Name: Indukcja ostrej regeneracji mięśni szkieletowych przez wstrzyknięcie kardiotoksyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę indukcji ostrej regeneracji mięśni szkieletowych u myszy przez wstrzyknięcie kardiotoksyny do mięśnia piszczelowego przedniego. Protokół umożliwia badanie mechanizmów naprawy tkanek mięśniowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Animal House i Zintegrowanemu Zarządowi Mikroskopii IGB-CNR. Prace te zostały sfinansowane przez Siódmy Program Ramowy Wspólnoty Europejskiej w ramach projektu ENDOSTEM (Aktywacja komórek macierzystych związanych z naczyniami i komórek macierzystych mięśni do naprawy i utrzymania tkanki mięśniowej, umowa o grant nr 241440), włoskiego Ministerstwa Edukacji-Uniwersytetów-Badań Naukowych (MIUR-PRIN2 010-2011) na rzecz G.M. i S.B. oraz PON Cluster IRMI na rzecz G.M., oraz fundacji CARIPLO na rzecz G.M. i S.B.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi badań na zwierzętach i zatwierdzone przez Departament Zdrowia Publicznego, Zdrowia Zwierząt, Żywienia i Bezpieczeństwa Żywności włoskiego Ministerstwa Zdrowia zgodnie z ustawą o doświadczeniach na zwierzętach. Procedury zwichnięcia szyjki macicy mogą się różnić w zależności od instytucji w zależności od IACUC lub jego równoważnych wymagań.
1. Wstrzyknięcie kardiotoksyny w mięsień piszczelowy przedni
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem zabiegu należy przygotować 10 μM roztwór roboczy kardiotoksyny (CTX), rozcieńczając roztwór podstawowy kardiotoksyny w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub w wodzie. 
	nuta: CTX jest rozpuszczalny w wodzie w stężeniu 1 mg/ml. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 70 μM. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. CTX używany w tym protokole jest mieszaniną kardiotoksyn o masie cząsteczkowej około 7 000 Da. 
	ostrożność: Zaleca się noszenie podwójnych rękawiczek, maski higienicznej i okularów ochronnych (alternatywnie do okularów ochronnych zaleca się pracę pod kapturem) i zachowanie szczególnej ostrożności, aby uniknąć kontaktu z roztworem, nawet w przypadku rozcieńczenia.</li>
	<li>Znieczulenie myszy należy podać dootrzewnowo ketaminą i ksylazyną (80 mg/kg i 10 mg/kg masy ciała) lub innym zatwierdzonym dostępnym środkiem znieczulającym.</li>
	<li>Trzymając mysz twarzą do góry, spryskaj tylne kończyny 70% etanolem. Aby uwidocznić dokładną lokalizację mięśnia piszczelowego przedniego (TA), za pomocą skalpela odetnij włosy w przedniej części podudzia, pod kolanem. 
	nuta: Mięsień TA powstaje z bliższego trzonu kości piszczelowej, schodząc w dół bocznie do kości i kończąc się na kostce. Jego długie ścięgno rozciąga się do stopy w poprzek kostki (patrz rysunek 1A).</li>
	<li>Pobrać ~ 100 μl roztworu do strzykawki, powoli odciągając tłok do tyłu.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyki powietrza, trzymając strzykawkę pionowo (igłą skierowaną do góry). Delikatnie pociągnąć tłok w dół i postukać w bok strzykawki, aby pęcherzyki powietrza przyczepione do wewnętrznej części rurki mogły wydostać się do góry. Powoli naciskać tłok, aby uwolnić duże pęcherzyki powietrza. Z igły wypłynie kilka kropel płynu. W tym momencie upewnij się, że płyn ponownie włożyłeś do probówki i nie rozpraszaj go, biorąc pod uwagę toksyczność kardiotoksyny.</li>
	<li>Pobrać roztwór do strzykawki aż do osiągnięcia pożądanej dawki. Wstrzyknąć 20 μl roztworu CTX na każdy mięsień TA.</li>
	<li>Włóż igłę w środek TA, podążając za pozycją kości piszczelowej jako wskazówki, od ścięgna w kierunku kolana. Ponieważ TA jest cienką tkanką, należy wykonać wstrzyknięcie bez wchodzenia zbyt głęboko (wprowadzić igłę na głębokość 2/3 mm, pod kątem około 10° do 20°) i unikać wychodzenia poza sam mięsień (ryc. 1A).</li>
	<li>Nie należy wyciągać igły bezpośrednio po wstrzyknięciu, ale odczekać 2 - 3 sekundy, aby zapobiec wyciekowi kropli CTX z mięśnia.</li>
	<li>Po zabiegu umieść klatkę na podgrzewanej płycie (w temperaturze 37 °C) do momentu, aż myszy się obudzą, ponieważ zastosowany środek znieczulający i etanol obniżają temperaturę ciała.</li>
</ol>
2. Izolacja piszczelowa przednia
Uwaga: Mięśnie można izolować w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu kardiotoksyny zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
<ol>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Spryskaj tylne kończyny 70% etanolem. Podczas zabiegu zwierzę można przymocować do podpory, aby je przytrzymać.</li>
	<li>Przetnij skórę na poziomie ścięgna bliższego (nad stopą), włóż jedno z ostrzy nożyczek pod skórę i przetnij skórę w górę, w kierunku kolana. Za pomocą kleszczy podciągnij skórę i całkowicie odsłonij mięsień. Ostrożnie usuń całą skórę i włosy z obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Wyeliminuj powięź, powoli ściskając lub przecinając (pęsetą z cienką końcówką lub cienkimi nożyczkami do mikropreparowania) skrajne obrzeża mięśnia po przeciwnej stronie kości piszczelowej (ryc. 1B). Po złamaniu delikatnie usuń powięź za pomocą pęsety z cienką końcówką; Unikaj uszkodzenia leżącego pod spodem mięśnia. 
	nuta: Podobnie jak w przypadku innych mięśni i narządów, TA jest pokryta powięzią (głęboką powięzią nogi), cienkim arkuszem tkanki łącznej, który leży głęboko pod skórą i który należy usunąć, aby łatwo odizolować leżący poniżej mięsień.</li>
