Name: Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Dowiedz się oceniać skuteczność i toksyczność RNA ukierunkowanych na HIV-1 w komórkach 293T. Ta metoda umożliwia szybki przesiew kandydatów do terapii genowej i lekowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca przedstawiona tutaj była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) (granty DCB-120266, PPP-133377 i HBF-348967 dla A.G.).

1. Komórki i transfekcje
<ol>
	<li>Hodowla komórek HEK 293T w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną. Przygotować zawiesinę 2 x 105 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych. Dodać 500, 100 i 1,000 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 24-dołkowych, 96-dołkowych i 12-dołkowych płytek, odpowiednio do testów produkcji wirusa, żywotności komórek i aktywacji immunologicznej (ryc. 2A).</li>
	<li>Delikatnie zawirować płytki i inkubować je w temperaturze O/N w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Hoduj komórki do 50-70% zbieżności.</li>
	<li>Zgodnie z planem transfekcji przygotuj rozcieńczenia testowych RNA i ich kontroli w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml (przykład, rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Do oznaczania produkcji wirusa należy przygotować rozcieńczenie plazmidu ekspresji HIV-1 o stężeniu 10 ng/μl i dodać 10 μl do każdej probówki. Następnie należy przygotować 5 μM rozcieńczenia testowanych RNA i RNA kontroli ujemnej. Dodać 2,5 lub 10 μl każdego badanego RNA i rozcieńczenia kontroli ujemnej do odpowiednich probówek dla końcowych stężeń 25 lub 100 nM.</li>
		<li>Do oznaczania żywotności komórek należy przygotować 5 μM rozcieńczeń badanych RNA i 10 mg/ml rozcieńczenia RNA kontroli dodatniej, Poly I:C. Dodać 2 μl rozcieńczeń badanego RNA lub RNA kontroli dodatniej do odpowiednich probówek dla końcowych stężeń 100 nM lub 200 μg/ml, odpowiednio.</li>
		<li>Do testu aktywacji immunologicznej dodać 20 μl rozcieńczonego RNA testowego lub RNA kontroli dodatniej przygotowanych w kroku 1.3.2. do odpowiednich probówek dla odpowiednich stężeń końcowych odpowiednio 100 nM lub 200 μg/ml. 
		Uwaga: Do badania plazmidów ekspresji RNA należy przygotować rozcieńczenia 10 ng/μl zamiast 5 μM rozcieńczeń badanych RNA, podając końcowe ilości 25 i 100 ng dla kroku 1.3.1. i 100 ng dla kroków 1.3.2. oraz 1.3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 50, 25 lub 75 μl DMEM do każdej probówki do transfekcji w celu przeprowadzenia testów produkcji wirusa, żywotności komórek i aktywacji immunologicznej. W przypadku testów produkcji wirusa przed kolejnym krokiem należy przynieść komórki i przygotowane probówki do transfekcji do laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3).</li>
	<li>Dodać kolejno 2 μl odczynnika do transfekcji do probówek do transfekcji i inkubować przez 15 do 20 minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnym odczynnikiem do transfekcji, który ma być użyty.</li>
	<li>Dodać kroplami całą mieszaninę transfekcji z każdej mikroprobówki do odpowiednich pozycji na płytkach do hodowli komórkowych. Delikatnie obracać i inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmierz produkcję HIV-1 (sekcja 2), żywotność komórek (sekcja 3) i aktywację immunologiczną (sekcja 4) na płytkach do hodowli komórkowych (ryc. 2C).</li>
</ol>
2. Test produkcji wirusa
<ol>
	<li>Wyjmij 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i delikatnie zakręć płytkami wewnątrz kaptura do hodowli komórkowych BSL3. Przenieść 150 μl supernatantu z każdej studzienki do odpowiadającej jej studzienki w 96-dołkowej płaskiej płytce dennej, która zostanie wykorzystana do ilościowego określenia produkcji HIV-1. 
	Uwaga: Typowe testy ilościowe wirusa obejmują pomiar ekspresji białka kapsydu HIV-1 (p24) za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)20, ilościowe oznaczanie wirusowego RNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)21 oraz pomiar aktywności enzymu RT HIV-1. Kroki od 2.2 do 2.5 wyjaśniają metody ilościowego określania aktywności RT HIV-113,15,16.</li>
	<li>Przenieść 5 μl supernatantu do odpowiednich studzienek na 96-dołkowej płytce, zawierającej 25 μl koktajlu wirusowego15 (Tabela 1). Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść płytkę do stacji roboczej radioaktywności. 
