Name: Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Poznaj metody wytwarzania degradowalnych hydrożeli termoczułych o kontrolowanej skali długości i geometrii. Techniki obejmują wytłaczanie reaktywne, mikrofluidykę, samoorganizację i elektroprzędzenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie z Kanadyjskiej Rady ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC), programu NSERC CREATE-IDEM (Integrated Design of Extracellular Matrices), 20/20: NSERC Ophthalmic Biomaterials Research Network oraz programu Ontario Ministry of Research and Innovation Early Researcher Awards.

<ol><li>Heskins, M., Guillet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10601326808051910">Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide).</a> J. Macromol. Sci. A. 2 (8), 1441-1455 (1968).</li>
<li>Lutz, J. -F., Akdemir, Ö, Hoth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+by+Point+Comparison+of+Two+Thermosensitive+Polymers+Exhibiting+a+Similar+LCST%3A+Is+the+Age+of+Poly%28NIPAM%29+Over%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Point by Point Comparison of Two Thermosensitive Polymers Exhibiting a Similar LCST: Is the Age of Poly(NIPAM) Over.</a> J. Am. Chem. Soc. 128 (40), 13046-13047 (2006).</li>
<li>Pelton, R. H., Chibante, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0166662286802748">Preparation of Aqueous Lattices with N-Isopropylacrylamide.</a> Colloids Surf. 20 (3), 247-256 (1986).</li>
<li>Palasis, M., Gehrke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0168365992902056">Permeability of Responsive Poly(N-Isopropylacrylamide) Gel to Solutes.</a> J. Controlled Release. 18 (1), 1-11 (1992).</li>
<li>Kawaguchi, H., Fujimoto, K., Mizuhara, Y. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00656929">Hydrogel Microspheres .3. Temperature-Dependent Adsorption of Proteins on Poly-N-Isopropylacrylamide Hydrogel Microspheres.</a> Colloid Polym. Sci. 270 (1), 53-57 (1992).</li>
<li>Okuyama, Y., Yoshida, R., Sakai, K., Okano, T., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8241069">Swelling Controlled Zero-Order and Sigmoidal Drug-Release from Thermoresponsive Poly(N-Isopropylacrylamide-Co-Butyl Methacrylate) Hydrogel.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 4 (5), 545-556 (1993).</li>
<li>Snowden, M. J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlelanding/1992/c3/c39920000803#!divAbstract">The Use of Poly(N-Isopropylacrylamide) Lattices as Novel Release Systems.</a> J. Chem. Soc. - Chem. Comm. (11), 803-804 (1992).</li>
<li>Haraguchi, K., Takehisa, T., Ebato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cultivation+and+cell+sheet+detachment+on+the+surface+of+polymer%2Fclay+nanocomposite+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Control of cell cultivation and cell sheet detachment on the surface of polymer/clay nanocomposite hydrogels.</a> Biomacromolecules. 7 (11), 3267-3275 (2006).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiated+chemical+vapor+deposition+of+thermoresponsive+poly%28N-vinylcaprolactam%29+thin+films+for+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Initiated chemical vapor deposition of thermoresponsive poly(N-vinylcaprolactam) thin films for cell sheet engineering.</a> Acta Biomater. 9 (8), 7691-7698 (2013).</li>
<li>Cole, M. A., Voelcker, N. H., Thissen, H., Griesser, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+interfaces+and+systems+for+the+control+of+protein-surface+and+cell-surface+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive interfaces and systems for the control of protein-surface and cell-surface interactions.</a> Biomaterials. 30 (9), 1827-1850 (2009).</li>
<li>Feil, H., Bae, Y. H., Feijen, J., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037673889180099R">Molecular Separation by Thermosensitive Hydrogel Membranes.</a> J. Membrane Sci. 64 (3), 283-294 (1991).</li>
<li>Kim, J., Park, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10432576">Smart hydrogels for bioseparation.</a> Bioseparation. 7 (4-5), 177-184 (1998).</li>
<li>Yamashita, K., Nishimura, T., Nango, M. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pat.290/abstract">Preparation of IPN-type stimuli responsive heavy-metal-ion adsorbent gel.</a> Polym. Adv. Tech. 14 (3-5), 189-194 (2003).</li>
<li>Ziolkowski, B., Czugala, M., Diamond, D. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1045389X12459591?journalCode=jima">Integrating stimulus responsive materials and microfluidics: The key to next-generation chemical sensors.</a> J. Intelligent Mater. Syst. Struct. 24 (18), 2221-2238 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Kato, S., Anazawa, T. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0964-1726/16/6/020">A flap-type hydrogel actuator with fast responses to temperature.</a> Smart Mater. Struct. 16 (6), 2175-2182 (2007).</li>
<li>Suzuki, D., Taniguchi, H., Yoshida, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomously+Oscillating+Viscosity+in+Microgel+Dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Autonomously Oscillating Viscosity in Microgel Dispersions.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (34), 12058-12059 (2009).</li>
<li>Schild, H. G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/007967009290023R">Poly(N-isopropylacrylamide): Experiment, Theory and Application.</a> Prog. Polym. Sci. 17, 163-249 (1992).</li>
<li>Oh, J. K., Min, K., Matyjaszewski, K. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma060258v">Preparation of poly (oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate) by homogeneous aqueous AGET ATRP.</a> Macromolecules. 39 (9), 3161-3167 (2006).</li>
<li>Vihola, H., Laukkanen, A., Tenhu, H., Hirvonen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Release+Characteristics+of+Physically+Cross-Linked+Thermosensitive+Poly%28N-vinylcaprolactam%29+Hydrogel+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Drug Release Characteristics of Physically Cross-Linked Thermosensitive Poly(N-vinylcaprolactam) Hydrogel Particles.</a> J. Pharm. Sci. 97 (11), 4783-4793 (2008).</li>
<li>Zhang, L. F., Liang, Y., Meng, L. Z. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pat.1495/abstract">Thermo-sensitive amphiphilic poly(N-vinylcaprolactam) copolymers: synthesis and solution properties.</a> Polym. Adv. Tech. 21 (10), 720-725 (2010).</li>
<li>Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+tunable+poly%28ethylene+glycol%29+analogue+hydrogels+based+on+poly%28oligoethylene+glycol+methacrylate%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Injectable and tunable poly(ethylene glycol) analogue hydrogels based on poly(oligoethylene glycol methacrylate).</a> Chem. Comm. 50 (25), 3306-3309 (2014).</li>
<li>Lutz, J. -F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pola.22706/full">Polymerization of oligo (ethylene glycol)(meth) acrylates: toward new generations of smart biocompatible materials.</a> J. Polym. Sci. A. 46 (11), 3459-3470 (2008).</li>