	<li>Wizualizuj dystalne ścięgno TA i ścięgno prostownika dwukątnego nad stopą, które są zestawione ze sobą. Ścięgno mięśnia prostownika długiego (EDL) znajduje się nieco poniżej ścięgna TA. Ścięgna dorosłych myszy są widoczne gołym okiem.</li>
	<li>Usuń mięsień TA, postępując zgodnie z jedną z dwóch następujących technik:
	<ol>
		<li>Przetnij oba ścięgna cienkimi nożyczkami do mikropreparowania i pociągnij je w kierunku bliższej strony, przytrzymując ścięgna kleszczami. Oddziel dwa ścięgna, delikatnie ciągnąc je w przeciwnych kierunkach, aby rozdzielić mięśnie.</li>
		<li>Za pomocą pęsety z cienką końcówką oddziel dystalne ścięgno TA od ścięgna prostownika digitorum, przesuwając końcówkę poniżej samego ścięgna (ryc. 1C, górne zdjęcie). Delikatnie wsuń pęsetę poniżej TA, aby oddzielić ją od leżących poniżej mięśni (Rysunek 1C, dolny obrazek).</li>
		<li>Przytrzymaj pęsetę pod mięśniem, aby był lekko uniesiony, przetnij ścięgno TA i delikatnie pociągnij je do góry, aż przyczepi się tylko obszar poniżej kolana (ryc. 1D, ilustracja po lewej). Przetnij TA poniżej kolana, podążając nożyczkami za krawędzią mięśnia (ryc. 1D, ilustracja po prawej). 
		nuta: Jeśli mięsień pozostaje lekko przyczepiony do boków, użyj cienkich nożyczek do mikropreparowania, aby go odłączyć. 
		nuta: Jeśli kleszcze nie mieszczą się łatwo poniżej TA, możliwe, że powięź nie została całkowicie usunięta i nadal może być widoczna na górze mięśnia. W takim przypadku całkowicie usuń powięź przed kontynuowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Technika Świeżo Mrożonych Mięśni
<ol>
	<li>Umieść niewielką ilość gumy tragakantowej lub podobnego kleju do zamrażania (np. środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)) na plasterku korka. W razie potrzeby oznacz plasterek korka na odwrocie przed zamrożeniem (Rysunek 2A).</li>
	<li>Aby uzyskać poprzeczne odcinki mięśnia, zanurz TA w dziąśle tragakantowym, wkładając dystalne ścięgno i pozostawiając około 3/4 mięśnia na zewnątrz, upewniając się, że mięsień jest w pozycji prostopadłej w stosunku do korka (ryc. 2A).</li>
	<li>Napełnij aluminiową puszkę (alternatywnie metalowy kubek lub szklaną zlewkę) izopentanem. Zawiesić puszkę z izopentanem w Dewarze zawierającym ciekły azot, nie dopuszczając do przedostania się ciekłego azotu do puszki. 
	nuta: Izopentan musi osiągnąć odpowiednią temperaturę (od -150 do -160 °C), aby optymalnie zamrozić tkankę. Właściwa temperatura jest osiągana, gdy na dnie puszki tworzą się białe cząstki stałe, a izopentan staje się lekko lepki. 
	nuta: Nie zamrażaj próbki przed utworzeniem się cząstek stałych, ponieważ może to prowadzić do zamarzania artefaktów. Z drugiej strony, jeśli izopentan stanie się całkowicie stały, pozostaw go w temperaturze pokojowej do momentu rozmrożenia, upewniając się, że niektóre białe cząstki są nadal obecne.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy Mixter szybko zanurz korek z mięśniem w izopentanie, utrzymując mięsień skierowany w dół i upewnij się, że zwolniłeś korek, gdy jest całkowicie zanurzony w płynie. W ten sposób, podczas gdy próbka unosi się na wodzie, w cieczy powinna być widoczna tylko odwrotna strona korka.</li>
	<li>Pozostawić próbkę w izopentanie na 1 minutę.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy Mixter (lub podobnych kleszczy) weź mięsień i zanurz go w ciekłym azocie na co najmniej 2 minuty.</li>
	<li>Zawiń próbki pojedynczo w oznakowaną folię aluminiową i natychmiast umieść je w suchym lodzie (-70 °C) lub bezpośrednio przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C. 
	nuta: W trakcie całej procedury, od etapów 3.4 do 3.7, niezwykle ważne jest utrzymanie odpowiedniej temperatury i zapobieganie rozmrażaniu próbek (np. podczas przenoszenia do zamrażarki o temperaturze -80 °C). Rosnąca temperatura powoduje niekontrolowane rozmrażanie i ponowne zamrażanie mikrokryształów wody, które są obecne w tkance i ostatecznie powoduje powstawanie artefaktów lub rozpad włókien mięśniowych (wizualizowanych na skrawkach tkanki jako duże białe w środku włókna).</li>
</ol>
4. Kriostat Cięcie zamrożonych mięśni
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę komory kriostatu na -20 do -22 °C.</li>
	<li>Umieść kikut próbki, ostrze i próbkę w komorze kriostatu, pozwalając im na równowagę przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Umieść niewielką ilość związku zamrażającego (np. związku OCT) na końcówce próbki i zanurz korek z próbką, zanim związek zamrażający zastygnie. W międzyczasie umieść ostrze w uchwycie ostrza.</li>
	<li>Wyrównaj próbkę i ostrze za pomocą dostarczonych, aby zorientować uchwyt próbki z uchwytem ostrza (Rysunek 2B).</li>
	<li>Ustaw grubość przekroju na 10 μm. Przystąp do cięcia tkanki. Przy każdym obrocie koła napędowego uchwyt próbki przesuwa się na kontrolowaną odległość w kierunku ostrza.</li>
	<li>Umieść sekcje na spolaryzowanym szkiełku (od 8 do 10 sekcji na szkiełko) (Rysunek 2C).</li>
	<li>Po pocięciu na sekcje przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C. 
	nuta: Próbka może być przechowywana w zamrażarce w temperaturze -80 °C i ponownie wykorzystana do dalszego cięcia, jeśli jest odpowiednio obsługiwana i przechowywana.</li>
</ol>
5. Rutynowe barwienie histologiczne (barwienie hematoksyliną i eozyną)