	Uwaga: Krok 2.2. jest konieczne tylko wtedy, gdy stacja robocza do promieniotwórczości nie jest dostępna w laboratorium BSL3. Jeśli płytki nie muszą być usuwane z laboratorium BSL3, przejdź do kroku 2.3. i dodać 50 μl koktajlu radioaktywnego/wirusowego (tabela 1) w miejsce 25 μl koktajlu radioaktywnego.</li>
	<li>Przygotować radioaktywny koktajl15 (Tabela 1) i dodać 25 μl do każdej studzienki supernatantu wirusowego i koktajlu zakłócającego. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Umieścić 5 μl mieszaniny reakcyjnej na odpowiednich kwadratach w bibule z maty filtracyjnej z włókna szklanego Di Ethyl Amino Ethyl (DEAE) i pozostawić plamy do wyschnięcia na 10 minut. Mieszaninę reakcyjną należy rozmieścić na co drugim kwadracie, tak aby żadne dwie próbki nie stykały się bezpośrednio ze sobą. Pomaga to uniknąć krzyżowania się między próbkami podczas określania liczby na minutę (cpm) w kroku 2.6.</li>
	<li>Umyj papiery 5x przez 5 minut 2x buforem z soli fizjologicznej (SSC) (Tabela 1), a następnie dwa 1-minutowe płukanie 95% etanolem. Pozostaw papiery do wyschnięcia i zamknij je w workach na próbki.</li>
	<li>Włożyć worki na próbki zawierające bibułę z matą filtracyjną do kasety i włożyć kasetę do licznika scyntylacyjnego mikropłytek. Ustaw licznik tak, aby odczytywał cpm dla 32P z datą odniesienia podaną dla partii [32P]dTTP użytej w eksperymencie. Wybierz próbki do odczytu, korzystając z mapy płyt i uruchom licznik.</li>
	<li>W przypadku dowolnej metody oznaczania ilościowego wirusa należy podzielić wartości uzyskane dla każdego badanego RNA przez sąsiednią kontrolę ujemną i pomnożyć tę wartość przez 100, aby uzyskać procentowe zahamowanie produkcji HIV-1 dla każdej kontrpróby testowanych RNA. Przykład wyników porównujących różne badane RNA w różnych stężeniach przedstawiono na rysunku 3.</li>
</ol>
3. Test żywotności komórek
<ol>
	<li>Wyjąć 96-dołkowe płytki z inkubatora i dodać 20 μl 5 mg/ml MTT (bromek 3-[4,5-dimetylo-2-tiazolylo]-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowy) rozcieńczonego w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco do każdego dołka. Inkubować płytki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 150 μl zakwaszonego izopropanolu z detergentem (1% NP-40, 4 mM HCl w izopropanolu) do każdego dołka i inkubować płytki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oznaczyć absorbancję przy długości fali 570 nm w spektrofotometrze mikropłytkowym.</li>
	<li>Obliczyć względny metabolizm MTT dla każdej kontroli dodatniej i badać RNA, dzieląc wartość uzyskaną dla każdej próbki przez przylegającą do niej kontrolę transfekcji. Przykład wyników porównujących różne testowane RNA i kontrolę pozytywną przedstawiono na rysunku 4.</li>
</ol>
4. Test aktywacji immunologicznej
<ol>
	<li>Wyjąć 12-dołkowe płytki z inkubatora i odessać pożywkę hodowlaną. Delikatnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS i dodać 70 μl buforu do lizy zimnej22 (w tym inhibitory proteazy i fosfatazy, Tabela 1) do każdej studzienki. Inkubować płytki przez 10 minut na lodzie.</li>
	<li>Przenieś lizaty komórkowe do mikroprobówek i szybko je zamroź, zanurzając probówki w ciekłym azocie. Pozostawić próbki do rozmrożenia i powtórzyć te czynności przez kolejne 2 cykle zamrażania i rozmrażania, w sumie 3.</li>
	<li>Odwirowywać lizaty przez 15 minut w temperaturze 4 °C, 15 700 x g, w celu rozdrobnienia resztek komórek. Przenieść supernatant do nowych mikroprobówek i oznaczyć stężenie białka metodą błękitu Coomassie (Bradford)23,24.</li>
	<li>Rozpuść 75 μg białka z każdej próbki w 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym i przenieś do membrany nitrocelulozowej, jak opisano wcześniej25,26.</li>
	<li>Po elektroforezie i przeniesieniu do membrany należy odsłonić prążki białkowe poprzez inkubację błony w Pąsie S (Tabela 1) przez 1 minutę, a następnie przemycie w wodzie podwójnie destylowanej. Użyj taśm i drabinki białkowej jako prowadnicy, aby przeciąć membranę przy 80 i 55 kDa. 
