Name: In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę znakowania replikacji DNA mitochondrialnego w jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU. Technika ta umożliwia zachowanie struktury tkanek i skuteczną penetrację barwnika fluorescencyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy K. Delaneyowi za komentarze do manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Narodowy Program Stacjonarny Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI).

1. Pobieranie i sekcja tkanek
<ol>
	<li>W każdej fiolce zawierającej suche drożdże hoduje się 10 dorosłych samic much z 10 samcami przez 2-3 dni. 
	Uwaga: Utrzymanie dobrze odżywionych samic much poprawi ogólną jakość i wydajność produkcji jajników oraz ułatwi preparację.</li>
	<li>Znieczulij samice much na podkładce dla much z dwutlenkiem węgla (CO2 ).</li>
	<li>Pod stereoskopem umieść kilka kropli pożywki RT (pożywka Schneidera Drosophila uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)) na podkładce preparcyjnej. Przeprowadź wszystkie procedury preparacyjne w pożywce, aby utrzymać tkanki przy życiu i w zdrowiu.</li>
	<li>Chwyć utuczoną samicę muchy ostrymi kleszczami z cienkim nosem w dolnej części klatki piersiowej. Użyj innego zestawu kleszczy, aby delikatnie pociągnąć za skrajną tylną część muchy, aż tkanki w jamie brzusznej zostaną odsłonięte. Odłącz dwa jajniki od innych tkanek (np. jelit). 
	Uwaga: Każdy jajnik ma nieprzezroczystą strukturę, która składa się z 16-20 przyczepionych jajników.</li>
	<li>Aby zwiększyć penetrację odczynników, otwórz jajniki, rozsuwając je i kilkakrotnie przesuwając końcówki kleszczy między każdym jajnikiem. Utrzymuj jajniki połączone w jajniku, aby zminimalizować utratę tkanek podczas kolejnych zabiegów.</li>
	<li>Natychmiast przenieś jajniki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl pożywki Drosophila firmy Schneider z 10% FBS.</li>
	<li>Powtórz sekcję i zbierz 10-15 jajników do każdej probówki mikrowirówkowej.</li>
</ol>
2. Etykietowanie EdU
<ol>
	<li>Odessać pożywkę w każdej probówce i zastąpić 500 μl pożywki Schneider's Drosophila z 10% FBS zawierającą 7 μM afidikoliny. 
	Uwaga: Afidikolina służy do blokowania syntezy jądrowego DNA poprzez hamowanie polimerazy DNA α bez wpływu na replikację mtDNA 7,12. Możliwe jest zwiększenie stężenia afidikoliny do 70 μM w celu uzyskania lepszego hamowania. Roztwór podstawowy 3-30 mM afidikoliny w DMSO może być przechowywany w ciemności w temperaturze -20 °C przez okres do 6 tygodni.</li>
	<li>Aby jajniki były zdrowe, upewnij się, że są zanurzone w roztworach podczas zmiany pożywki. Użyj pożywki Drosophila firmy Schneider z 10% FBS w kroku 2.6.</li>
	<li>Inkubuj jajniki przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na stołowym bujaku z delikatnym obracaniem.
	<ol>
		<li>W przypadku leczenia farmakologicznego, np. 4-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) cyjanku karbonylu (FCCP) do rozprzęgania mitochondrialnego, należy dodać odpowiednie stężenie leku (np. 10 μM FCCP) do pożywki po 2 godzinach leczenia afidikoliną. Kontynuuj inkubację przez kolejną 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą afidikolinę z lekiem lub bez. Krótko przepłukać jajniki pożywką (afidikolina nie jest konieczna) dwa razy.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki zawierającej 10 μM EdU i 7 μM afidikoliny i kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Przechowywać roztwór podstawowy 10 mM EdU (w DMSO) w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą EdU i afidikolinę. Umyć pożywką (bez afidikoliny) dwa razy po 3 minuty.</li>
</ol>
3. Utrwalanie i przepuszczalność tkanek
<ol>
	<li>Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4). 
	Uwaga: Użyliśmy dostępnego na rynku paraformaldehydu przechowywanego w ampułkach z nacięciem. Otwórz nową ampułkę i rozcieńcz do 4% przed użyciem. 
	UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny; Należy obchodzić się z nim pod wyciągiem z ochroną skóry i oczu.</li>
	<li>Utrwal jajniki 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i przemyć jajniki dwukrotnie w 1 ml 3% BSA w PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Aby przepuszczalność tkanek, usuń roztwór myjący i dodaj 1 ml 0,5% Triton X-100 w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór permeabilizacyjny i przemyć dwukrotnie w 1 ml 3% BSA w PBS.</li>
</ol>
4. Wykrywanie EdU
Uwaga: Wykrywanie EdU opiera się na chemii "klik", katalizowanej przez Cu(I) [3+2] cykloaddycji 13, która dodaje fluorescencyjne azydki do końcowej grupy alkinowej EdU, a cząsteczka fluorescencyjna jest poddawana późniejszej detekcji. Ponieważ Cu(I), który łatwo utlenia się do niekatalitycznych form Cu(II), jest wymagany do katalizowania reakcji, zaleca się redukcję siarczanu Cu(II) in situ w celu otrzymania Cu(I). Oznacza to, że siarczan Cu(II) jest stosowany w obecności reduktora, takiego jak kwas askorbinowy (zwany dalej "dodatkiem buforowym") do wytwarzania miedzi (I).