Uwaga: W zależności od analizy można wykonać kilka barwień histologicznych na odcinkach mięśni. Rutynowym barwnikiem histologicznym do analizy morfologicznej i morfometrycznej jest barwienie bichromowe Hematoxylin & Eosin (H&E). Hematoksylina barwi jądra na ciemnofioletowy kolor. Barwienie jądrowe jest przebarwione eozyną (różową / czerwoną), która barwi struktury eozynofilowe, takie jak włókna mięśniowe w cytoplazmie.
<ol>
	<li>Całkowicie wysuszyć zamrożone szkiełka z sekcjami na powietrzu przez 10 - 15 minut w temperaturze pokojowej, umieścić szkiełka w tacy do barwienia i umieścić tacę w korycie do barwienia.</li>
	<li>Plamić przez 1 minutę hematoksyliną.</li>
	<li>Połóż koryto barwiące pod dość słabym strumieniem wody z kranu na 10 minut, aby wypłukać hematoksylinę.</li>
	<li>Zanurz szkiełka na 5 minut w 95% etanolu, jeśli będzie używany alkoholowy roztwór eozyny (pomiń ten krok w przypadku wodnego roztworu eozyny).</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne przez 1 minutę roztworem eozyny.</li>
	<li>Spłucz wodą, aby usunąć nadmiar roztworu eozyny. 
	nuta: Dla każdej nowej partii należy określić optymalny czas barwienia hematoksyliną lub eozyną.</li>
	<li>Odwodnić próbki w serii alkoholi etylowych o stopniowanej gradacji: 50% i 70% (po kilka sekund każda). Szybko zanurz w 95% etanolu, a następnie 2 zmiany w 100% etanolu, każda po 5 minut.</li>
	<li>Klarowne w 2 zmianach ksylenu, co 5 minut lub dłużej. Ten krok należy wykonać pod maską chemiczną.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu, nakładając kilka kropel medium montażowego na szkiełko i przykrywając szkiełkiem nakrywkowym. Medium montażowe można również nałożyć na szkiełko nakrywkowe, a szkiełko nakrywkowe założyć na szkiełko.
	<ol>
		<li>Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Aby wyeliminować pęcherzyki powietrza, należy utrzymać szkiełko w pozycji pionowej (po zamontowaniu) i wycisnąć nadmiar medium montażowego oraz pęcherzyki powietrza, delikatnie naciskając na szkiełko nakrywkowe kleszczami (lub podobnym narzędziem).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymaj szkiełka pod maską przez kilka godzin lub przez noc, aby ksylen całkowicie odparował przed przystąpieniem do analizy.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę morfologiczną i morfometryczną regenerujących się odcinków mięśni wybarwionych H&E, używając nienakładających się na siebie obrazów seryjnych co najmniej jednego całego odcinka mięśnia na mysz. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu jasnego pola o 20-krotnym powiększeniu. 
	nuta: Zalecana jest minimalna liczba 5 myszy w celu uzyskania istotności statystycznej pomiarów. 
	nuta: W tym celu dostępne jest oprogramowanie do analizy obrazu, takie jak bezpłatne oprogramowanie do pobrania ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).</li>
<li>Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Precursors+from+iPS+Cells+for+Skeletal+Muscle+Cell+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy.</a> J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).</li>
<li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).</li>
<li>Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+mechanisms+regulating+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function.</a> Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).</li>
<li>Saclier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+activated+macrophages+orchestrate+myogenic+precursor+cell+fate+during+human+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration.</a> Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).</li>
<li>Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+skeletal+muscle+and+immune+cells%3A+muscle-derived+mediators+and+metabolic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li>
<li>Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Inflammation+in+Muscle+Homeostasis+and+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis.</a> Mediators Inflamm. 2015, (2015).</li>
<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).</li>
<li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li>
<li>Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiotoxin+and+phospholipase+A+in+the+blockade+of+nerve+conduction+and+depolarization+of+skeletal+muscle+induced+by+cobra+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom.</a> Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Mann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+repair+and+fibrosis+development+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle.</a> Skelet Muscle. 1 (1), (2011).</li>
<li>Pessina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+optimized+strategies+for+inducing+fibrosis+in+vivo%3A+focus+on+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Skelet Muscle. 4 (1), 7(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół wywoływania ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych (tj. domięśniowe wstrzyknięcie CTX). Jest szeroko stosowany jako potężne narzędzie do badania dynamiki regeneracji mięśni szkieletowych in vivo. Iniekcja CTX indukuje degenerację włókien mięśniowych, która jest spowodowana depolaryzacją sarkolemmy i skurczem włókien12 i uruchamia kaskadę zdarzeń, która prowadzi do regeneracji mięśni. Mięśnie szkieletowe są preparowane w pożądanych punktach czasowych po wstrz...

