitry przygotowanej przez noc kultury E. coli z ekspresją TreT do kolby.Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 200 obr./min. Okresowo sprawdzaj absorbancję bulionu przy 600 nanometrach w stosunku do ślepej próby bulionu. Gdy wartość absorbancji przy 600 nanometrach wynosi od 0,5 do 1,0, dodaj 750 mikrolitrów arabinozy do kolby, aby wywołać ekspresję TreT.Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Następnie umieść kulturę w litrowej polipropylenowej butelce wirówkowej i odwiruj kulturę w temperaturze 4 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki wirówkowej i odwirować w tych samych warunkach. Następnie wyrzuć supernatant i jeśli to konieczne, przechowuj osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozpuść mini tabletkę inhibitora proteazy w 20 mililitrach buforu do płukania.Dodaj roztwór inhibitora proteazy do osadu i wymieszaj mieszaninę, aby ponownie zawiesić osad. Przenieść zawiesinę do zlewki o pojemności 100 mililitrów. Następnie poddaj sonikę zawiesinie, aby zlizować komórki, ustawiając sondę około jednego centymetra od dna zlewki.Umieść lizat w metalowej stożkowej probówce i odwiruj lizat w temperaturze 15 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Przefiltrować lizat za pomocą filtra strzykawkowego. Wyizolować TreT za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek i ocenić czystość za pomocą strony SDS.Następnie zamień TreT na bufor Tris przez dializę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby utworzyć roztwór TreT do syntezy analogu trehalozy. Pobrać ślepą próbę z płukania dializacyjnego. Oznaczyć stężenie TreT za pomocą spektroskopii UV-vis w stosunku do ślepej próby dializy.Aby rozpocząć syntezę 6-azydo-trehalozy przy użyciu TreT w skali od 20 do 30 miligramów, umieść 0,08 milimola 6-azydoglukozy, 0,16 milimola glukozy UDP i 0,08 milimola dichlorku magnezu w stożkowej probówce o średnicy 15 milimetrów. Dodaj bufor TreT i Tris. Rozcieńczyć mieszaninę buforem Tris w razie potrzeby, aby osiągnąć stężenie enzymu 300 mikrogramów na mililitr w końcowej objętości czterech mililitrów.Zakryj i odwróć probówkę, aby rozpuścić ciała stałe. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez godzinę w temperaturze 70 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 300 obr./min. Podczas inkubacji umieść trzy mililitry dejonizowanej wody w 10-kilodaltonowym filtrze odśrodkowym i odwiruj z prędkością 3 000 razy G, aż cała ciecz znajdzie się w probówce.Powtórz pranie jeszcze dwa razy, aby zapewnić dokładne wypłukanie jednostki filtrującej. Po zakończeniu reakcji schłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej na lodzie. Następnie przenieś mieszaninę produktu do odśrodkowego zespołu filtrującego.Przepłukać rurkę reakcyjną trzykrotnie jednym mililitrem wody dejonizowanej i przenieść każde płukanie do filtra odśrodkowego. Odwirować mieszaninę z prędkością 3 000 razy G, aż cała ciecz przejdzie do probówki. Dodaj trzy mililitry wody dejonizowanej do jednostki filtrującej i ponownie odwiruj w tych samych warunkach.W razie potrzeby powtórz płukanie, aby zmaksymalizować odzysk produktu. Dodać trzy gramy żywicy jonowymiennej ze złożem mieszanym do filtratu. Mieszaj mieszaninę z mieszadłem w temperaturze pokojowej przez godzinę.Po wymieszaniu zdekantować i przefiltrować supernatant. Wypłucz żywicę pięcioma mililitrami dejonizowanej wody i przefiltruj płukanie. Powtórz w razie potrzeby, aby zmaksymalizować odzysk produktu i połącz wszystkie filtraty.Zagęścić połączony filtrat. Następnie, aby sprawdzić, czy nie ma przereagowanego prekursora 6-GlcAz, należy przygotować płytkę TLC z żelem krzemionkowym z plamkami 6-GlcAz, 6-TreAz, skoncentrowanym produktem i współplamką. Wywołaj płytkę mieszaniną n-butanolu, etanolu i wody dejonizowanej.Gdy płyta wyschnie, uwidocznij plamy, zanurzając płytkę w 5% kwasie siarkowym i etanolu i podgrzewając płytkę na gorącej płycie na wysokim poziomie przez około pięć minut. W przypadku zaobserwowania nieprzereagowanego prekursora należy oczyścić mieszaninę produktu w kolumnie wykluczającej wielkość i powtórzyć analizę TLC. Po otrzymaniu czystego analogu trehalozy należy usunąć wodę w celu uzyskania wysuszonego produktu 6-TreAz.Stereo enzymu TreT selektywnie łączy analog glukozy i UDP-glukozę, tworząc odpowiedni analog trehalozy. Zakres reakcji obejmuje stereochemiczne modyfikacje deoksyfluoro, tio i azydo. Jednak podstawniki na czwartej pozycji na pierścieniu są gorzej tolerowane.Stosując tę procedurę, analog glukozy 6-GlcAz został ilościowo przekształcony w analog trehalozy 6-TreAz w czasie krótszym niż 60 minut, co potwierdzono w TLC. Czysty produkt wyizolowano za pomocą niechromatograficznej metody oczyszczania jonowego z wymiany jonowej dializy spinowej i scharakteryzowano za pomocą NMR w HPLC. Czysty roztwór 6-TreAz został następnie wykorzystany do przeprowadzenia znakowania azydkowego modelowej bakterii M.smegmatis.Późniejsze znakowanie fluoroforem za pomocą reakcji chemicznej z azydkami na powierzchni komórki wykazało, że M.smegmatis z funkcjonalnym transporterem trehalozy został pomyślnie znakowany azydkami, podczas gdy szczep bez niego nie. Po opanowaniu, reakcję katalizowania TreT, a następnie oczyszczanie, można przeprowadzić w ciągu jednej do czterech godzin, w zależności od liczby zastosowanych etapów płukania, aby zmaksymalizować odzysk produkcji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że produkt reakcji powinien być zawsze analizowany za pomocą NMR i TLC lub HPLC, aby potwierdzić jego czystość i strukturę.Po tej procedurze zsyntetyzowany analog trehalozy może być oceniany lub stosowany jako bakteryjna sonda obrazowa, znacznik metaboliczny, inhibitor enzymu lub środek stabilizujący biomolekuły. Metoda ta umożliwia naukowcom przygotowanie analogów trehalozy z modyfikacjami, takimi jak etykiety stabilnych izotopów lub izotopów promieniotwórczych. Podsumowując, związki dostępne za pomocą tej metody powinny być przydatne w badaniach nad gruźlicą i innych obszarach badań biomedycznych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać i oczyszczać enzym TreT, używać TreT do syntezy analogów trehalozy w jednym kroku i oczyszczać produkty analogowe trehalozy.