	Uwaga: W kroku 4.4 próbki można badać na żelach o wymiarach 16 x 18 cm2 o natężeniu do 34 kDa, dzięki czemu łatwo jest przeciąć membranę w określonych pozycjach i nie przecinać interesujących nas pasm. Alternatywnie, można uruchomić kilka żeli z tymi samymi próbkami, aby uniknąć przecięcia membrany.</li>
	<li>Zmyj barwnik Ponceau S solą fizjologiczną buforowaną Tris zawierającą 0,05% Tween 20 (TBST, Tabela 1). Dodaj TBST z 5% beztłuszczowym mlekiem, aby całkowicie pokryć błony. Inkubować błony w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować błony O/N w TBST z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i przeciwciałami rozcieńczonymi do 1 na 1000 przeciwko ADAR1 (110 i 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) i fosfo-IRF3 (47 kDa), odpowiednio dla górnej, środkowej i dolnej części błony.</li>
	<li>Przemyć membrany 5x przez 5 minut TBST i inkubować w TBST z 5% mlekiem beztłuszczowym i kozimi przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko królikom znakowanymi peroksydazą (rozcieńczonymi do 1 na 5 000) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyj membrany 5x przez 5 minut za pomocą TBST i nałóż roztwór elektrochemiluminescencji (ECL), aby uwidocznić pasma na foliach zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po uwidocznieniu prążków białkowych na foliach, przemyj środkową i dolną część membrany przez 10 minut roztworem do usuwania przeciwciał. Inkubować błony O/N w TBST z 3% BSA i przeciwciałami przeciwko całkowitemu PKR (w stężeniu 1 na 500) i IRF3 (w stężeniu 1 na 1 000), odpowiednio dla części środkowej i dolnej. Powtórz kroki 4.8. oraz 4.9. przy użyciu znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała anty-mysiego zamiast przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi dla błony PKR (środek).</li>
	<li>Przemyć dolną część membrany 5x przez 5 minut TBST i inkubować membranę w TBST z 3% BSA przez 1 godzinę z przeciwciałem przeciwko aktynie (rozcieńczonym do 1 na 5 000). Powtórz kroki 4.8. oraz 4.9. przy użyciu znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała anty-mysiego zamiast przeciwciała wtórnego anty-królika. Przykład wyników porównujących różne testowe RNA i kontrolę pozytywną przedstawiono na rysunku 5. Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi przeciwciałami, które należy zastosować.</li>
</ol>

<ol><li>Hoxie, J. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+and+gene+therapies+for+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Novel cell and gene therapies for HIV.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).</li>
<li>Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+approaches+for+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection.</a> Genome Med. 7, 50(2015).</li>
<li>Allers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+cure+of+HIV+infection+by+CCR5Delta32%2FDelta32+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation.</a> Blood. 117, 2791-2799 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hematopoietic+stem+cell+based+gene+therapy+for+HIV-1+infection%3A+considerations+for+proof+of+concept+studies+and+translation+to+standard+medical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice.</a> Viruses. 5, 2898-2919 (2013).</li>
<li>Burke, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Cellular+Resistance+to+HIV-1+Infection+In+Vivo+Using+a+Dual+Therapeutic+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).</li>
<li>Scarborough, R. J., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+Ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV and Ribozymes.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).</li>
<li>Eekels, J. J., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+durable+treatment+of+HIV-1+infection+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).</li>
<li>Blazquez, L., Fortes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+interference+%28U1i%29+for+Antiviral+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).</li>
<li>McIntyre, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((96+shRNAs+designed+for+maximal+coverage+of+HIV-1+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants.</a> Retrovirology. 6, 55(2009).</li>
<li>Sajic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+snRNAs+to+inhibit+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication.</a> Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE-directed+discovery+of+potent+shRNA+inhibitors+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1.</a> Mol Ther. 20, 820-828 (2012).</li>
<li>Scarborough, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Conserved+Target+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+is+Accessible+to+Inhibition+by+Both+an+HDV+Ribozyme+and+a+Short+Hairpin+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).</li>
<li>Lainé, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+cleavage+of+HIV-1+RNA+by+new+SOFA-HDV+ribozymes+and+their+potential+to+inhibit+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication.</a> RNA Biol. 8, 343-353 (2011).</li>
<li>Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Evaluation+of+Clinically+Relevant+SOFA-HDV+Ribozymes+Targeting+HIV+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA.</a> Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).</li>
<li>Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Inhibition+of+HIV-1+Production+by+Short+Hairpin+RNAs+and+Small+Interfering+RNAs+Targeting+a+Highly+Conserved+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+Is+Optimized+by+Evaluating+Alternative+Length+Formats%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).</li>