Dorosłe mięśnie szkieletowe ssaków są tworzone przez grupy pęczków wielojądrowych komórek mięśniowych (włókien mięśniowych), które są wyspecjalizowane do skurczu. Każde włókno mięśniowe jest wydłużonym syncytium, otoczonym sarkolemmą (błoną plazmatyczną) i zawierającym miofibryle, które składają się z regularnie i wielokrotnie zorganizowanych białek kurczliwych (filamenty aktyny i miozyny). W dorosłym życiu i w warunkach spoczynku mięśnie szkieletowe mają bardzo niski obrót jądr mięśniowych1; rzeczywiście, mięśnie, które znajdują się na obrzeżach włókna mięśniowego, pod sarkolemmą, są zatrzymywane w fazie G0 cyklu komórkowego i nie są w stanie proliferować1,2.
Mięśnie szkieletowe mają szczególną zdolność do regeneracji po uszkodzeniu, osiągając homeostazę po kilku zdarzeniach przebudowy tkanek, które są ze sobą ściśle powiązane. Po ostrym urazie lub urazie indukowane jest zwyrodnienie, po którym następują procesy regeneracji, które obejmują różne populacje komórek, w tym rezydentną populację komórek mięśniowych, komórki satelitarne (SC). Rzeczywiście, przy braku jakichkolwiek bodźców środowiskowych komórki satelitarne są w stanie spoczynku i znajdują się w wyspecjalizowanej niszy między sarkolemmą a blaszką podstawną3,4. Po urazie lub chorobie SC ulegają aktywacji, namnażają się, migrują do uszkodzonych obszarów i ostatecznie różnicują się, powodując powstawanie nowo tworzących się włókien mięśniowych5. Aktywowane SC nawiązują przesłuch z różnymi populacjami komórek, głównie komórkami zapalnymi, które są rekrutowane w miejscu urazu6-8. Ten przesłuch pozwala komórkom podążać za regulowanym paradygmatem, zgodnie z którym sygnały molekularne napędzają modyfikacje strukturalne, ostatecznie prowadząc do homeostazy9. Oprócz SC, zaangażowane są również komórki zapalne i śródmiąższowe, procesy angiogenne i zdarzenia ponownego unerwienia, działające w skoordynowany sposób w celu naprawy tej wysoce zorganizowanej i wyspecjalizowanej struktury.
Istnieje duże zainteresowanie badaniem różnych aspektów regeneracji mięśni szkieletowych, nie tylko w celu zrozumienia fizjologii mięśni, ale także w celu ulepszenia strategii terapeutycznych, które wymagają głębszej wiedzy na temat całego procesu. Obecnie dostępnych jest kilka podejść eksperymentalnych do badania tożsamości i funkcji różnych populacji komórek, szlaków sygnałowych i zaangażowanych mechanizmów molekularnych. Mysie modele ostrego urazu stanowią potężne narzędzie do badania wielu aspektów tego procesu. Różne powszechnie stosowane techniki wywoływania ostrego uszkodzenia mięśni pozwalają naukowcom śledzić proces regeneracji in vivo, od bardzo wczesnych etapów do końca procesu. Protokół ten opisuje etapy od domięśniowego wstrzyknięcia kardiotoksyny pochodzącej z jadu węża (CTX), która indukuje miolizę i uruchamia proces regeneracji, aż do analizy próbek tkanek. Po wstrzyknięciu CTX myszy mogą zostać uśmiercone w różnych punktach czasowych w zależności od wymagań eksperymentalnych, a mięśnie szkieletowe mogą zostać wypreparowane i przetworzone do dalszej analizy. Na koniec opisujemy protokół barwienia skrawków tkanek w celu wykonania obserwacji morfologicznych i podstawowych analiz ilościowych. Protokół ten pozwala na badanie ostrej regeneracji mięśni szkieletowych in vivo w wysoce powtarzalny sposób10.