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Glikozydy indoksylowe są dobrze znanymi i szeroko stosowanymi narzędziami do badań przesiewowych enzymów i monitorowania aktywności enzymów. Zwłaszcza w przypadku struktur typu glukozy poprzednie syntezy okazały się trudne i mało wydajne. Nasze nowatorskie podejście wykorzystuje estry kwasów indoksylowych jako cenne produkty pośrednie, aby uzyskać znaczną liczbę glikozydów indoksylowych z dobrą wydajnością.

Synteza indoksylglikozydów do wykrywania aktywności glikozydazy

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Ester 2-azydo-1-azotanu może zostać przekształcony w odpowiadający mu 2-azydo-1-trichloroacetimidian w procedurze jednoetapowej. Celem pracy jest wykazanie przydatności reaktora mikrofalowego w syntezie węglowodanów.

Jednodomowa konwersja anomerycznych estrów azotanów do trichloroacetimidianów w jednym garnku wspomagana mikrofalami

Tutaj prezentujemy protokoły syntezy nukleozydów disacharydowych metodą regioselektywnej O-glikozylacji rybonukleozydów poprzez tymczasową ochronę ich ugrupowań 2',3'-diolu za pomocą cyklicznego estru boronowego. Metoda ta ma zastosowanie do kilku niezabezpieczonych nukleozydów, takich jak adenozyna, guanozyna, cytydyna, urydyna, 5-metylurydyna i 5-fluorourydyna, aby uzyskać odpowiednie nukleozydy disacharydowe.

Regioselektywna O-glikozylacja nukleozydów poprzez tymczasową ochronę 2',3'-diolem przez ester boronowy do syntezy nukleozydów disacharydowych

Ten protokół pokazuje, jak używać oprogramowania Auto-CHO do hierarchicznej i programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów. Opisano w nim również ogólną procedurę eksperymentów z oznaczaniem RRV i jednogarnkową glikozylacją SSEA-4.

Hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów

Szczegółowo przedstawiono reprezentatywne procedury eksperymentalne dodawania nukleofilów aminowych do żelaza trikarbonylowego(troponowego) i późniejszej demetalizacji powstałych kompleksów.

Otrzymywanie pochodnych 6-aminocyklohepta-2,4-dien-1-onu za pośrednictwem trikarbonylu (troponu) żelaza

Przemiany CO2 są przeprowadzane w jednoetapowej procedurze syntezy złożonych cząsteczek. Selektywna redukcja CO 2 przez 4 eza pomocą reduktora hydroboranu daje reaktywny i wszechstronny produkt pośredni bis(borylo)acetalu, który jest następnie zaangażowany w reakcję kondensacji lub wytwarzanie sprzężenia C-C za pośrednictwem karbenu.

Wszechstronne przekształcanie emisji CO2 w produkty złożone: jednoetapowa strategia

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Poznaj szybką jednoetapową syntezę enzymatyczną analogów trehalozy z całkowicie wodnym oczyszczaniem. Ta metoda umożliwia wydajne pozyskiwanie związków do wykrywania bakterii i badań biomedycznych.

Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy

Przeglądaj więcej filmów