<li>Lutz, J. -F., Hoth, A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma0517042">Preparation of Ideal PEG Analogues with a Tunable Thermosensitivity by Controlled Radical Copolymerization of 2-(2-Methoxyethoxy)ethyl Methacrylate and Oligo(ethylene glycol) Methacrylate.</a> Macromolecules. 39 (2), 893-896 (2006).</li>
<li>Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Gelation+Time+and+Morphology+of+Injectable+Hydrogels+Using+Ketone-Hydrazide+Cross-Linking%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking.</a> Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).</li>
<li>Patenaude, M., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/mz200121k">Injectable, Degradable Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide) Hydrogels.</a> ACS Macro Lett. 1 (3), 409-413 (2012).</li>
<li>Patenaude, M., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable%2C+Mixed+Natural-Synthetic+Polymer+Hydrogels+with+Modular+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Injectable, Mixed Natural-Synthetic Polymer Hydrogels with Modular Properties.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 369-378 (2012).</li>
<li>Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+poly%28oligoethylene+glycol+methacrylate%29-based+hydrogels+with+tunable+phase+transition+behaviours%3A+Physicochemical+and+biological+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Injectable poly(oligoethylene glycol methacrylate)-based hydrogels with tunable phase transition behaviours: Physicochemical and biological responses.</a> Acta Biomater. 10 (10), 4143-4155 (2014).</li>
<li>Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-Induced+Assembly+of+Monodisperse%2C+Covalently+Cross-Linked%2C+and+Degradable+Poly%28N-isopropylacrylamide%29+Microgels+Based+on+Oligomeric+Precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Temperature-Induced Assembly of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, and Degradable Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels Based on Oligomeric Precursors.</a> Langmuir. 31, 5767-5778 (2015).</li>
<li>Bakaic, E., Smeets, N. M. B., Dorrington, H., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ra/c5ra00920k?iscitedby=True#!divAbstract">"Off-the-shelf" thermoresponsive hydrogel design: tuning hydrogel properties by mixing precursor polymers with different lower-critical solution temperatures.</a> RSC Adv. 5 (42), 33364-33376 (2015).</li>
<li>Bulpitt, P., Aeschlimann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategy+for+chemical+modification+of+hyaluronic+acid%3A+Preparation+of+functionalized+derivatives+and+their+use+in+the+formation+of+novel+biocompatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: Preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels.</a> J. Biomed. Mater. Res. 47 (2), 152-169 (1999).</li>
<li>Kesselman, L. R. B., Shinwary, S., Selvaganapathy, P. R., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Monodisperse%2C+Covalently+Cross-Linked%2C+Degradable+%22Smart%22+Microgels+Using+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, Degradable "Smart" Microgels Using Microfluidics.</a> Small. 8 (7), 1092-1098 (2012).</li>
<li>Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/sm/c7sm01361b#!divAbstract">Microfluidic production of degradable thermoresponsive microgels based on poly(N-isopropylacrylamide).</a> Soft Matter. , (2016).</li>
<li>Xu, F., Sheardown, H., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Electrospinning+of+Degradable+Poly%28oligoethylene+glycol+methacrylate%29-Based+Nanofibrous+Hydrogel+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Reactive Electrospinning of Degradable Poly(oligoethylene glycol methacrylate)-Based Nanofibrous Hydrogel Networks.</a> Chem. Comm. 52 (7), 1451-1454 (2016).</li>
<li>Troll, K., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00396-008-1871-5">The collapse transition of poly(styrene-b-(N-isopropyl acrylamide)) diblock copolymers in aqueous solution and in thin films.</a> Colloid Polym. Sci. 286 (8), 1079-1092 (2008).</li>
<li>Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Gelation+Time+and+Morphology+of+Injectable+Hydrogels+Using+Ketone-Hydrazide+Cross-Linking%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking.</a> Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).</li>
<li>Kelly, T. A., Felder, M. S., Ollar, R. A. Inducing Apoptosis in a Mammalian Cell by Contacting with Paraffin or Agar. US Patent. , 6,274,377 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały inteligentne przyciągnęły znaczną uwagę ze względu na ich potencjał do odwracalnych odpowiedzi „na żądanie” na sygnały zewnętrzne i/lub środowiskowe. Materiały responsywne na temperaturę wzbudziły szczególne zainteresowanie ze względu na ich zachowanie związane z dolną krytyczną temperaturą rozpuszczalności (LCST), co prowadzi do wytrącania sterowanego temperaturą w temperaturach T&gt;LCST1,2. W kontekście hydrożeli termoreaktywnych zachowanie to przejawia się poprzez odwracalne procesy pęcznienia i odkurczania, które skutkują możliwością regulacji temperatury w odniesieniu do rozmiarów masywnych (większych przy T&lt;LCST)3, wielkości porów (większych przy T&lt;LCST)4 oraz właściwości międzyfazowych (bardziej hydrofilnych przy T&lt;LCST)5. Takie przejścia znajdują szerokie zastosowanie w dostarczaniu leków (w celu uwalniania leków wyzwalanego zewnętrznie lub środowiskowo4,6,7), inżynierii tkankowej i kulturach komórkowych (w celu termoodwracalnej adhezji/delaminacji komórek8,9,10), procesach separacji (w celu uzyskania przełączalnej porowatości i przepuszczalności membran lub termicznie odzyskiwalnych podłoży diagnostycznych11,12,13), procesach mikrofluidycznych (w celu zastosowania zaworów on-off regulujących przepływ14,15) oraz jako modyfikatory reologiczne (w celu uzyskania lepkości regulowanej temperaturą16). Najczęściej badane hydrożele termoreaktywne opierają się na poli(N-izopropryloakryloamidzie) (PNIPAM)17, choć znaczące (i rosnące) prace prowadzono również nad poli(metakrylanem oligoglikolu etylenowego) (POEGMA)2,18 oraz poli(winylokaprolaktamem) (PVCL)19,20. POEGMA wzbudził w ostatnim czasie szczególne zainteresowanie ze względu na przewidywaną poprawioną biokompatybilność21,22 oraz łatwo regulowane zachowanie LCST, w którym liniowo przewidywalne mieszaniny monomerów z różną liczbą jednostek powtarzalnych tlenku etylenu w łańcuchach bocznych mogą zmieniać LCST w zakresie od ~20 °C do &gt;90 °C2,23. Jednakże każdy z tych polimerów jest otrzymywany w drodze polimeryzacji rodnikowej i w związku z tym posiada szkielet węglowo-węglowy, co znacząco ogranicza potencjalną użyteczność i możliwość wdrożenia takich polimerów w kontekście zastosowań biomedycznych, w których degradacja (lub przynajmniej zdolność do usuwania poprzez filtrację nerkową) jest zazwyczaj wymagana.