<table><tbody><tr><td>Kardiotoksyna z&nbsp; Naja mossambica mossambica</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C9759</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do igły do insuliny BD Micro-Fine+ 30 G x 8 mm - Da 0,3 mL</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Guma tragakantowa</td><td>MP BIOMEDICALS,LLC</td><td></td><td></td></tr> 104792 <tr><td>2-metylobutan (izopentan)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>78-78-4.</td><td></td></tr><tr><td>OCT Killik Rozwiązanie do inkluzji Kriostat</td><td>Bio-optica</td><td>&nbsp; 05-9801</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze do mikrotomów z piór S35</td><td>Bio-optica</td><td>&nbsp; 01-S35</td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnia szklana Superfrost Plus</td><td>Menzel-GL&auml; ser</td><td>09-OPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Dumon #5 Kleszcze do lustrzanego wykończenia&nbsp;</td><td>2INSTRUMENTY BIOLOGICZNE</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki proste ostre/ostre</td><td>2INSTRUMENTY BIOLOGICZNE</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Noyes proste</td><td>2INSTRUMENTY BIOLOGICZNE</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki proste ostre/ostre 10,5 cm</td><td>2INSTRUMENTY BIOLOGICZNE</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Bio-optica</td><td>09-00100</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>BIOSIGMA</td><td>VBS651</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>sigma-Aldrich</td><td>02860-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>J.T. BAKER</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>LEICA</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja ostrej regeneracji mięśni szkieletowych przez wstrzyknięcie kardiotoksyny