<li>Sarzotti-Kelsoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+the+TZM-bl+assay+for+standardized+assessments+of+neutralizing+antibodies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1.</a> J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).</li>
<li>Campos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+lasting+control+of+viral+rebound+with+a+new+drug+ABX464+targeting+Rev+-+mediated+viral+RNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis.</a> Retrovirology. 12, 1-15 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+inactivates+latent+HIV-1+proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA.</a> Retrovirology. 12, 22(2015).</li>
<li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4%28%2B%29-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue%2C+a+major+site+of+replication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li>
<li>Shan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PCR+assay+for+quantification+of+HIV-1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA.</a> J Virol. 87, 6521-6525 (2013).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PKR+activator%2C+PACT%2C+becomes+a+PKR+inhibitor+during+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication.</a> Retrovirology. 10, 96(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Battisti, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+activity+between+the+trans-activation+response+RNA-binding+protein%2C+TRBP2%2C+and+cyclin+T1+on+HIV+type+1+expression+and+viral+production+in+murine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).</li>
<li>Bannwarth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+TRBP1+promoter+by+NF-Y+transcription+factor+in+lymphocytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes.</a> J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+interacts+with+PKR+during+human+immunodeficiency+virus+infection+of+lymphocytes+and+contributes+to+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication.</a> J Virol. 83, 10119-10128 (2009).</li>
<li>Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+translation+and+its+regulation+by+cellular+factors+PKR+and+PACT%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT.</a> Virus Res. 193, 65-77 (2014).</li>
<li>ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+HIV-1+with+RNA+interference%3A+a+multiple+shRNA+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach.</a> Mol Ther. 14, 883-892 (2006).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+design+and+validation+of+antiviral+siRNA+for+targeting+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 80(2007).</li>
<li>Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+RNA+splicing+and+inhibition+of+HIV-1+replication+induced+by+modified+U1+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs.</a> J Virol. 84, 12790-12800 (2010).</li>
<li>Chang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+and+HIV-1+inhibition+of+chimeric+tRNA%28Lys3%29-ribozymes+under+dual+U6+snRNA+and+tRNA+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters.</a> Mol Ther. 6, 481-489 (2002).</li>
<li>Chang, L. J., Liu, X., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+siRNAs+targeting+multiple+highly+conserved+RNA+sequences+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1.</a> Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).</li>
<li>Daniels, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li>
<li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li>
<li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+adaptors+result+in+reduction+of+multiple+pre-mRNA+species+principally+by+sequestering+U1snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP.</a> Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).</li>
<li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+interferon+response+by+siRNA+is+cell+type-+and+duplex+length-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent.</a> Rna. 12, 988-993 (2006).</li>
<li>Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+or+stimulation%3F+siRNA+delivery+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany test produkcji HIV-1 został przeprowadzony przy użyciu komórek HEK293T (ryc. 2) i jest podobny do testów stosowanych do badań przesiewowych RNA HIV-1 pod kątem skutecznych miejsc docelowych rybozymu13, shRNA10,29, siRNA30 i U1i RNA11,31 . Stosując różne metody ilościowego określania produkcji HIV-1, w większości badań mierzono produkcję wirusa 48 godzin po jednoczesnej transfekcji plazmidu ekspresji HIV-1 z kandydującymi RNA. Po wytworzeniu HIV-1 niedoj...

Ograniczeniem obecnych metod leczenia HIV-1 jest to, że muszą być one podawane przewlekle, aby zapobiec postępowi choroby. Przeszczepienie limfocytów T opornych na HIV-1 lub hematopoetycznych komórek macierzystych może zapewnić długoterminową kontrolę replikacji wirusa HIV-1 w przypadku braku terapii farmakologicznej1,2 i może być również skutecznym podejściem do uzyskania wyleczenia z HIV-13. Jednym ze sposobów uodparnienia komórek na replikację wirusa HIV-1 jest wstawienie jednego lub więcej genów kodujących RNA lub peptydy anty-HIV-1 do komórek zakażonej osoby podczas przeszczepu autologicznego4. Zaprojektowano kilka potencjalnych genów anty-HIV-1, a niektóre z nich weszły w badania kliniczne w kombinacjach dwóch, 5 lub trzech6, aby zapobiec rozwojowi oporności HIV-1 na którykolwiek pojedynczy gen.