W odpowiedzi na to ograniczenie niedawno szczegółowo opisaliśmy zastosowanie chemii hydrazonów (t.j. reakcji między hydrazydem a prepolimerami funkcjonalizowanymi grupami aldehydowymi) do przygotowania degradowalnych analogów hydrożeli termowrażliwych24,25,26,27,28,29. Szybka i odwracalna reakcja między grupami hydrazydowymi i aldehydowymi po zmieszaniu funkcjonalizowanych polimerów prekursorowych30 umożliwia zarówno żelowanie in situ (co pozwala na łatwe wstrzykiwanie tych materiałów bez konieczności implantacji chirurgicznej czy stosowania jakiegokolwiek zewnętrznego bodźca polimeryzacyjnego, takiego jak naświetlanie UV lub inicjacja chemiczna), jak i degradację hydrolityczną sieci z szybkością kontrolowaną przez chemię i gęstość miejsc sieciowania. Ponadto, dzięki utrzymaniu masy cząsteczkowej prepolimerów użytych do przygotowania hydrożeli poniżej progu filtracji nerkowej, hydrożele wytwarzane tą metodą degradują z powrotem do oligomerycznych polimerów prekursorowych, które mogą zostać usunięte z organizmu25,27,28. W połączeniu z niską cytotoksycznością i słabą odpowiedzią zapalną tkanek wywoływaną przez te materiały25,26,27, podejście to oferuje potencjalnie aplikowalną metodę wykorzystania inteligentnych hydrożeli termowrażliwych w medycynie, szczególnie jeśli uda się wytworzyć dobrze kontrolowane degradowalne analogi takich hydrożeli we wszystkich skalach długości (makro-, mikro- i nanoskali).
W niniejszym protokole opisujemy metody otrzymywania syntetycznych termoreaktywnych prepolimerów funkcjonalizowanych kontrolowaną liczbą grup hydrazydowych i aldehydowych, a także metody zastosowania tych polimerów do tworzenia hydrożeli o ściśle określonych wymiarach w różnych skalach długości. W szczególności niniejszy artykuł opisuje cztery odrębne podejścia, które opracowaliśmy w celu kontrolowania mieszania reaktywnych prepolimerów funkcjonalizowanych hydrazydami i aldehydami, co pozwala na tworzenie termoreaktywnych sieci hydrożelowych o ściśle określonej geometrii i morfologii:
Aby stworzyć biodegradowalne hydrożele objętościowe o określonych rozmiarach, zastosowano strategię szablonową, w której reaktywne prepolimery są ładowane do osobnych cylindrów strzykawki dwucylindrycznej wyposażonej na wylocie w mieszalniku statycznym, a następnie wspólnie ekstrudowane do silikonowej formy o pożądanym kształcie i wymiarach hydrożelu21,27 (Rysunek 1).
<img alt="Proces syntezy hydrożelu żelującego in situ; polimery hydrazydowe i aldehydowe; schemat sieciowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat tworzenia hydrożelu masowego. Roztwory polimerów funkcjonalizowanych hydrazydami i aldehydami (w wodzie lub buforze wodnym) są wprowadzane do oddzielnych cylindrów dwutłokowej strzykawki, a następnie wspólnie wytłaczane przez mieszalnik statyczny do cylindrycznej formy silikonowej. Szybka żelacja in situ po zmieszaniu prowadzi do powstania hydrożelu sieciowanego wiązaniami hydrazonowymi, który staje się samodzielny (po wyjęciu z formy) w czasie od kilku sekund do kilku minut, w zależności od stężenia i gęstości grup funkcyjnych polimerów prekursorowych. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W celu wytworzenia biodegradowalnych cząsteczek żelu w skali mikronowej opisano metodę reaktywnej mikrofluidyki, w której roztwory polimerów prekursorowych są jednocześnie mieszane i emulgowane przy użyciu projektu chipa mikrofluidycznego wykonanego metodą miękkiej litografii, co umożliwia formowanie mieszanych kropli reaktywnych polimerów, które następnie żelują in situ, tworząc mikrocząsteczki żelu o rozmiarach zdefiniowanych przez emulsję (Rysunek 2)31,32.
<img alt="Schemat chipa mikroprzepływowego do tworzenia kropel polimerowych z wlotami dla aldehydu i hydrazydy; wyniki tworzenia kropel." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat tworzenia mikrocząsteczek żelu za pomocą reaktywnej mikroprzepływowości. (A,B) Roztwory polimerów funkcjonalizowanych hydrazydą i aldehydem (w wodzie lub buforze wodnym) są podawane za pomocą pompy strzykawkowej do oddzielnych zbiorników, które są połączone poniżej przez zygzakowaty układ kanałów zaprojektowany w celu stworzenia gradientu ciśnienia zapobiegającego cofaniu się przepływu. Polimery są następnie mieszane tuż przed poddaniem ich działaniu sił ścinających oleju parafinowego przepływającego z obu stron (również tłoczonego pompą strzykawkową) i wymuszeniem przepływu przez dyszę, co prowadzi do wytworzenia kropel wodnych (roztworu polimeru) w ciągłej fazie oleju parafinowego metodą ogniskowania przepływu (flow-focusing) (patrz (B) w celu uzyskania ilustracji obszaru dyszy i procesu tworzenia kropel). Dwa dodatkowe wloty oleju parafinowego są rozmieszczone za dyszą, aby dodatkowo odseparować krople w kanale zbierającym, co umożliwia pełną żelację przed usunięciem cząstek z przepływu laminarnego, po czym powstałe mikrocząsteczkowe żele są zbierane w zlewce z mieszadłem magnetycznym; (C) Zdjęcie procesu generowania kropel w dyszy (należy zauważyć, że polimer hydrazydowy jest oznaczony kolorem niebieskim w celu zilustrowania mieszania)
W celu wytworzenia biodegradowalnych cząstek żelu w nanoskali opisano metodę reakcyjnego samozgromadzenia napędzanego termicznie, w której roztwór jednego z reaktywnych polimerów prekursorowych (polimeru „zarodkowego”) jest podgrzewany powyżej jego LCST w celu utworzenia stabilnego nanoagregatu, który następnie zostaje sieciowany poprzez dodanie komplementarnego reaktywnego polimeru prekursorowego (polimeru „sieciującego”); otrzymany nanożel sieciowany wiązaniami hydrazonowymi ma rozmiar bezpośrednio wyznaczony przez nanoagregat (Rycina 3)28.
