Name: Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę diploidyzacji zarodków Danio rerio za pomocą szoku cieplnego. Technika ta umożliwia bezpośrednią homozygozę alleli i tworzenie linii inbredowych w badaniach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty NIH R21 HD068949-01 i RO1 GM065303.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi University of Wisconsin – Madison oraz Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (University of Wisconsin – Madison Assurance numer A3368-01).
1. Wybór samic do pobrania jaj poprzez przerwane krycie
UWAGA: Protokoły oparte na zapłodnieniu in vitro polegają na wytłaczaniu dojrzałych komórek jajowych od samic poprzez ręczny nacisk 9. Poprzednie protokoły wykorzystywały samice bezpośrednio ze zbiorników lub w parach bez poddawania samic zachowaniu uwalniania jaj, ale tylko niewielka część tych samic (około 20% lub mniej, w zależności od linii danio pręgowanego) daje wytłaczane i kompetentne jaja pod ręcznym naciskiem. W ulepszonej procedurze samice są wstępnie sortowane do składania jaj poprzez bezpośrednią obserwację wzrokową, po której następuje natychmiastowe przerwanie krycia. Procedura ta jest bardzo skuteczna, ponieważ prawie wszystkie samice wstępnie wyselekcjonowane w tym przerwanym etapie krycia dają wytłaczane i kompetentne jaja po ręcznym nacisku.
<ol>
	<li>Po południu przed eksperymentem ustaw pary godowe pożądanego szczepu danio pręgowanego w standardowych skrzynkach godowych danio pręgowanego. Samce należy trzymać w tej samej komorze co samice, ale są od nich fizycznie oddzielone, albo poprzez podział w budce godowej, albo przez umieszczenie samca pod wkładką do składania jaj, a samicy wewnątrz wkładki.</li>
	<li>Rano w dniu eksperymentu usuń fizyczną przegrodę, umieszczając zarówno samca, jak i samicę w tej samej wkładce do składania jaj, tak aby rozpoczęło się krycie.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo zbiorniki zawierające pary godowe, aby wykryć wytłaczanie jaj podczas naturalnego krycia. Przy pierwszych oznakach wytłaczania jaj oddziel samca i samicę, aby przerwać rozmnażanie. Po oddzieleniu od samców należy trzymać wstępnie wybrane samice oddzielnie lub w jednym zbiorniku. Użyj wielu samic w zależności od pożądanej liczby zarodków (zwykle 50-150 jaj / samicę).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu nasienia
UWAGA: Zapłodnienie in vitro polega na wystawieniu dojrzałych komórek jajowych na działanie roztworu plemnika. Roztwór ten może być nieleczony, w celu wytworzenia zygot diploidalnych (które po leczeniu HS2 stają się zarodkami tetraploidalnymi) lub poddanych działaniu promieniowania UV, w celu wytworzenia zygot haploidalnych (które po leczeniu HS2 stają się homozygotycznymi zarodkami diploidalnymi). Poprzednie protokoły przygotowania nasienia sugerowały użycie rurek kapilarnych do pobierania mleka z okolicy odbytu żywych samców, ale był to nieskuteczny proces, ponieważ tylko niewielka część samców dawała mleczko 9. Przedstawiony poniżej protokół opiera się zamiast tego na przygotowaniu nasienia z wypreparowanych jąder, co daje bardziej wiarygodne wyniki.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Hanka z wyprzedzeniem jako roztwór premiksu Hanka, składający się ze wszystkich składników (roztwory 1, 2, 4 i 5) z wyjątkiem roztworu wodorowęglanu sodu (roztwór 6). Przygotować roztwór 6 na świeżo i dodać do premiksu rano w dniu eksperymentu (Tabela 1). Aby przygotować roztwór Hanksa (roztwór końcowy, przygotuj rano w dniu procedury IVF), połącz 990 ul premiksu Hanka i 10 μl świeżo przygotowanego roztworu 6.</li>
	<li>Poddaj mężczyzn eutanazji przez nadmierną ekspozycję na trikainę w postaci 0,016% roztworu w kondycjonowanej wodzie.