RNA anty-HIV-1 są jednymi z najlepszych kandydatów do skojarzonej terapii genowej ze względu na ich niski potencjał do wywołania odpowiedzi immunologicznej oraz dlatego, że są transkrybowane z bardzo krótkich sekwencji genów. Niektóre RNA anty-HIV-1 zostały zaprojektowane tak, aby celować w wnikanie i integrację wirusa. Jednak większość RNA anty-HIV-1 jest ukierunkowana na etapy po integracji w cyklu życiowym wirusa (Figura 1). Inhibitory po integracji obejmują RNA wabiki, ukierunkowane na białka regulatorowe HIV-1 Tat lub Rev1, oraz RNA oparte na antysensie, ukierunkowane na różne miejsca w RNA HIV-1, takie jak rybozymy7, shRNA8 i RNA U1i9. Metody, które zostały wykorzystane do porównania skuteczności RNA anty-HIV-1, obejmują monitorowanie replikacji wirusa w komórkach transdukowanych genami kodującymi kandydujące RNA i pomiar produkcji wirusa w komórkach przejściowo transfekowanych plazmidami eksprymującymi kandydujące RNA i plazmidem ekspresji HIV-110-13. Wcześniej stosowaliśmy test produkcji HIV-1 do badania przesiewowego RNA HIV-1 pod kątem nowych miejsc docelowych rybozymu13-15. Od tego czasu metody te zostały udoskonalone w celu optymalizacji formatu cząsteczki interferencyjnej RNA wyrażonej z plazmidowego DNA jako shRNA lub dostarczonej jako syntetyczne siRNA16. Test mierzy produkcję dojrzałych wirusów z ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki (HEK) i może być wykorzystany do porównania działania inhibitorów, które są ukierunkowane na etapy po integracji w cyklu replikacji HIV-1 (ryc. 1). W przypadku inhibitorów, które są ukierunkowane na etapy wstępnej integracji, potrzebne są alternatywne testy, takie jak test zakaźności komórek TZM-bl17 w celu oceny skuteczności przeciwwirusowej.
Główne obawy dotyczące bezpieczeństwa dostarczania RNA anty-HIV-1 w klinice obejmują potencjalne niezamierzone skutki dla ludzkich RNA lub białek oraz aktywację wrodzonych czujników odpornościowych. Aby ocenić toksyczność siRNA anty-HIV-1, użyliśmy testu żywotności komórek w różnych liniach komórkowych16. Zmierzyliśmy również aktywację dwuniciowych czujników immunologicznych RNA, kinazy białkowej R aktywowanej RNA (PKR) i receptora Toll podobnego 3 (TLR3), a także ekspresję genu stymulowanego interferonem, ADAR1 p150. Testy te można wykorzystać do potwierdzenia, że skuteczność RNA anty-HIV-1 nie wynika z pośredniego wpływu na żywotność komórek lub aktywację czujnika immunologicznego. Są one również przydatne w wykluczaniu potencjalnych RNA o potencjalnej toksyczności z dalszego rozwoju.
W poniższych protokołach opisane są procedury identyfikacji nowych terapeutycznych RNA i optymalizacji formatu istniejących. Metody te są przydatne do badań przesiewowych inhibitorów replikacji HIV-1 opartych na RNA i mogą być dostosowane do badań przesiewowych innych inhibitorów po integracji, takich jak małe cząsteczki ukierunkowane na eksport wirusowego RNA18 za pośrednictwem Rev lub systemy CRISPR/Cas zaprojektowane do celowania w zintegrowane DNAHIV-1 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, 96 dołków, 24 dołki, 6 dołków.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Niskocząsteczkowy Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>odczynnik do transfekcji do syntetycznych RNA</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>odczynnik do transfekcji plazmidów</td></tr> <tr>ekspresji RNA<td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>matryca poli(A) RNA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 Starter DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Papier do maty filtracyjnej DEAE&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny mikropłytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki buforowe do lizy</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>inhibitory proteaz i fosfataz</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Żelowa komora biegowa</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Półsucha komórka transferowa</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka białkowa EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do usuwania przeciwciał</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>PI32106</tr><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td> ADAR1 <td>od dr B.L. Bassa</td></tr><tr><td>Przeciwciało fosfo-T446-PKR</td> Przeciwciało <td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>fosfo-S396-IRF3</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Przeciwciało</td> 4947 <td></td></tr><tr><td>PKR</td><td>od dr A. Hovanessian</td>Przeciwciało IRF3 Sygnalizacja komórkowa 11904 Przeciwciało aktynowe <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Koza znakowana peroksydazą anty-królik</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Koza znakowana peroksydazą anty-mysie</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena skuteczności i toksyczności rna ukierunkowanych na produkcję hiv-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Terapie małymi RNA ukierunkowane na etapy postintegracyjne w cyklu replikacji HIV-1 są jednymi z głównych kandydatów do terapii genowej i mają potencjał do wykorzystania jako terapie lekowe w przypadku zakażenia HIV-1. Inhibitory pointegracyjne obejmują rybozymy, krótkie RNA spinki do włosów (sh), małe interferujące RNA (si), RNA interferencji U1 (U1i) i aptamery RNA. Wiele z nich zostało zidentyfikowanych za pomocą przejściowych testów kotransfekcji z plazmidem ekspresji HIV-1, a niektóre przeszły do badań klinicznych. Oprócz miar skuteczności, małe RNA zostały ocenione pod kątem ich potencjału do wpływania na ekspresję ludzkiego RNA, zmiany wzrostu i/lub różnicowania komórek oraz wywoływania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. W opisanych tutaj protokołach opisano zestaw testów transfekcji przejściowej zaprojektowanych do oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy po integracji w cyklu replikacji HIV-1. Wykorzystaliśmy te testy do identyfikacji nowych rybozymów i optymalizacji formatu shRNA i siRNA ukierunkowanych na RNA HIV-1. Metody te zapewniają szybki zestaw testów, które są przydatne do badań przesiewowych nowych RNA anty-HIV-1 i mogą być dostosowane do badań przesiewowych innych inhibitorów replikacji HIV-1 po integracji.