<img alt="Schemat ogrzewania polimeru hydrazydowego; tworzenie się nanoagregatu, dodanie aldehydu w celu utworzenia nanogelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat tworzenia nanogelu poprzez reaktywny samoorganizujący się proces napędzany termicznie. Wodny roztwór zawierający (termoresponsywny) polimer funkcjonalizowany grupami hydrazydowymi jest ogrzewany powyżej jego dolnej krytycznej temperatury rozpuszczalności (LCST), aby utworzyć stabilny, niesieciowany nanoagregat. Następnie dodawany jest polimer funkcjonalizowany grupami aldehydowymi w celu sieciowania nanoagregatu poprzez tworzenie wiązań hydrazonowych, co stabilizuje cząstkę nanogelu po schłodzeniu poniżej LCST. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
W celu wytworzenia biodegradowalnych nanowłókien opisano technikę reaktywnego elektroprzędzenia, w której strzykawka dwukanałowa wyposażona w mieszalnik statyczny na wylocie (stosowana do otrzymywania hydrożeli masowych) jest podłączona do standardowej platformy do elektroprzędzenia (Rysunek 4)33.
<img alt="Proces elektroprzędzenia z pompą strzykawkową, zbieranie włókien, tworzenie hydrazonów, sieć włókien SEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Schemat tworzenia nanofibryli hydrożelu poprzez reaktywne elektroprzędzenie. Strzykawka dwukanałowa z mieszaczem statycznym (napełniona zgodnie z opisem dla hydrożeli masowych, ale zawierająca również frakcję wysokocząsteczkowego poli(tlenku etylenu) jako wspomagacz elektroprzędzenia) jest zamontowana na pompie strzykawkowej, a igła na końcu strzykawki jest podłączona do zasilacza wysokiego napięcia. Sieciowanie hydrazonowe zachodzi podczas procesu przędzenia włókien, dzięki czemu w momencie uderzenia strumienia w kolektor (folię aluminiową lub obracający się dysk aluminiowy) zachowana zostaje morfologia nanofibrylarna. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zastosowanie takich metod do tworzenia degradowalnych inteligentnych sieci hydrożelowych zostało zademonstrowane w niniejszym protokole z wykorzystaniem PNIPAM lub POEGMA jako polimerów docelowych; jednak opisane podstawowe podejścia można przenieść na dowolny polimer rozpuszczalny w wodzie, po wprowadzeniu odpowiednich korekt w zakresie lepkości oraz (w przypadku metody wytwarzania nanogelu poprzez samoorganizację) stabilności prepolimeru podczas tworzenia zarodkowego nanoagregatu.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,2 - ester dimetylowy kwasu azobisisobutryic</td><td>Wako Chemicals</td><td>101138</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylan eteru metylowego (M(EO)2MA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447927</td><td>188,2 g/mol, n=2 jednostki powtórzeń tlenku etylenu</td></tr><tr><td>Oligo (glikol etylenowy) metakrylan eteru metylowego (OEGMA475)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>475 g/mol, n=8-9 powtarzających się jednostek tlenku etylenu</td></tr><tr><td>Kwas akrylowy (AA), 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Kwas tioglikolowy (TGA), 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3758</td><td></td></tr><tr><td>Dioksan, 99%</td><td>Caledon Labs</td><td>360481</td><td></td></tr><tr><td>Azot, klasa UHP</td><td>Air Liquide</td><td>Alphagaz1 765A-44</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH), 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15119</td><td></td></tr><tr><td>N'-etylo-N-(3-dimetyloaminopropylo)-karmodiimid (EDC, x%)</td><td>Karbosyntolit</td><td>FD05800</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl), 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH), 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacetyloaldehyd dimetyloacetal, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>121967</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy-TEMPO, 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>chlorek metakryloilo,97x%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523216</td><td></td></tr><tr><td>eter naftowy, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32047</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu, 99,5%</td>eter tert-butylowy <td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>, >99,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>443808</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna</td> <td>buforowana fosforanemBioShop</td><td>PBS405.1</td><td>1x, pH 7,3-7,5</td></tr><tr><td>N-izopropylokrylakamid, 99%</td><td>J& K Scientific</td><td>258717</td><td>Rekrystalizowany z 60% heksanów/40% toluenu</td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny</td><td>Komercyjne alchole</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Rozpiętość 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6760</td> Ciężki olej parafinowy Caledon Labs 1326197 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentan, klasa odczynnika</td><td>Caledon</td><td>Labs 1/10/7800</td><td></td></tr><tr><td>Średnia wartość poli(tlenku etylenu) 600 000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>Materiały niezbędne do syntezy i produkcji hydrożeli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Heidolph</td><td>G3</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy (odcięcie masy cząsteczkowej 3500 Da)</td><td>Spectrum Labs</td><td>28170-166</td><td>Vol/length = 6,4 ml / cm</td></tr><tr><td>Strzykawka dwucylindrowa</td><td>Medmix</td><td>L seria</td><td>L seria, 2,5 mL, stosunek objętości 1:1</td></tr><tr><td>Mikser statyczny</td><td>Medmix</td><td>serii L</td><td>Seria L, 2,5 mL, stosunek objętości 1:1, długość 1,5"</td></tr><tr><td>Arkusz gumy silikonowej, grubość 1/16"</td><td>McMaster-Carr</td><td>9010K12, 30A Durometer (Super Soft)</td><td></td></tr><tr><td>Pompka strzykawkowa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS Legato 200</td><td>Infuse Only Podwójna pompa strzykawkowa</td></tr><tr><td>Zasilacz wysokonapięciowy</td><td>Spellman</td><td>230-20R</td><td>0 do 20 kV</td></tr><tr><td>Microfluidic Chip Fabrication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>University Wafer</td><td>2080</td><td>D = 76,2 mm; 380 &mikro; m grubość; Domieszkowane P; < 100> orientacja&nbsp;</td></tr><tr><td>SU-8 100</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa 2,5-calowa maszyna do powlekania</td><td>Zbudowany we własnym</td> zakresie Nakładka do masek <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>KARL SUSS</td><td>MJB3 UV400 (z lampą 276 W)</td><td></td></tr> <tr><td>Rurka silikonowa Masterflex L/S 13</td><td>Cole Parmer</td><td>OF-96400-13</td><td>Utwardzana</td></tr> <tr><td>nadtlenkiemDow Corning Sygard 184 Baza z elastomeru silikonowego&nbsp;</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Sygard 184 Utwardzacz z elastomeru silikonowego&nbsp;</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>środek do czyszczenia plazmowego o dużej