	<ol>
		<li>Przygotować trikainę jako 0,2% roztwór podstawowy w wodzie (bufor do pH 7,0 z 1M Tris pH 9,0) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać 8 ml roztworu podstawowego trikainy na 100 ml wody w zlewce i użyć siatki do przeniesienia samców do roztworu tricainy.</li>
		<li>Użyć odpowiednika jąder dla jednego samca na lęg, który musi zostać zapłodniony w objętości roztworu Hanka odpowiadającej 100 μl na samca (np. jądra od 10 samców zebrane w 1 ml roztworu Hanka, aby zapłodnić 10 lęgów 100 μl/sprzęgło).</li>
		<li>Potwierdź eutanazję poprzez zatrzymanie ruchów skrzelowych na 15 minut. Po eutanazji wyjmij samce ze zlewki łyżką. Spłucz krótko samce kondycjonowaną wodą i lekko je osusz, umieszczając je na krótko w kilku miejscach ręcznika papierowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby usunąć jądra, najpierw odetnij głowy uśpionym mężczyznom za pomocą nożyczek preparacyjnych lub żyletki, a następnie wykonaj podłużne cięcie wzdłuż brzucha nożyczkami preparującymi. Pod mikroskopem preparacyjnym z odbitym źródłem światła usuń narządy wewnętrzne za pomocą kleszczy preparacyjnych. Wyciągnij każdą z mas jąder za pomocą kleszczy i umieść je w probówce mikrowirówki zawierającej roztwór Hanka. 
	UWAGA: Jądra można zidentyfikować jako każdą z dwóch wydłużonych struktur o półprzezroczystym wyglądzie, które znajdują się wzdłuż ścian ciała i które zbiegają się w pobliżu kloaki. Jądra mogą pozostać 2-3 minuty na powierzchni płytki Petriego po rozbiorze i przed umieszczeniem ich w roztworze Hanka.</li>
	<li>Uwolnij plemniki do roztworu, ścinając jądra wąską szpatułką i/lub delikatnie pipetując w górę iw dół 5-6 razy więcej jąder niż w roztworze za pomocą mikropipety z końcówką 1,000 μl, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Niech szczątki jąder osiądą.</li>
	<li>Przechowuj roztwór nasienia w lodzie, gdzie może utrzymać swoją moc do 2-3 godzin. Jeśli przystępujesz do obróbki UV roztworu nasienia, przenieś roztwór do czystej probówki mikrowirówkowej, pozostawiając kawałki jąder.</li>
</ol>
3. Leczenie UV
UWAGA: Leczenie promieniowaniem UV służy do sieciowania DNA plemników w celu unieszkodliwienia go w zarodku. Ten etap jest stosowany tylko w przypadku wytwarzania gynogenetycznych haploidalnych lub homozygotycznych diploidalnych zarodków gynogenetycznych. Roztwór nasienia do leczenia promieniowaniem UV należy oddzielić od kawałków jąder (krok 2.4), ponieważ duże kawałki mogą chronić plemniki przed obróbką UV.
<ol>
	<li>Przenieść roztwór nasienia do czystej, suchej studzienki szklanej płytki wgłębieniowej umieszczonej na podłożu lodowym (np. lód wewnątrz płytki Petriego). Użyj do 1 ml roztworu nasienia na szklaną płytkę.</li>
	<li>Wystaw roztwór nasienia na działanie promieniowania UV, umieszczając szklaną płytkę wgłębieniową na podłożu lodowym pod lampą UV. Traktuj roztwór nasienia przez 90 sekund lampą UV 115 V (60 Hz, 0,68 A) w odległości 19 cm (7,5 cala). Końcówką końcówki pipety delikatnie mieszaj roztwór co 30 sekund podczas zabiegu UV (używaj czystej końcówki pipety co 30 sekund).</li>
	<li>Za pomocą czystej końcówki pipety i mikropipety przenieś roztwór nasienia poddany działaniu środka do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie to potrzebne do zapłodnienia in vitro (nie dłużej niż 2-3 godziny od ekstrakcji).</li>
</ol>
4. Ręczne wytłaczanie dojrzałych jaj
UWAGA: Samice uzyskane przez przerwanie naturalnych kryć z łatwością rodzą jaja pod narkozą i naciskiem ręcznym. Podczas tej procedury leczenie tricainą powinno być dokładnie kontrolowane, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji, która może uniemożliwić powrót do zdrowia samic.