Ogólny schemat procedur przedstawiono na Rysunku 2, natomiast przykładowy plan transfekcji dla trzech badanych RNA oraz RNA kontrolnego zamieszczono na Rysunku 2B>. W przypadku produkcji wirusa i testów żywotności komórek, wynik dla każdej badanej konstrukcji jest normalizowany względem kontroli negatywnej. Powtórzenia są transfekowane w zestawach, tak aby każde badane RNA było normalizowane względem przypisanej mu kontroli negatywnej. Postępowanie to ma ...

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie skuteczności i toksyczności nowych cząsteczek RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1. Metoda ta może pomóc w identyfikacji nowych cząsteczek RNA do zastosowania w terapii genowej lub lekowej HIV-1, takich jak krótkie RNA spinki (shRNA), małe interferujące RNA (siRNA), rybozymy oraz pułapki RNA (RNA decoys). Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego przesiewania kilku nowych projektów RNA przy krótkim czasie oczekiwania na wyniki.Chociaż metoda ta została opracowana w celu oceny nowych leków RNA lub terapii genowej przeciwko HIV, można ją zastosować również w innych układach, takich jak małe cząsteczki lub zadania CRISPR. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy przygotowywaliśmy eksperymenty do przesiewania dużej liczby rybozymów pod kątem działania przeciw-HIV. Na początek przygotować zawiesinę ludzkich komórek embrionalnych nerek 293T w stężeniu 2 × 10⁵ komórek na ml w DMEM z 10% FPS oraz 1% penicyliny i streptomycyny.Dodaj odpowiednio 500, 100 i 1 000 µL zawiesiny komórkowej do poszczególnych studni płytek 24-, 96- i 12-dołkowych do analiz produkcji wirusa, żywotności komórek oraz aktywacji immunologicznej. Delikatnie zakręć płytkami i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ do uzyskania 50% do 70% konfluencji. Dla analizy produkcji wirusa przygotuj rozcieńczenie plazmidu ekspresyjnego HIV-1 o stężeniu 10 ng/µL i dodaj 10 µL do każdej probówki analitycznej.Następnie przygotuj rozcieńczenia testowych RNA oraz RNA kontroli negatywnej w stężeniu 5 µM. Potem dodaj 2,5 µL lub 10 µL każdego rozcieńczenia testowego RNA oraz kontroli negatywnej do odpowiednich probówek, aby uzyskać końcowe stężenia 25 nM lub 100 nM. W przypadku testu żywotności komórek przygotuj rozcieńczenia testowych RNA w stężeniu 5 µM oraz rozcieńczenie RNA kontroli pozytywnej, niskocząsteczkowego poly(I:C), w stężeniu 10 mg/mL. Dodaj 2 µL rozcieńczeń testowego RNA lub RNA kontroli pozytywnej do odpowiednich probówek, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 100 nM lub 200 µg/mL.W celu przeprowadzenia testu aktywacji odpornościowej dodaj 20 µL rozcieńczeń testowego RNA lub RNA kontroli dodatniej, przygotowanych dla testu żywotności komórek, do odpowiednich probówek w celu uzyskania końcowych stężeń odpowiednio 100 nM lub 200 µg/mL. Następnie dodaj 50, 25 lub 75 µL DMEM do każdej probówki do transfekcji dla testów produkcji wirusowej, żywotności komórek i aktywacji odpornościowej, odpowiednio. W przypadku testów produkcji wirusowej przed kolejnym krokiem przenieś komórki i przygotowane probówki do transfekcji do laboratorium o trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3).Do probówek do transfekcji dodaj sekwencyjnie po dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji i inkubuj przez 15 do 20 minut, aby umożliwić tworzenie się kompleksów. Całą mieszaninę do transfekcji z każdej mikroprobówki dodaj kroplami do odpowiadających im pozycji w płytkach hodowlanych. Delikatnie zamieszaj ruchem wirowym, a następnie inkubuj płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Aby przeprowadzić analizę produkcji wirusa, po wyjęciu 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowej z inkubatora, przenieś je do komory z laminarnym przepływem powietrza w laboratorium poziomu BSL-3. Delikatnie zakręć płytkami, a następnie przenieś 150 µL supernatantu z każdego dołka do odpowiedniego dołka w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem, która zostanie wykorzystana do ilościowego oznaczenia produkcji HIV-1. Przenieś 5 µL supernatantu do odpowiednich dołków w 96-dołkowej płytce zawierającej 25 µL koktajlu do rozbicia wirusów.Po inkubowaniu mieszaniny przez pięć minut w temperaturze pokojowej, przenieś płytkę do stanowiska pracy z materiałami radioaktywnymi. Następnie przygotuj koktajl radioaktywny i dodaj 25 µL do każdej studni zawierającej supernatant wirusowy oraz koktajl rozbijający. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez dwie godziny.Naniesienie pięciu mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej na odpowiednie pola papierowego filtra z włókna szklanego/DEAE i pozostawienie plam do wyschnięcia na 10 minut. Papiery należy przemyć pięciokrotnie buforem 2x SSC przez pięć minut w każdym cyklu, a następnie dwukrotnie przez jedną minutę etanolem 95%. Przed zamknięciem w woreczkach na próbki należy pozwolić papierom wyschnąć.Wepnij worki z próbkami zawierające papierowy mat filtracyjny do kasety, a następnie umieść kasetę w mikropłytkowym liczniku scyntylacyjnym. Następnie uruchom licznik. W przypadku każdej metody kwantyfikacji wirusa podziel wartości uzyskane dla każdego testowego RNA przez sąsiednią kontrolę negatywną i pomnóż tę wartość przez 100, aby uzyskać procent hamowania produkcji HIV-1 dla każdej powtórki testowych RNA.Aby przeprowadzić test żywotności komórek, po wyjęciu płytek 96-dołkowych z inkubatora, dodać do każdego dołka 20 µL MTT w stężeniu 5 mg/mL oraz DPBS. Następnie inkubować płytki przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Do każdego dołka dodać 150 µL zakwaszonego izopropanolu z detergentem i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Następnie należy użyć spektrofotometru do mikropłytek, aby wyznaczyć absorbancję przy 570 nanometrach. Oblicz względny metabolizm MTT dla każdej dodatniej kontroli oraz badanego RNA, dzieląc wartość uzyskaną dla każdej próbki przez wartość dla sąsiedniej kontroli transfekcji. W przypadku testu aktywacji immunologicznej, po wyjęciu płytek 12-dołkowych z inkubatora, należy odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie delikatnie przemyć komórki za pomocą DPBS.Następnie do każdej dołki należy dodać 70 µl zimnego buforu do lizy zawierającego inhibitory proteaz i fosfataz, a następnie inkubować płytki na lodzie przez 10 minut. Lizaty komórkowe przenosi się do mikroprobek i zamraża gwałtownie poprzez zanurzenie probówek w ciekłym azocie. Po rozmrożeniu próbek należy przeprowadzić dwa kolejne cykle zamrażania i rozmrażania, tak aby łącznie zrealizować trzy cykle zamrażania i rozmrażania.Następnie odwiruj lizaty w wirowce przy 15 700 ×g i 4 °C przez 15 minut, aby osadzić resztki komórkowe. Po przeprowadzeniu elektroforezy i transferu na membranę, uwidocznij prążki białkowe, inkubując membranę w Ponceau S przez jedną minutę. Następnie przemyj ją wodą dwukrotnie destylowaną.Wykorzystując prążki oraz drabinę białkową jako punkt odniesienia, przetnij membranę na wysokości 80 i 55 kilodaltonów. Następnie użyj TBS z 0,05% TWEEN 20 lub TBST, aby wypłukać barwnik Ponceau S. Dodaj TBST z 5% odtłuszczonym mlekiem tak, aby całkowicie pokryć membrany, a następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej przy wytrząsaniu przez jedną godzinę.Przenieś membrany do TBST z 3% BSA oraz przeciwciał rozcieńczonych 1:1 000 przeciwko ADAR, fosfo-PKR i fosfo-IRF3 odpowiednio dla górnego, środkowego i dolnego fragmentu membrany. Inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez noc. Następnego ranka przemyj membrany pięciokrotnie w TBST przez pięć minut każde przemycie, a następnie przenieś je do TBST z 5% mleka odtłuszczonego i znakowanych peroksydazą kozich przeciwciał wtórnych anty-króliczych w rozcieńczeniu 1:5 000 na jedną godzinę.Po wizualizacji prążków białkowych na błonach, należy użyć roztworu do strippingu, aby przemyć środkowy i dolny fragment membrany przez 10 minut, a następnie inkubować środkowy fragment membrany z przeciwciałami przeciwko PKR, a dolny fragment z przeciwciałami przeciwko IRF3. Jako kontrolę pozytywną, należy przeprowadzić detekcję dolnej membrany przeciwciałami