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Regeneracja mięśni szkieletowych to proces fizjologiczny, który zachodzi w mięśniach szkieletowych dorosłych w odpowiedzi na uraz lub chorobę. Ostra regeneracja mięśni szkieletowych wywołana kontuzjami jest szeroko stosowanym, potężnym systemem modelowym do badania zdarzeń związanych z regeneracją mięśni, a także mechanizmów i różnych graczy. Rzeczywiście, szczegółowa wiedza na temat tego procesu jest niezbędna do lepszego zrozumienia stanów patologicznych, które prowadzą do zwyrodnienia mięśni szkieletowych, i pomaga w identyfikacji nowych ukierunkowanych strategii terapeutycznych. Niniejsza praca opisuje szczegółowy i powtarzalny protokół indukcji ostrej regeneracji mięśni szkieletowych u myszy poprzez pojedyncze domięśniowe wstrzyknięcie kardiotoksyny (CTX). CTX należy do rodziny toksyn jadu węża i powoduje miolizę włókien mięśniowych, co ostatecznie wyzwala zdarzenia regeneracyjne. Dynamikę regeneracji mięśni szkieletowych ocenia się za pomocą analizy histologicznej odcinków mięśniowych. Protokół ilustruje również eksperymentalne procedury preparowania, zamrażania i przecinania mięśnia piszczelowego przedniego, a także rutynowe barwienie hematoksyliną i eozyną, które jest szeroko stosowane do późniejszej analizy morfologicznej i morfometrycznej.