<ol>
	<li>Znieczulić samice przez lekką ekspozycję na roztwór trikainy: przenieść samice z siatką do roztworu tricainy w kondycjonowanej wodzie (sporządzonej przez dodanie 8 ml 0,2% roztworu podstawowego Tricaine do 100 ml kondycjonowanej wody dla ryb) przez około 2-5 minut, aż ryby przestaną poruszać skrzelami.</li>
	<li>Gdy tylko samica przestanie poruszać skrzelami, zbierz ją łyżką i krótko spłucz w kondycjonowanej wodzie. Nadal używając łyżki do przesuwania ryby, osusz ją lekko, kładąc ją na krótko i wielokrotnie w kilku miejscach ręcznika papierowego, a następnie przenieś na czystą, suchą płytkę Petriego o średnicy 10 cm. Zbliż się do ryby z łyżką w kierunku przednim lub tylnym, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia wieczka skrzelowego.</li>
	<li>Użyj chusteczek laboratoryjnych lub tkanek miękkich, aby delikatnie osuszyć obszar płetwy odbytowej, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji uwolnionych jaj przez wodę. Lekko zwilżając palce wodą (aby uniknąć przyklejania się do rybich łusek), połóż jeden palec jednej ręki na plecach samicy jako podparcie, a palcem drugiej ręki lekko dociśnij wzdłuż brzucha samicy, aż jaja zostaną wyciśnięte.</li>
	<li>Użyj wąskiej szpatułki, aby odsunąć jaja od ciała samicy. Umieść samicę z powrotem w zbiorniku z kondycjonowaną wodą w celu odzyskania spraw. 
	UWAGA: Po wyciśnięciu jaj, gdy samica leży po jednej stronie ciała, można ją przewrócić i powtórzyć proces po drugiej stronie, aby uzyskać dodatkowe jaja. Aby zapewnić pełne wyzdrowienie samicy, należy delikatnie uciskać brzuch tylko delikatnie ręcznie i przeprowadzać procedurę od zatrzymania ruchu skrzeli do powrotu do wody w mniej niż 2 minuty.</li>
	<li>Aktywuj (z ekspozycją na wodę) i zapładniaj (z dodatkiem roztworu nasienia) jaja jednocześnie i w ciągu 90 sekund po ekstruzji (patrz punkt 5).</li>
</ol>
5. Zapłodnienie in vitro
UWAGA: Zapłodnienie danio pręgowanego w naturalnych krzyżówkach jest zewnętrzne, zależne od jednoczesnego uwalniania i aktywacji przez wodę jaj i plemników podczas krycia. Zapłodnienie in vitro naśladuje ten proces poprzez wystawienie komórek jajowych na działanie roztworu plemnika w obecności wody. Objętość wody jest pierwotnie mała (1 ml) w celu zwiększenia efektywnej koncentracji plemników. Wiązanie przez plemniki następuje w ciągu 15-20 sekund 10, a następnie można zwiększyć objętość wody. Podnoszenie kosmówki dodatkowo przyczynia się do ścisłej synchronizacji sprzęgła poprzez ograniczenie okna kompetencji do wiązania plemników 11,12. Powstałe w ten sposób zarodki wykazują w dużej mierze równoczesne cykle podziałów komórkowych we wczesnych stadiach rozszczepienia.