mocy&nbsp;</td><td>Harrick</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Instrumenty do charakteryzacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mach 1 tester mikromechaniczny</td><td>Biomomentum</td><td>LB007-PL</td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa Cellstar 12-dołkowa płytka</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórkowej na płytkę 12-dołkową</td><td>Corning</td><td>08-771-12</td><td>8 &micro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>optyczny Olympus BX51 Mikroskop optyczny</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Stolik mikroskopu z kontrolowaną temperaturą</td><td>Linkam Scientific</td><td>THMS600</td><td></td></tr><tr><td>Chromatograf z przenikaniem żelu (GPC)</td><td>Wody</td><td>590 Pompa HPLC</td><td>Wody Kolumny styragelowe (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7,8 mm (ID); cząstki 5 mm), Detektor indeksu refrakcji Waters 410</td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)</td><td>Analizator</td><td></td><td>wielkości cząstek Brookhaven 90Plus</td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)</td><td>TEMSCAN</td><td>JEOL 1200EX</td><td>Napięcie przyspieszające 100 kV</td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)</td><td>Tescan</td><td>Vega II LSU</td><td>Napięcie przyspieszające 10 kV</td></tr><tr><td>Microsquisher</td><td>CellScale Biomaterials Testing</td><td>MS-50M-01</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Chociaż różne inteligentne materiały były badane do różnych zastosowań biomedycznych (np. dostarczanie leków, inżynieria tkankowa, bioobrazowanie, itp.), ich ostateczne zastosowanie kliniczne zostało utrudnione przez brak biologicznie istotnej degradacji obserwowanej dla większości inteligentnych materiałów. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku hydrożeli reagujących na temperaturę, które są prawie jednolicie oparte na polimerach, które są funkcjonalnie nieulegające degradacji (np. poli(N-izopropyloakrylamid) (PNIPAM) lub metakrylan poli(oligoetylenoglikolu) (POEGMA)). W związku z tym, aby skutecznie przełożyć potencjał termoczułych hydrożeli na wyzwania związane ze zdalnie sterowanym lub regulowanym metabolizmem dostarczaniem leków, rusztowań komórkowych z przestrajalnymi interakcjami komórka-materiał, materiałów teranotycznych o potencjale zarówno do obrazowania, jak i dostarczania leków oraz innych podobnych zastosowań, wymagana jest metoda uczynienia hydrożeli (jeśli nie w pełni degradowalnymi) przynajmniej zdolnymi do klirensu nerkowego po wymaganym okresie eksploatacji materiału. W tym celu protokół ten opisuje przygotowanie hydrolitycznie degradowalnych hydrożeli usieciowanych hydrazonem w wielu skalach długości w oparciu o reakcję między hydrazydem a funkcjonalizowanymi aldehydem oligomerami PNIPAM lub POEGMA o masie cząsteczkowej poniżej granicy filtracji nerkowej. W szczególności opisano metody wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli luzem (przy użyciu techniki strzykawki dwulufowej), cząstek hydrożelu (zarówno w skali mikro dzięki zastosowaniu platformy mikroprzepływowej ułatwiającej jednoczesne mieszanie i emulgowanie polimerów prekursorowych, jak i w nanoskali dzięki zastosowaniu metody samoorganizacji i sieciowania napędzanego termicznie) oraz nanowłókien hydrożelowych (przy użyciu strategii reaktywnego elektroprzędzenia). W każdym przypadku można uzyskać hydrożele o właściwościach reagujących na temperaturę, podobnych do tych osiąganych w konwencjonalnych procesach sieciowania wolnych rodników, ale sieć usieciowana hydrazonem może z czasem ulec degradacji w celu ponownego uformowania oligomerycznych polimerów prekursorowych i umożliwienia klirensu. W związku z tym przewidujemy, że te metody (które mogą być ogólnie stosowane do dowolnego syntetycznego polimeru rozpuszczalnego w wodzie, a nie tylko do materiałów inteligentnych) umożliwią łatwiejsze zastosowanie syntetycznych materiałów inteligentnych do zastosowań klinicznych.

Hydrożele masowe wytłaczane z dwuprzedziałowej strzykawki do formy silikonowej dopasowują się do wymiarów formy i stają się samonośne po jej usunięciu; żelowanie następuje zazwyczaj od kilku sekund do kilku minut po współwytłaczaniu, w zależności od zastosowanych prekursorów polimerowych. Typowa charakterystyka przeprowadzona poprzez pomiar pęcznienia (mierzone grawimetrycznie przy użyciu wkładki do hodowli komórkowych, aby łatwo usunąć hydrożel z roztworu pęczniejącego), termoreaktywności (mierzonej tą samą techniką, ale z cykliczną zmianą temperatury inkubacji powyżej i poniżej temperatury przejścia fazowego), degradacji (mierzonej tą samą techniką, lecz w dłuższych odstępach czasu) oraz modułu ścinania lub modułu ściskania (mierzonego na uformowanych próbkach o grubości 2 mm i średnicy 7 mm) wykazuje możliwość regulacji odpowiedzi hydrożelu w zależności od chemii polimeru prekursorowego (konkretnie dla POEGMA: stosunku monomerów OEGMA o krótkich i długich łańcuchach użytych do przygotowania hydrożelu), ułamka molowego grup funkcyjnych w polimerach prekursorowych oraz stężenia tych polimerów prekursorowych (Rysunek 5)27.
Mikrofluidyka prowadzi do tworzenia dobrze zdefiniowanych mikrocząstek żelu o rozmiarach od 25-100 µm, przy czym wielkość ta jest sterowana poprzez prędkości przepływu oleju i/lub połączonych wodnych faz polimerowych (Rycina 6A)31. Optyczna mikroskopia z użyciem stolika grzejnego potwierdza, że mikrocząstki żelu zachowują termoreaktywny charakter hydrożeli masowych, wykazując odwracalne, zależne od temperatury pęcznienie i kurczenie się z jedynie niewielką histerezą w pierwszym cyklu (przypisywalną nieodwracalnemu tworzeniu wiązań wodorowych między sąsiednimi grupami amidowymi w stanie zapadniętym34), co jest zgodne z obserwacjami dla masowych hydrożeli PNIPAM (Rycina 6B)32. Co więcej, mikrocząstki żelu z czasem ulegają degradacji z powrotem do swoich prekursorów oligomerycznych, co umożliwia klirens nerkowy (Rycina 6C)32.
Samorzutna organizacja napędzana nanoagregacją polimeru PNIPAM funkcjonalizowanego hydrazydami w podgrzanym roztworze, a następnie sieciowanie z polimerem PNIPAM funkcjonalizowanym aldehydami, prowadzi do powstania wysoce monodyspersyjnych nanogeli (polydispersity &lt;0,1) o rozmiarach w zakresie 180-300 nm, w zależności od zastosowanych warunków procesu (Rycina 7A)28. Nanogele zachowują typowe zachowanie termoreaktywne konwencjonalnych nanogeli PNIPAM sieciowanych wolnorodnikowo, przy czym obserwowano niższy stopień termicznego kurczenia się wraz ze zwiększeniem ilości dodanego polimeru sieciującego (Rycina 7B). Nanogele mogą być liofilizowane i redyspergowane bez zmiany rozmiaru cząstek (Rycina 7C) oraz ulegać degradacji w czasie w wyniku hydrolizy, co prowadzi do ponownego utworzenia oligomerycznych polimerów prekursorowych użytych do sformułowania nanogeli (Rycina 7D).