Barwienie H&amp;E umożliwia ocenę morfologii procesu regeneracji w określonych punktach czasowych podczas regeneracji mięśni szkieletowych. Rycina 3 przedstawia analizę przebiegu czasowego przeprowadzoną na uszkodzonych mięśniach TA myszy typu dzikiego. Mięśnie wyizolowano w 3, 7, 15 i 30 dni po wstrzyknięciu CTX, zgodnie ze schematem na Rycynie 3A. Reprezentatywne zdjęcia barwionych H&amp;E przekrojów poprzecznych pokazują dynamikę naprawy mięśni szkiele...

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół indukcji ostrej regeneracji mięśni szkieletowych u dorosłych myszy i późniejszych manipulacji mięśni, takich jak rozwarstwienie, zamrażanie, cięcie, rutynowe barwienie i analiza obszaru przekroju poprzecznego włókien mięśniowych.

Indukcja ostrej regeneracji mięśni szkieletowych przez wstrzyknięcie kardiotoksyny

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie mysiego modelu ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych w celu zbadania procesu regeneracji in vivo, od bardzo wczesnych etapów do końca procesu. Mysie modele ostrych urazów mięśni są potężnym narzędziem do badania wielu aspektów procesu regeneracji. Główną zaletą tej techniki jest wysoka powtarzalność wszystkich zaangażowanych kroków.Aby rozpocząć tę procedurę, nałóż kilka kropli 70% etanolu na tylną kończynę znieczulonej myszy. Aby uwidocznić dokładną lokalizację mięśnia piszczelowego przedniego, usuń włosy z przedniej części podudzia za pomocą skalpela. Aby wstrzyknąć roztwór kardiotoksyny, należy pobrać 100 mikrolitrów do strzykawki.Trzymać strzykawkę w pozycji pionowej i usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie wbij igłę w środek TA od ścięgna w kierunku kolana, podążając za pozycją kości piszczelowej jako wskazówki. Wykonaj wstrzyknięcie bez wchodzenia zbyt głęboko, i unikaj wychodzenia poza sam mięsień.Odczekaj dwie do trzech sekund przed wyciągnięciem igły, aby zapobiec wyciekowi kardiotoksyny z mięśnia. Nałóż kilka kropli 70% etanolu na tylną kończynę uśpionego zwierzęcia. Przetnij skórę na poziomie ścięgna bliższego, a następnie włóż jedno z ostrzy nożyczek pod skórę i przetnij skórę w kierunku kolana.Podciągnij skórę, aby całkowicie odsłonić mięsień. Ostrożnie usuń całą skórę i włosy z obszaru zainteresowania. Następnie wyeliminuj powięź, powoli ściskając lub przecinając skrajne obrzeża mięśnia.Po złamaniu delikatnie usuń powięź za pomocą pęsety z cienką końcówką, unikając uszkodzenia leżącego pod nią mięśnia. Uwidocznij dystalne ścięgno piszczelowe przednie nad stopą, a następnie oddziel dystalne ścięgno piszczelowe przednie od ścięgna prostownika palca, przesuwając końcówkę pęsety poniżej ścięgna. Delikatnie wsuń pęsetę poniżej kości piszczelowej przedniej, aby oddzielić ją od leżącego poniżej mięśnia.Przytrzymaj pęsetę pod mięśniem, aby był lekko uniesiony. Przetnij ścięgno piszczelowe przednie i delikatnie pociągnij je do góry, aż przyczepi się tylko obszar poniżej kolana. Następnie odetnij TA poniżej kolana, podążając nożyczkami za krawędzią mięśnia.Umieść niewielką ilość gumy tragakantowej na plasterku korka. Włóż dystalne ścięgno TA do dziąsła tragakantowego i pozostaw około 3/4 mięśnia na zewnątrz, upewniając się, że mięsień jest w pozycji prostopadłej w stosunku do korka. Następnie napełnij aluminiową puszkę izopentanem.Zawieś puszkę z izopentanem w dewarze zawierającym ciekły azot. Gdy izopentan osiągnie odpowiednią temperaturę, na dnie puszki tworzą się białe cząstki stałe. Szybko zanurz korek z mięśniem w izopentanie, utrzymując pozycję mięśnia w dół.Podczas gdy próbka unosi się na wodzie, w cieczy powinna być widoczna tylko odwrotna strona korka. Pozostawić próbkę w izopentanie na jedną minutę. Następnie zanurz mięsień w ciekłym azocie na co najmniej dwie minuty.Następnie zawiń próbki pojedynczo w oznakowaną folię aluminiową i natychmiast umieść je w suchym lodzie. Podczas zabiegu niezwykle ważne jest utrzymanie odpowiedniej temperatury i zapobieganie rozmrożeniu preparatu. W tej procedurze należy umieścić kikut próbki, ostrze i próbkę w komorze kriostatu, pozwalając im na równowagę przez co najmniej 30 minut.Następnie umieść niewielką ilość związku zamrażającego na kipicie próbki i zanurz korek z próbką w związku OCT, zanim związek zamrażający zastygnie. Umieść ostrze w uchwycie ostrza. Umieść próbkę w odpowiednim uchwycie.Wytnij sekcje o grubości 10 mikrometrów. Następnie umieść sekcje na spolaryzowanym slajdzie. Po pocięciu przechowuj szkiełka w temperaturze 80 stopni Celsjusza.W kapturze chemicznym całkowicie wysusz zamrożone szkiełka z sekcjami przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieść szkiełka w tacy do barwienia. Barwić skrawki przez jedną minutę hematoksyliną.Następnie połóż koryto barwiące pod dość słabym strumieniem wody z kranu na 10 minut, aby wypłukać hematoksylinę. Następnie należy przebarwić skrawki roztworem eozyny przez jedną minutę, a następnie spłukać je wodą, aby usunąć nadmiar roztworu eozyny. Następnie odwodnić próbki w serii stopniowanego etanolu w 50%następnie 70%Następnie szybko zanurz próbki w 95% etanolu, a następnie dwie zmiany w 100% etanolu.Oczyścić próbki w dwóch przemianach ksylenu, każda przez co najmniej pięć minut. Aby zamontować szkiełka, nałóż kilka kropel medium montażowego na bazie ksylenu na każde szkiełko i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Trzymaj szkiełka w dygestoriach przez kilka godzin lub na noc.Pokazany jest schemat eksperymentalny ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych. Poniżej znajdują się reprezentatywne zdjęcia wybarwionych hematoksyliną i eozyną odcinków mięśni leczonych kardiotoksyną we wskazanych dniach po urazie. Kilka martwiczych włókien, które są otoczone czarną ciągłą linią, jest prawdopodobnie zaatakowanych przez komórki zapalne.Linia przerywana oznacza obszar naciekających komórek jednojądrowych. Pojedyncze niedojrzałe włókno mięśniowe z centralnie położonym jądrem jest oznaczone czarnym kółkiem. Oto duże zregenerowane eozynofilowe miowłókna z centralnie położonymi jądrami, które są oznaczone czarnymi okręgami.Ten wykres pokazuje średnią wartości wielkości włókien mięśniowych z centralnymi jądrami w sekcjach mięśni TA. A ten wykres pokazuje rozkład obszaru przekroju poprzecznego włókna mięśniowego po 6, 15 i 30 dniach od wstrzyknięcia kardiotoksyny. Po tej procedurze skrawki mięśni szkieletowych mogą być wykorzystywane do wykonywania różnych protokołów histologicznych i immunofluorescencyjnych w celu zidentyfikowania określonych cech tkanki mięśniowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać różne aspekty procesu regeneracji mięśni szkieletowych, które następują po ostrym urazie.