<ol>
	<li>Dodać 100 μl roztworu nasienia (odpowiadającego odpowiednikowi jąder od jednego samca – patrz część 2) do lęgu wyciśniętych komórek jajowych na płytce Petriego. Delikatnie zakręć końcówką pipety używaną do dodawania roztworu nasienia do jaj, aby wymieszać plemniki i jaja razem, uważając, aby nie podnosić końcówki z powierzchni płytki Petriego, aby uniknąć uszkodzenia jaja.</li>
	<li>Natychmiast aktywuj komórki jajowe, dodając 1 ml roztworu pożywki embrionalnej (E3) (kondycjonowana woda jest również dopuszczalna jako substytut E3 w częściach od 5 do 7) i ponownie delikatnie wymieszaj jaja i plemniki, delikatnie obracając końcówką pipety. Uruchom timer, aby zainicjować odliczanie czasu w stosunku do nawożenia.</li>
	<li>W ilości 1 mpf w objętości 1 ml zalać płytkę E3. Przed kontynuacją pozostaw w spokoju do 10-12 mpf, aby umożliwić aktywację jaja, w tym pełne rozszerzenie kosmówki.</li>
</ol>
6. Leczenie szokiem cieplnym
UWAGA: Szok cieplny zastosowany we wczesnym zarodku hamuje duplikację centrioli, co skutkuje niekompletnym uzupełnieniem centrioli, które napędzają tworzenie wrzeciona podczas kolejnego cyklu komórkowego 2. Brak wrzeciona z kolei skutkuje brakiem tworzenia się bruzdy 13.
<ol>
	<li>Po rozszerzeniu kosmówki (10-12 mpf) wlej zarodki z płytki Petriego do sitka do herbaty. Opłucz płytkę Petriego za pomocą butelki do mycia z E3, aby zebrać pozostałe zarodki w sitku do herbaty.</li>
	<li>Umieścić sitko do herbaty z zarodkami w zlewce w podgrzewanej kąpieli z E3 w temperaturze 28,5 °C. Wstępnie wyrównać temperaturę zlewki i E3 do temperatury łaźni wodnej i upewnić się, że jest wystarczająco dużo E3, aby wszystkie zarodki w sitku do herbaty zostały wystawione na działanie pożywki.</li>
	<li>Po temperaturze 22 mpf wyjąć sitko do herbaty z łaźni wodnej o temperaturze 28,5 °C, krótko osuszyć je na ręczniku papierowym w celu usunięcia nadmiaru wilgoci i umieścić w podobnie podgrzanej zlewce E3 w łaźni grzewczej o temperaturze 41,4 °C.</li>
	<li>Po 24 mpf przenieść sitko do herbaty z powrotem do E3 w łaźni wodnej o temperaturze 28,5 °C po krótkim osuszeniu. W temperaturze 29 mpf użyj butelki do płukania z E3, aby przenieść zarodki z sitka do herbaty na 10-centymetrową szalkę Petriego.</li>
</ol>
7. Selekcja zarodków z jednocyklowym przeciągnięciem cytokinezy
<ol>
	<li>W okresie 35-45 mpf, pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła przechodzącego, wybierz te zarodki, które przechodzą symetryczne rozszczepienie do stadium 2-komórkowego i które są w związku z tym zapłodnione. Usuń zarodki, które nie przechodzą rozszczepienia komórek.</li>
	<li>Kontynuuj obserwację zapłodnionych zarodków, wybranych do prawidłowego podziału komórek podczas pierwszego cyklu komórkowego i podczas drugiego cyklu komórkowego (50-65 mpf).</li>
	<li>Sortuj zarodki według następujących kategorii (ryc. 2C): 4 komórki ("bez przeciągnięcia", w standardzie układu 2:2 dla zarodka 4-komórkowego); 3 komórki ("częściowe przeciągnięcie", w nieprawidłowym układzie 2 mniejsze komórki: 1 duży układ komórek); i 2 komórki ("zatrzymane", zarodki wykazujące opóźnienie cyklu jednokomórkowego w układzie 1:1 identycznym jak w przypadku zarodka dwukomórkowego). Posortuj zatrzymane zarodki na świeżą płytkę Petriego. 