Reaktywne elektroprzędzenie pozwala na wytworzenie nanowłóknistej struktury hydrożelu (Rysunek 8A), w której możliwe jest uzyskanie średnic nanowłókien rzędu ~300 nm bez obecności widocznych cząstek powstałych w wyniku elektrosprayowania33. Namaczanie nanowłókien na bazie POEGMA w wodzie prowadzi do szybkiej hydratacji (około dwie rzędy wielkości szybciej niż w przypadku żelu masywnego o tym samym składzie, Rysunek 8B), przy jednoczesnym zachowaniu nanowłóknistej morfologii przez 8-10 tygodni przed degradacją hydrolityczną w warunkach fizjologicznych; szybsza degradacja jest obserwowana w środowiskach katalizowanych kwasowo, co jest spodziewane ze względu na możliwość kwasowej katalizy rozpadu wiązań hydrazonowych (Rysunek 8C). Struktury nanowłókniste są również mechanicznie wytrzymałe zarówno w stanie suchym, jak i napęczniałym przez wiele cykli, co umożliwia łatwą manipulację i wielokrotne rozciąganie (Rysunek 8D).
<img alt="Proces tworzenia sieci polimerowej wraz z wykresami modułu sprężystości i wynikami analizy zawartości wody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Właściwości biodegradowalnych termoreaktywnych hydrożeli żelujących in situ-. (A) Reprezentatywne mikrostruktury sieci żelu POEGMA oraz obrazy objętościowego hydrożelu z odpowiadającymi im czasami żelowania w zależności od molowego % wbudowania OEGMA475 w polimerach prekursorowych; (B-C) Moduł zachowawczy hydrożeli PO100 w zależności od (B) stężenia polimeru prekursorowego oraz (C) molowego % wbudowania grup funkcyjnych w polimerze prekursorowym; (D-F) Właściwości fizykochemiczne hydrożeli POEGMA w zależności od molowego % wbudowania OEGMA475: (D) moduł zachowawczy, (E) profil degradacji w 1 M HCl oraz (F) temperatura przejścia fazowego objętościowego w odpowiedzi na zmianę temperatury w zakresie 20-60 °C. Wszystkie słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe dla n=4 pomiarów powtórzonych. Adaptacja z referencji27 za zgodą wydawnictwa Elsevier. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie wielkości cząstek, obrazy mikroskopowe, zmienne szybkości przepływu, temperatury, czasy reakcji, wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Właściwości degradowalnych mikrocząstek żelu z reaktywnej mikrofluidyki. (A) Wpływ szybkości przepływu oleju parafinowego na wielkość (oczyszczonych) mikrocząstek żelu w wodzie; (B) Termoodpowiedź oczyszczonych mikrocząstek żelu w wodzie po pojedynczym cyklu termicznym powyżej i poniżej temperatury przejścia fazowego objętościowego; (C) Ocena wizualna (zdjęcia) i ślady chromatografii przenikania żelowego (wykres) potwierdzające degradację mikrocząstek żelu z powrotem do ich prekursorowych komponentów polimerowych (tutaj w 1 M HCl w celu przyspieszenia degradacji w skali czasowej obrazowania); pasek skali = 100 µm. Adaptowano z referencji32. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie stabilności nanogelu; A-B: wykresy średnicy hydrodynamicznej w funkcji temperatury; C-D: efekty liofilizacji; E: analiza intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 7"> 
Rysunek 7: Właściwości degradowalnych nanogeli otrzymanych w drodze reaktywnego samozgrupowania. (A) Rozkłady wielkości cząstek nanogeli przygotowanych przy różnych masowych stosunkach polimeru aldehydowego do hydrazydowego, wyznaczone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (wstawka: mikrografia elektronowa transmisyjna potwierdzająca sferyczny kształt nanogeli); (B) Termowrażliwość cząstek powstałych w procesie samozgrupowania w funkcji masowego stosunku polimeru aldehydowego do hydrazydowego użytego do przygotowania nanogeli (wyznaczone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła), gdzie słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe dla n=4 powtórzeń; (C) Wizualne potwierdzenie braku agregacji nanogeli zarówno przed liofilizacją, jak i po niej; (D) Wizualne potwierdzenie degradacji nanogeli katalizowanej kwasem (tutaj w 1 M HCl dla spójności z pozostałymi badaniami powyżej); (E) Przebiegi chromatografii przenikania żelowego produktów degradacji nanogeli, wskazujące na ich podobieństwo do polimerów prekursorowych funkcjonalizowanych hydrazydami i aldehydami. Adaptacja za zgodą źródła28. Copyright 2015, American Chemical Society. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig7v2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Badanie hydrożelu nanowłóknistego; obrazy SEM, wykres zawartości wody i analiza danych sił mechanicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Właściwości biodegradowalnych nanowłókien otrzymanych w procesie reaktywnego elektroprzędzenia. (A) Obrazy z pomiaru skaningowej mikroskopii elektronowej nanowłókien w stanie suchym (lewo), częściowo zanurzonych w wodzie (środek, cienka błona) oraz całkowicie namoczonych w wodzie przez noc (prawo, gruby rusztowanie); (B) Pęcznienie nanowłóknistego hydrożelu (czerwony) w stosunku do hydrożelu masowego (niebieski) o tym samym składzie, gdzie słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe dla n=4 powtórzeń; (C) Obrazy z pomiaru skaningowej mikroskopii elektronowej i (wstawka) obrazy wizualne monitorujące degradację nanowłókien katalizowaną kwasem w 1M HCl; (D) Cykle rozciągania suchych (80 cykli, 20% wydłużenia/cykl) i spęcznionych (325 cykli, 10% wydłużenia/cykl w 10 mM PBS) nanowłóknistych hydrożeli otrzymanych metodą elektroprzędzenia. Rysunek zmodyfikowany na podstawie referencji33 i przedrukowany za zgodą Royal Society of Chemistry. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig8v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wytworzenie degradowalnych wersji termoczułych hydrożeli o kontrolowanych skalach długości i geometriach. Metoda ta może pomóc w sprostaniu kluczowym wyzwaniom związanym z materiałami biomedycznymi, takimi jak ułatwienie długoterminowego, minimalnie inwazyjnego miejscowego dostarczania leków, tworzenie responsywnych rusztowań dla inżynierii tkankowej lub projektowanie ukierunkowanych nanoterapii. Główną zaletą naszej techniki jest szybka odwrotna chemia biohydrazonu, która pozwala nam kontrolować wielkość i kształt degradowalnych hydrożeli poprzez zmianę geometrii mieszania prekursorów polimerów.Ta elastyczność pozwala nam wytwarzać żele foliowe, mikrożele, nanożele i nanowłókna z tego samego materiału wyjściowego. Najpierw przygotuj około dwóch mililitrów termoresponsywnych roztworów polimerów prekursorowych funkcjonalizowanych hydrazydkami i aldehydami o stężeniach od pięciu do 40% wagowych i 10 milimolowych roztworów soli fizjologicznej buforowanych fosforanami. Użyj strzykawek z pojedynczą lufą, aby załadować roztwory polimerów prekursorowych do oddzielnych beczek strzykawki dwucylindrowej o pojemności 2,5 mililitra i proporcji 1:1.Następnie podłącz 1,5-calowy mikser statyczny do 2,5-mililitrowej strzykawki z podwójną lufą 1:1. W razie potrzeby przymocuj igłę 1,5 cala o rozmiarze 18 lub 20 do miksera statycznego. Następnie wytnij z miękkiego arkusza gumy silikonowej o pożądanej grubości.Kawałek o wielkości standardowego szkiełka mikroskopowego. Użyj zestawu dziurkaczy, aby wybić co najmniej jeden otwór o pożądanym kształcie w arkuszu gumy silikonowej. Umieść formę z gumy silikonowej na czystym szkiełku podstawowym, upewniając się, że wszystkie otwory są podparte szkłem.Delikatnie dociśnij formę do szkiełka, aby zamocować ją na miejscu. Folia z kauczuku silikonowego może być również stosowana jako podłoże, aby zapewnić dobrą przyczepność podłoża. Co wytłaczać roztwory polimerów funkcjonalizowanych hydrazydem i aldehydem przez mieszalnik statyczny do studzienek formy, aż studzienki zostaną całkowicie wypełnione.Przykryj formę drugim czystym, szklanym szkiełkiem i poczekaj na zakończenie żelowania. Następnie zdejmij górne szkiełko i za pomocą szpatułki oddziel hydrożele od formy z gumy silikonowej. Podnieś formę ze szkiełka, aby odzyskać hydrożele.Przed zabiegiem należy wytworzyć chip mikroprzepływowy do generowania mikrocząstek. Syntetyzuj poli NIPAM funkcjonalizowany hydrazydem i aldehydem. Na początek przygotuj dwa mililitry po 6% wagowo roztworów hydrazydu i aldehydu funkcjonalizowanego poli NIPAM w wodzie dejonizowanej.Załaduj roztwory prekursorów polimerów do oddzielnych pięciomililitrowych strzykawek. Następnie przygotuj 150 mililitrów 1% wagowo roztworu monooleinianu sorbitolu w ciężkim oleju parafinowym. Załaduj ten roztwór do dwóch standardowych strzykawek o pojemności 60 mililitrów.Zamontować cztery strzykawki w oddzielnych pompach strzykawkowych do infuzji. Następnie podłącz 45-centymetrową rurkę silikonową do wylotu chipa mikroprzepływowego. Umieść koniec rurki wylotowej w pojemniku na odpady.Podłącz strzykawki z roztworem polimeru do kanałów wlotowych polimeru na chipie mikroprzepływowym za pomocą 30-centymetrowych rurek silikonowych. Podłącz jedną strzykawkę z roztworem oleju parafinowego do poprzedzającego kanału wlotowego oleju za pomocą silikonowej rurki. Podłącz drugą strzykawkę olejową do obu dalszych kanałów wlotowych oleju za pomocą silikonowej rurki i złącza strzykawki w kształcie litery U.Ustaw natężenie przepływu pomp wyposażonych w strzykawki olejowe na od 1,1 do 5,5 mililitra na godzinę. Przepuszczaj olej przez chip mikroprzepływowy przez co najmniej 30 minut, aby zalać chip i potwierdzić, że chip jest wolny od wad. Następnie jednocześnie dostarczyć oba roztwory polimerowe do zagruntowanego wióra w ilości 03 ml na godzinę.Pozwól, aby przepływ polimeru i oleju wyrównał się przez 30 minut do godziny. Aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu polimerów prekursorowych w dyszy mikroprzepływowej, konieczne jest ostrożne zalanie rurki i rozpoczęcie przepływu polimeru dokładnie w tym samym czasie, aby zapobiec cofaniu się do któregokolwiek ze zbiorników polimerowych. Gdy na dyszy chipa mikroprzepływowego utworzą się jednolite mikrocząstki żelu, zbierz je w plastikowej probówce wirówkowej z aktywnym mieszadłem magnetycznym.Zatrzymać pompy strzykawkowe i silnik mieszający po zużyciu oleju. Gdy mikrocząsteczki żelu osiądą w probówce, zdekantuj olej parafinowy za pomocą pipety. Dodać do kolby 10 mililitrów pentanu na każde 5 ml mikrocząstek.Energicznie mieszaj uposażenie przez około minutę. Pozwól cząstkom osiąść przez jedną do dwóch godzin przed dekantacją pentanu za pomocą pipety. Powtórz to pranie pentanowe co najmniej pięć razy.Umyte mikrocząsteczki żelu przenieść do małej, szklanej fiolki scyntylacyjnej. Ponownie zawiesić cząstki w jednym do dwóch mililitrów wody dejonizowanej. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj po pięć mililitrów 1% roztworów hydrazydu i poli NIPAM funkcjonalizowanego aldehydem w wodzie dejonizowanej.Podgrzej pięć mililitrów roztworu poli NIPAM funkcjonalizowanego hydrazydem do 70 stopni Celsjusza, mieszając. Monitorować roztwór, gdy staje się nieprzezroczysty i upewnić się, że nie tworzy się widoczny osad. Następnie dodaj kroplami 0,25 mililitra roztworu poli NIPAM funkcjonalizowanego aldehydem do podgrzanego roztworu poli NIPAM funkcjonalizowanego hydrazydem w ciągu pięciu do 10 sekund.Mieszaj mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij mieszaninę z kąpieli olejowej i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej przez noc, aby uzyskać nanożele do oczyszczenia. Umieść mieszaninę nanożelu w membranie dializacyjnej o masie cząsteczkowej 3500 kilodaltonów.Dializuj nanożele w wodzie zjonizowanej sześć razy w cyklach sześciogodzinnych, aby usunąć nieusieciowane polimery. W razie potrzeby liofilizuj oczyszczone nanożele do przechowywania. Aby rozpocząć procedurę wytwarzania nanowłókien żelowych, przygotuj po jednym mililitrze 15% wagowych roztworów hydrazydu i funkcjonalizowanego aldehydem POEGMA w wodzie dejonizowanej.Następnie przygotuj dwa mililitry 5% wagowo roztworu tlenku polietylenu o wysokiej masie cząsteczkowej w wodzie dejonizowanej. Połączyć każdy roztwór prekursora POEGMA z jednym mililitrem roztworu tlenku etylenu. Załadować roztwory prekursorów do oddzielnych beczek strzykawki dwucylindrowej.Następnie podłącz 1,5-calowy mikser statyczny i igłę o rozmiarze 