induction-acute-skeletal-muscle-regeneration-cardiotoxin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.

Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Opisujemy nowatorską technikę eksperymentalną, którą nazywamy Minimalnie Inwazyjnym Osadzaniem Mięśni (MIME), która opiera się na dowodach, że tkanka mięśni szkieletowych zawiera żywotne komórki miogenne, które mogą ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy, gdy zostaną wszczepione do mięśnia gospodarza.

Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Ten protokół opisuje wykorzystanie modelu przewlekłej aktywności skurczowej ćwiczeń do obserwacji wywołanych stymulacją adaptacji mięśni szkieletowych w tylnych kończynach szczura.

Zastosowanie przewlekłej stymulacji do badania adaptacji fenotypowych mięśni szkieletowych szczurów wywołanych aktywnością skurczową

Opisujemy metodę in vivo do badania funkcjonalnej utraty określonego genu w komórkach satelitarnych za pomocą kombinacji uszkodzenia mięśni szkieletowych za pośrednictwem kardiotoksyny i wstrzyknięcia samodostarczającego siRNA.

Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

Ten protokół opisuje proste urządzenie, które naśladuje metodę rolki Dinga, ustanawia szczurzy model uszkodzenia mięśni szkieletowych i wykorzystuje barwienie hematoksyliną-eozyną do obserwacji patologii uszkodzonej tkanki oraz test immunoenzymatyczny do wykrywania zmian w markerach uszkodzenia surowicy.

Naśladowanie metody Dinga na uszkodzeniu mięśni wywołanym nutoksyną u szczurów

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Poznaj metodę indukcji ostrej regeneracji mięśni szkieletowych u myszy przez wstrzyknięcie kardiotoksyny do mięśnia piszczelowego przedniego. Protokół umożliwia badanie mechanizmów naprawy tkanek mięśniowych in vivo.

Indukcja ostrej regeneracji mięśni szkieletowych przez wstrzyknięcie kardiotoksyny

Przeglądaj więcej filmów