	UWAGA: Na tym etapie zarodki w układzie 2:2 odpowiadają tym, w których podczas drugiego cyklu komórkowego żaden blastomer nie uległ zatrzymaniu podziału komórkowego; Zarodki w nieprawidłowym 2 mniejszych komórkach: 1 duży układ komórek odpowiada tym, w których szok cieplny spowodował zatrzymanie cyklu komórkowego podczas drugiego cyklu komórkowego w jednym blastomorze, ale nie w drugim; a zarodki "zatrzymane" w układzie 1:1 odpowiadają tym, w których podczas drugiego cyklu komórkowego oba blastomery uległy pożądanemu zatrzymaniu podziału komórkowego. Zarodki, które utknęły w martwym punkcie, powinny wznowić szczepienie komórek w następnym okresie cyklu komórkowego (65-80 mpf). Układ blastomerów może być zmienny ze względu na niekompletne wskazówki z poprzedniego cyklu komórkowego w celu ustabilizowania wrzeciona 2,14, ale większość zarodków utworzy stosunkowo normalną blastulę, która może przejść normalny rozwój.</li>
	<li>Pozwolić zarodkom rozwinąć się na płytce Petriego, z limitem 80 zarodków na 10 cm płytkę. Przy 24 hpf obserwować zarodki w celu określenia, czy mają normalną morfologię charakterystyczną dla diploidalnych lub homozygotycznych zarodków diploidalnych 6 (normalny zakres wydłużenia osi (ryc. 3A, 3C)), w przeciwieństwie do zmniejszonego wydłużenia osi i zwiększonej grubości ciała charakterystycznej dla haploidów (ryc. 3B)), i/lub ocenić diploidyzację za pomocą genetycznych markerów barwnikowych przy 36 mpf, takie jak golden lub albinos i inne podobne testy (rysunek 3 i patrz poniżej) 2,6,9.</li>
	<li>Usuń wszystkie zarodki, które wydają się mieć haploidalną morfologię, lub które uległy lizie lub wykazują inne rażąco nieprawidłowe wady. 
	UWAGA: W razie potrzeby pozwól zarodkom rozwinąć się do 5 dni po zapłodnieniu, kontynuując codzienne usuwanie zlizowanych lub rażąco nieprawidłowych zarodków i dodając świeży E3 w celu odświeżenia pożywki. UWAGA: Zarodki, które przeżyły, mogą być również hodowane po napompowaniu pęcherza pławnego w 5 dniu, przenosząc je do systemu wylęgarni i karmiąc w standardowych warunkach.</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li>
<li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li>
<li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li>
<li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+%28Paralichthys+olivaceus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li>
<li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li>
<li>Walker, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+C+%22The+zebrafish%3A+Genetics+and+genomics.+Vol.+60+Methods+in+Cell+Biology%22">The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology</a>. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).</li>
<li>Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li>
<li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li>
<li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPelegri%2C+F+%22The+Zebrafish%3A+Genetics+and+Genomics+Vol.+60+Methods+in+Cell+Biology%22">The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology</a>. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).</li>
<li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg%3A+localization+of+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li>
<li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+a+sperm+meets+an+egg%3A+block+to+polyspermy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li>
<li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defending+the+zygote%3A+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li>
<li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li>
<li>Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li>
<li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li>
<li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li>
<li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank%27s+saline+containing+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Mar.+Biol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li>
<li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+Y%2C+W%2C+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li>
<li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li>
<li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li>
<li>Pelegri, F., Mullins, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPelegri%2C+F+%22Met.+Cell+Biol.+Vol.+104%22">Met. Cell Biol. Vol. 104</a>. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kroki krytyczne
Bardzo ważna jest praca w warunkach skutecznego zapłodnienia in vitro. Aby zapewnić dobry zapas dojrzałych jaj (krok 1), samice przygotowane do krycia nie powinny być ustawione w krzyżówkach krytych przez co najmniej 5 dni i powinny wyglądać na ciężkie. Podczas przerwy w rozrodze obserwator może odpowiednio monitorować 15-30 zbiorników pod kątem pierwszego pojawienia się naturalnej ekstruzji jaj. Przerwanie krycia powinno nastąpić tak szybko, jak to możliwe, gdy pierwsze jaja zost...