przeciwko aktynie zgodnie z protokołem tekstowym. Ogólny schemat analiz przedstawiono tutaj wraz z przykładowym planem transfekcji dla trzech testowych RNA i jednego kontrolnego RNA.W przypadku analiz produkcji wirusów i żywotności komórek, odczyt dla każdej konstrukcji testowej został znormalizowany względem kontroli negatywnej. Wykorzystując analizę produkcji HIV-1 w komórkach transfekowanych plazmidem wykazującym szczep HIV-1 NL4-3, obliczono procent aktywności RT w komórkach kotransfekowanych jednym z przedstawionych tutaj siRNA w porównaniu do komórek transfekowanych bezsensownym siRNA o długości substratu Dicer, aby zidentyfikować optymalną długość cząsteczek interferencji RNA celujących w konserwatywną sekwencję RNA HIV-1. Po zidentyfikowaniu najskuteczniejszych siRNA określono procent metabolizmu MTT dla transfekowanych komórek.Podobnie jak w przypadku dwuniciowego RNA, poly(I:C) obniżył żywotność komórek tylko przy najwyższej dawce. Nie zaobserwowano istotnego spadku żywotności komórek w przypadku siRNA celujących w miejsce 1498 w RNA HIV-1, niezależnie od ich długości. Jak wykazano tutaj za pomocą metody Western blot, ten sam zestaw cząsteczek RNA oceniono w teście aktywacji immunologicznej.W warunkach, w których poly(I:C) aktywowało ekspresję ADAR1-p150 oraz indukowało fosforylację PKR i IRF3, nie zaobserwowano istotnego wpływu żadnego z badanych RNA na markery inaktywacji. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu siedmiu dni, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie wysokiej jakości preparatów zarówno RNA, jak i DNA do transfekcji.Ponadto, aby uwzględnić odpowiednie kontrole negatywną i pozytywną. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak zakażanie transdukowanych komórek wirusem HIV, w celu oceny długoterminowej skuteczności i toksyczności potencjalnych kandydatów na leki przeciwHIV. Po opracowaniu technika ta pozwoliła nam zidentyfikować dostępną i konserwatywną sekwencję docelową w RNA HIV oraz zoptymalizować formaty rybozymów, shRNA i siRNA skierowanych przeciwko niej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko badać skuteczność nowych kandydatów RNA ukierunkowanych na produkcję HIV za pomocą testu produkcji wirusa, a także potencjalną toksyczność przy użyciu testów aktywacji odpornościowej i żywotności komórek. Należy pamiętać, że praca z HIV oraz nukleotydami znakowanymi izotopami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak korzystanie z certyfikowanych laboratoriów biosafety oraz laboratoriów radiochemicznych.

evaluation-efficacy-toxicity-rnas-targeting-hiv-1-production-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Przewidywanie wykorzystania koreceptora przez HIV-1 jest niezbędne do podania nowej klasy leków antyretrowirusowych, mianowicie antagonistów koreceptorów. Można to przeprowadzić poprzez analizę sekwencji genu env i późniejszą interpretację za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego (geno2pheno[coreceptor]).

Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Opracowaliśmy protokół do generowania i oceny humanizowanego i ludzkiego modelu myszy NOG zakażonego wirusem niedoboru odporności na podstawie przeszczepu komórek macierzystych, dopochwowej ekspozycji na ludzkiego wirusa niedoboru odporności i kropelkowej cyfrowej kwantyfikacji RNA PCR.

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

W tym badaniu wykorzystano strategie in-silico, aby zidentyfikować enumerowaną etrawirynę jako obiecujący środek terapeutyczny dla HIV. Nasze odkrycia dotyczące interakcji molekularnych i dynamiki wspierają racjonalne projektowanie nowych NNRTI jako możliwych alternatyw leczenia HIV.

Ilościowa zależność struktura-aktywność, przewidywanie aktywności i dynamika molekularna nienukleotydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy

Dowiedz się oceniać skuteczność i toksyczność RNA ukierunkowanych na HIV-1 w komórkach 293T. Ta metoda umożliwia szybki przesiew kandydatów do terapii genowej i lekowej.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Przeglądaj więcej filmów