18 do 2,5-mililitrowej strzykawki z podwójną lufą 1:1. Zamontować strzykawkę dwucylindrową na pompie strzykawkowej do infuzji. Następnie zamontuj aluminiowy kolektor elektroprzędzący z dyskiem w odległości 10 centymetrów od końca igły.Uziemić zasilacz wysokiego napięcia na kolektorze i podłączyć zasilacz do igły. Ustaw pompę strzykawkową na 0,48 mililitra na godzinę, a zasilanie na 10 kilowoltów. Jednocześnie uruchomić pompę strzykawkową i zasilacz, aby rozpocząć elektrowirowanie.Kontynuuj, aż zostanie osiągnięta pożądana grubość lub prekursory zostaną wyczerpane. Po zakończeniu produkcji nanowłókien wyłącz i odłącz zespół elektroprzędzalniczy. Namocz zebrane nanowłókna żelu w wodzie dejonizowanej na 24 godziny, aby usunąć tlenek polietylenu.Dwulufowa strzykawka wytwarzała usieciowane hydrazonowe żele hydrauliczne POEGMA o różnych mechanizmach, czasach żelowania i przezroczystościach w zależności od stężenia polimeru prekursorowego, gęstości reaktywnej grupy funkcyjnej i liczby powtarzających się jednostek tlenku etylenu na monomerach. Natężenia przepływu zarówno oleju parafinowego, jak i roztworów prekursorów polimerowych wpłynęły na rozmiary mikrocząstek usieciowanego żelu poli NIPAM w hydrostrefie wytwarzanych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Odwracalne pęcznienie zależne od temperatury obserwowano za pomocą mikroskopii optycznej na gorąco.Mikrocząsteczki żelu z czasem uległy degradacji do swoich oligomerycznych prekursorów. Rozmiary samoorganizujących się usieciowanych nanożeli poli NIPAM różniły się w zależności od stosunku masy prekursora polimeru funkcjonalizowanego aldehydem do hydrazydu, ale pozostawały wysoce monodyspersyjne. Wraz ze wzrostem stosunku mas obserwowano mniejsze pęcznienie termiczne.Podobnie jak mikrocząsteczki żelu, nanożele z czasem uległy degradacji do oligomerycznych prekursorów. Usieciowane nanowłókna hydrożelowe POEGMA usieciowane hydrazonem o średnicach rzędu 300 nanometrów wyprodukowano metodą reaktywnego elektroprzędzenia. Uwodnienie nanowłókien było o około dwa rzędy wielkości szybsze niż uwodnienie żelu luzem o tym samym składzie polimerowym.Nanowłókno zachowało swoją nanowłóknistą morfologię przez ponad osiem tygodni, zanim uległo degradacji w warunkach fizjologicznych. Szybsza degradacja zachodziła w środowisku kwaśnym. Nanowłókna były wytrzymałe mechanicznie zarówno w stanie suchym, jak i spuchniętym.Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak tworzyć degradowalne, termoczułe hydrożele, kontrolując geometrię, w której wytwarzane są polimery prekursorowe żelu. Pamiętaj, aby upewnić się, że czas żelowania prekursora polimeru odpowiada potrzebom każdej cząsteczki. Zbyt szybkie żelowanie zahamuje wytwarzanie mikrożelu i nanowłókien.Zbyt powolne żelowanie spowoduje w pełni zrośniętą morfologię. Techniki te torują drogę naukowcom w dziedzinie dostarczania leków i inżynierii tkankowej. i zaprojektować dobrze zdefiniowane rusztowania hydrożelowe do kontrolowania szybkości lub lokalizacji uwalniania leku lub stymulowania regeneracji tkanek.

fabricating-degradable-thermoresponsive-hydrogels-on-multiple-length

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Dwa sąsiadujące ze sobą płyny przechodzące przez rowkowany kanał mikroprzepływowy mogą być skierowane tak, aby tworzyły osłonę wokół rdzenia prepolimerowego; określając w ten sposób zarówno kształt, jak i przekrój. Polimeryzacja inicjowana foto, taka jak chemia tiolowa, doskonale nadaje się do szybkiego zestalania płynu rdzeniowego w mikrofibrę o określonym rozmiarze i kształcie.

Mikroprzepływowa produkcja włókien polimerowych i biohybrydowych o wstępnie zaprojektowanym rozmiarze i kształcie

Przedstawiamy protokół syntezy mikrohydrożeli Janusa składających się całkowicie z tego samego materiału bazowego, poli(N-izopropylacrylamidu) (PNIPAAm), z wyraźnie podzieloną strukturą opartą na separacji faz przesyconego roztworu monomeru NIPAAm. Zsyntetyzowane mikrohydrożele Janus wykazują unikalne właściwości, takie jak anizotropowa termoczułość i zdolność ładowania organofilowego/hydrofilowego.

Synteza mikrohydrożeli Janusa z poli(N-izopropyloakrylamidu) Janusa dla anizotropowej reakcji termicznej i zdolności ładowania organofilowego/hydrofilowego

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Opracowano strategię wytwarzania przyrostowego do przetwarzania hydrożeli sieciowanych UV. Strategia ta pozwala na montaż warstwa po warstwie mikroprefabrykowanych struktur hydrożelowych, a także na montaż niezależnych komponentów, co pozwala na uzyskanie zintegrowanych urządzeń zawierających ruchome elementy, które reagują na aktywację magnetyczną.

Technika wytwarzania przyrostowego do łatwego i szybkiego wytwarzania mikromaszyn na bazie hydrożelu z komponentami reagującymi magnetycznie

Ta praca opisuje proste, elastyczne i tanie metody wytwarzania mikrożeli z fragmentacją ekstruzji, przetwarzania mikrożeli na granulowane hydrożele do wstrzykiwania i stosowania granulowanych hydrożeli jako farb drukarskich do zastosowań biomedycznych.

Fragmentacja hydrożeli luzem i przetwarzanie na granulowane hydrożele do zastosowań biomedycznych

Ten artykuł opisuje protokoły wysokoprzepustowej produkcji mikrożelu żelowego z żelatyny metakryloylowej za pomocą urządzeń mikroprzepływowych, przekształcania mikrożeli w proszek do resuspensable (mikroaerożele), chemicznego łączenia mikrożeli w celu utworzenia granulowanych rusztowań hydrożelowych oraz opracowywania granulowanych biotuszy hydrożelowych o zachowanej mikroporowatości do biodruku 3D.

Rusztowania hydrożelowe żelatynowo-metakryloilowe granulowane: wysokoprzepustowa produkcja mikrożeli, liofilizacja, montaż chemiczny i biodruk 3D

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Poznaj metody wytwarzania degradowalnych hydrożeli termoczułych o kontrolowanej skali długości i geometrii. Techniki obejmują wytłaczanie reaktywne, mikrofluidykę, samoorganizację i elektroprzędzenie.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Przeglądaj więcej filmów