Ten protokół pozwala na manipulację ploidalnością w zarodkach danio pręgowanego, na przykład w procesie generowania homozygotycznych diploidów gynogenetycznych z haploidów gynogenetycznych (Rysunek 1) lub produkcji tetraploidów. Osiąga się to poprzez wywołanie opóźnienia cytokinezy odpowiadającego dokładnie jednemu cyklowi komórkowemu (ryc. 2A, 2B). Kluczowe jednocyklowe opóźnienie cytokinezy osiąga się poprzez leczenie szokiem cieplnym. Standardowy protokół szoku cieplnego (HS), pierwotnie opisany przez Streisingera i współpracowników, obejmował impuls temperatury w okresie 13-15 mpf, co powodowało jednocyklowe zatrzymanie podziału komórki podczas pierwszego cyklu komórkowego 1. Skuteczność tego protokołu została ostatnio poprawiona poprzez skanowanie wczesnych cykli komórkowych z przesuwanym oknem czasowym leczenia szokiem cieplnym. Skan ten zidentyfikował późniejszy punkt czasowy szoku cieplnego, nadal w pierwszym cyklu komórkowym (22-24 mpf), który skutkuje wyższym odsetkiem zarodków z jednocyklowym zatrzymaniem podziału komórek, co w tym przypadku wpływa na drugi cykl komórkowy 2. Obserwacja, że eksperymentalne manipulacje podczas pierwszego cyklu komórkowego zakłócają podział komórki podczas drugiego cyklu komórkowego i powodują duplikację zawartości DNA, została również zgłoszona u innych gatunków ryb 3,4. Ten zmodyfikowany protokół nazywamy Szokiem Cieplnym 2 (HS2 – termin "2" odzwierciedla, że impuls cieplny występuje w późniejszym punkcie czasowym niż standardowa metoda HS i że opóźnienie cyklu komórkowego spowodowane przez HS2 występuje podczas drugiego cyklu komórkowego). Badania te wykazały, że podstawą zatrzymania cytokinezy po szoku cieplnym jest zahamowanie duplikacji centrioli podczas impulsu cieplnego, co wpływa na tworzenie wrzeciona i indukcję bruzd w następnym cyklu komórkowym. HS2 powoduje, że wydajność zatrzymania cyklu komórkowego zbliża się do 100%, a wskaźniki duplikacji ploidalności są do 4 razy wyższe niż standardowe HS 2.
Embriony poddane szokowi termicznemu podczas cyklu blastomerów wykazują wiele szkodliwych efektów, co sugeruje, że szok cieplny wpływa na wiele procesów wymaganych do podziału komórki 2. Z drugiej strony, jeśli szok cieplny zostanie zastosowany przed rozpoczęciem cyklu komórkowego (okres 0-30 mpf), wydaje się, że ma on skutki zgodne ze specyficzną interferencją z duplikacją centrioli i nie wydaje się wpływać na inne istotne procesy komórkowe 2. Badania te wykazały, że czas przed rozpoczęciem podziału blastomerów wydaje się być okresem rozwojowym podatnym na wykorzystanie szoku cieplnego jako narzędzia do specyficznego manipulowania ploidalnością poprzez hamowanie centrioli. Podstawowa przyczyna pozornej selektywności szoku cieplnego w przypadku duplikacji centrioli jest nieznana, ale może być związana z selektywną degradacją podstruktur centrosomów obserwowaną pod wpływem stresu cieplnego w niektórych typach komórek, takich jak leukocyty 5.
Czasowa synchronizacja rozwoju embrionalnego jest osiągana przez zapłodnienie in vitro (IVF). Użycie nieleczonych plemników podczas zapłodnienia powoduje, że diploidalne zarodki stają się diploidalne, które po indukowanej przez HS2 jednocyklowej cytokinezie stają się tetraploidalne. Użycie plemnika poddanego działaniu promieniowania UV, który przenosi wiązania krzyżowe, które dezaktywują jego DNA, powoduje powstanie haploidalnych zarodków gynogenetycznych 6, które po indukowanej przez HSII jednocyklowej cytokinezie stają się diploidami gynogenetycznymi 2. Ze względu na wynikającą z tego duplikację całego genomu, te ostatnie diploidy gynogenetyczne są homozygotyczne w każdym pojedynczym locus w całym genomie. Dla zwięzłości gynogenetyczne zarodki haploidalne nazywamy "haploidami", a homozygotyczne gynogenetyczne zarodki diploidalne jako "homozygotyczne diploidy". Jeśli są żywotne i płodne, homozygotyczne diploidy mogą być używane do inicjowania sterylnych i wolnych od śmiertelności linii. Bezpośrednia homozygotyczność indukowana przez HS2 powinna być również łatwo włączona do analizy genetycznej lub genetycznych badań przesiewowych, ponieważ homozygotyczne diploidy pochodzące od samic, które są heterozygotycznymi nosicielkami mutacji, wykazują wskaźniki homozygotyczności w wysokich i stałych (50%) proporcjach2.
Poniższy protokół opisuje kroki do przeprowadzenia HS2 i wywołania duplikacji ploidalności z pełną homozygotycznością. W przypadku produkcji tetraploidalnej roztwór nasienia nie powinien być leczony. W przypadku produkcji diploidalnej homozygoty plemniki należy inaktywować przez obróbkę UV. Ponadto, jak opisano w Dyskusji, widoczne markery barwnikowe mogą być również wykorzystywane do ułatwienia identyfikacji homozygotycznych diploidów. Danio pręgowany łączą się w pary głównie w ciągu pierwszych 3 godzin od rozpoczęcia cyklu świetlnego 7, a zarówno dorosłe osobniki, jak i jaja są wrażliwe na rytmy okołodobowe 8, więc dla najlepszych wyników procedura IVF powinna odbyć się w tym okresie.

<table><tbody><tr><td>Pudełka godowe danio pręgowanego</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>Zatwierdzony przez FDA (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>do przygotowania 1 M Tris pH 9,0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>do przygotowania 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Siatka na ryby (drobna siatka) (4-5 cali)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>dostępna w ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Plastikowa łyżka</td><td></td><td></td><td>dostępna w większości standardowych sklepów</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>dostępne w Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Stereoskop preparacyjny (ze źródłem światła przechodzącego)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Odblaskowe źródło światła (ramiona LED)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Płytki Petriego o średnicy</td><td></td><td></td> 10 cm <td>dowolna maszyna</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td></td><td></td><td>dowolna maszyna</td></tr><tr><td>Wiaderko</td><td></td><td></td> <td>na lóddowolny producent</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>dowolny producent</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1,000 &micro; l</td><td></td><td></td><td>dowolny producent</td></tr><tr><td>Wąska szpatułka</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płyta depresyjna</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher kat. Nr 13-748B)</td> <td>dostępny w Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Lampa UVP</td><td></td><td>Model XX-15 (nr kat. UVP18006201)</td> <td>dostępne w Fisher Scientific. Chociaż nie zaobserwowaliśmy tego modelu w przypadku niektórych źródeł promieniowania UV, zaobserwowano, że z czasem zmniejsza się intensywność (jeśli tak jest, patrz Modyfikacje i rozwiązywanie problemów)</td></tr><tr><td>Okulary</td><td></td><td></td> UV <td>dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Ręczniki</td><td></td><td></td> papierowe <td>dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>dostępne w stoperze</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Fisher Scientific Timerdowolny ekspres</td></tr><tr><td>Butelka do mycia</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>dostępna w Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sitko</td><td></td><td></td><td>do herbaty dostępne w sklepach kuchennych</td></tr><tr><td>zlewki, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>dostępne w</td></tr><tr><td>kąpieli wodnej Fisher Scientific (2)</td><td></td><td></td><td>dowolny producent, z dokładnością do 0,1 C (np. Shel Lab H2O Bath Series)</td></tr><tr><td>Hanks' Roztwór 1</td>, <td>patrz wyżej</td>, <td>patrz wyżej</td><td>: 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl w 100 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Hanksa' Roztwór 2</td><td>patrz wyżej</td>, <td>patrz wyżej</td><td>0,358 g Bezwodny Na2HPO4, 0,6 g KH2PO4 w 100 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</td></tr><tr><td>Hanksa' Roztwór 4</td>, <td>patrz wyżej</td>, <td>patrz wyżej</td>: <td>0,72 g CaCl2 w 50 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Hank's Premix,</td><td>patrz wyżej</td>, <td>patrz wyżej</td><td>, dodaj, w następującej kolejności: 10,0 ml Roztwór 1; &nbsp; 1,0 ml roztwór 2; &nbsp; 1,0 ml roztwór 4; &nbsp; 86,0 ml ddH2O; &nbsp; 1,0 ml Roztwór 5. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>. Hanksa Roztwór 6</td>, <td>patrz wyżej</td>, <td>patrz wyżej</td>: <td>0,33 g NaHCO3 w 10 ml ddH2O. Przygotować rano w dniu zabiegu in vitro.</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Hanka (rozwiązanie końcowe)</td> <td>patrz wyżej</td> patrz <td>wyżej</td><td>Kombajn 990 &mu; l z Hank' s Premiks i 10 &mu; l świeżo przygotowanego roztworu 6 (NaHCO3 roztworu)</td></tr></tbody></table>

manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulacja ploidalnością pozwala na użyteczne transformacje, takie jak diploidy na tetraploidy, czy haploidy na diploidy. U danio pręgowanego Danio rerio, w szczególności wytwarzanie homozygotycznych diploidów gynogenetycznych jest przydatne w analizie genetycznej, ponieważ umożliwia bezpośrednią produkcję homozygot od jednej heterozygotycznej matki. W tym artykule opisano zmodyfikowany protokół duplikacji ploidalności oparty na impulsie cieplnym podczas pierwszego cyklu komórkowego, Heat Shock 2 (HS2). Poprzez hamowanie duplikacji centrioli, metoda ta powoduje precyzyjne zatrzymanie podziału komórki podczas drugiego cyklu komórkowego. Precyzyjne jednocyklowe zatrzymanie podziału, w połączeniu z niezakłóconą duplikacją DNA, powoduje duplikację całego genomu. Protokoły związane z tą metodą obejmują pobieranie komórek jajowych i plemników, obróbkę plemników promieniowaniem UV, zapłodnienie in vitro i impuls cieplny w celu spowodowania opóźnienia podziału cyklu komórkowego i duplikacji ploidalności. Zmodyfikowana wersja tego protokołu może być zastosowana do wywoływania zmian ploidalnych u innych gatunków zwierząt.

Pomimo zatrzymania cytokinezy w jednym cyklu komórkowym, replikacja DNA w takich embrionach przebiega prawidłowo, co prowadzi do podwojenia zawartości DNA embrionu (Rycina 1). Protokół szoku termicznego Streisingera (standardowy HS) obejmuje impuls cieplny w okresie 13-15 minut po zapłodnieniu (mpf) i indukuje przede wszystkim zatrzymanie cytokinezy podczas pierwszego podziału komórkowego embrionu w 35 mpf 1,2, natomiast opisana tutaj zmodyfikowana metoda, okre...

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest promowanie diploidyzacji we wczesnym embrionie danio pręgowanego poprzez inhibicję cytochinezy odpowiadającej jednemu cyklowi komórkowemu embrionu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki, na przykład poprzez identyfikację genów zaangażowanych w cechy osobników dorosłych lub cechy rozrodcze, tworzenie linii inbredowych lub inne manipulacje genetyczne. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i skuteczność w promowaniu diploidyzacji, co pozwala na bezpośrednią homozygotyzację alleli obecnych u pojedynczego osobnika heterozygotycznego.Popołudniem w dniu poprzedzającym eksperyment należy przygotować pary do rozrodu pożądanego szczepu zebrafish w standardowych pojemnikach do rozrodu zebrafish z przegrodami oddzielającymi samce od samic. Rano w dniu eksperymentu należy usunąć fizyczną przegrodę, aby umożliwić składanie ikry. Należy przeprowadzić inspekcję wizualną zbiorników z parami w celu wykrycia wydalenia ikry podczas naturalnego rozrodu.Przy pierwszych oznakach wypychania ikry oddziel samca od samicy, aby przerwać proces rozrodu. Wybrane wcześniej samice trzymaj osobno lub razem w jednym zbiorni

ploidy-manipulation-of-zebrafish-embryos-with-heat-shock-2-treatment

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku...

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru stresu oksydacyjnego u żywych zarodków danio pręgowanego. Procedura ta umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w całych tkankach zarodka, jak i w populacjach pojedynczych komórek. W ramach tego protokołu zostaną przeprowadzone zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe.

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj metodę diploidyzacji zarodków Danio rerio za pomocą szoku cieplnego. Technika ta umożliwia bezpośrednią homozygozę alleli i tworzenie linii inbredowych w badaniach genetycznych.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Przeglądaj więcej filmów