<ol>
	<li>Przed eksperymentem należy przygotować roztwór roboczy azydku Alexa Fluor (azydek Alexa Fluor 488, azydek Alexa Fluor 555 lub inne, w zależności od preferowanego fluoroforu, które są dalej nazywane "azydkiem barwnika"), buforu reakcyjnego EdU i dodatku buforowego EdU zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Rozpuść barwnik azydkowy w 70 μl DMSO. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
		<li>Przygotować świeży bufor reakcyjny EdU, rozcieńczając 10-krotny bufor reakcyjny EdU wodą dejonizowaną. 
		Uwaga: Po użyciu przechowywać pozostały 1x roztwór w temperaturze 4 °C. Roztwór 1x jest stabilny do 6 miesięcy.</li>
		<li>Przygotować 10-krotny roztwór podstawowy dodatku buforowego EdU, całkowicie rozpuszczając proszek w 2 ml wody dejonizowanej. 
		Uwaga: Ten roztwór podstawowy jest stabilny przez okres do 1 roku w temperaturze -20 °C. Jeśli roztwór zmieni kolor na brązowy, uległ degradacji i należy go wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Koktajl reakcyjny EdU należy za każdym razem przygotować na świeżo i zużyć w ciągu 15 minut od przygotowania. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, należy upewnić się, że składniki reakcji są utrzymywane w tych samych proporcjach.
	<ol>
		<li>Przygotuj świeży roztwór 1x dodatku buforowego EdU, rozcieńczając 10x roztwór podstawowy (przygotowany w kroku 4.1.3) 1:10 w wodzie dejonizowanej. Użyj tego roztworu tego samego dnia.</li>
		<li>Przygotuj 1 ml koktajlu reakcyjnego EdU, łącząc następujące składniki w kolejności: 860 μl 1x bufor reakcyjny EdU, 40 μl CuSO4, 2,5 μl azydku barwnika, 100 μl 1x dodatek buforowy EdU. 
		Uwaga: Ważne jest, aby składniki zostały dodane w celu zapewnienia optymalnej wydajności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć PBS z 3% BSA i dodać 0,5 ml koktajlu reakcyjnego EdU do każdej probówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut z delikatnym obracaniem. Próbki należy chronić przed światłem.</li>
	<li>Usunąć koktajl reakcyjny EdU i przemyć raz 1 ml 3% BSA w PBS.</li>
	<li>Próbki należy przemyć raz 1 ml PBS.</li>
</ol>
5. Oznaczanie przeciwciał
Uwaga: Wykonaj znakowanie przeciwciał po barwieniu EdU. Jeśli nie jest wymagane dodatkowe barwienie, można przejść bezpośrednio do montażu i obrazowania. Ważne jest, aby próbki były chronione przed światłem we wszystkich poniższych procedurach.
<ol>
	<li>Usuń roztwór myjący. Zablokować jajniki w 1 ml roztworu blokującego zawierającego 0,2% BSA i 0,1% Triton X-100 w PBS na 30 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i zastąpić go pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w roztworze blokującym (np. mysia podjednostka syntazy ATP α przeciwciało, rozcieńczenie 1:1,000). Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Przemyć próbki 1 ml roztworu blokującego 3 razy, za każdym razem po 10 minut. Aby zminimalizować tło, umyj je jeszcze dwa razy po 30 minut. Usuń roztwór blokujący.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym (np. kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom Alexa Fluor 568, rozcieńczenie 1:200) przez 2 godziny w RT. 
	Uwaga: Użyj innego koloru niż ten sprzężony z EdU.</li>
	<li>Powtórz kroki prania wykonane w kroku 5.3.</li>
	<li>Spłucz raz 1 ml PBS, aby usunąć detergent.</li>
</ol>
6. Montaż i obrazowanie
<ol>
	<li>Ostrożnie usunąć cały PBS i natychmiast przykryć jajniki 50 μl pożywki montażowej (z DAPI lub bez). 
	Uwaga: Użyj podłoża montażowego, które nie twardnieje podczas oddzielania jajników od siebie. Jajniki mogą być przechowywane w podłożu montażowym w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.</li>
	<li>Odetnij końcówkę końcówki pipety i użyj jej do ostrożnego przeniesienia jajników na szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Całkowicie oddziel każdy jajnik ostrymi kleszczami z cienkim noskiem pod mikroskopem stereoskopowym. Usuń tkanki łączące na tylnym końcu i etapie 14 lub komorach dojrzałych jaj. Komory młodych jaj znajdują się na przednim końcu i są przezroczyste.</li>
	<li>Wyrównaj komory na jajka za pomocą kleszczy tak, aby nie zachodziły na siebie.</li>
	<li>Powoli opuść szklane szkiełko nakrywkowe # 1,5 na próbki. Pozostawić podłoże montażowe do polimeryzacji przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Uszczelnić przezroczystym lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obraz jest przenoszony następnego dnia lub przechowywany w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem.</li>
	<li>Wizualizacja pod mikroskopem konfokalnym dzięki obiektywowi 63X z olejkiem. Przechwytywanie trójwymiarowych obrazów z-stacks. 
	Uwaga: W późniejszych stadiach komór jajowych występuje silny sygnał EdU, a w osłonce nabłonkowej fluorescencja tła. Badając znakowanie EdU w danym germarium, należy unikać zarodków, które nakładają się na inne tkanki lub komory jajowe w późniejszym stadium lub w ich pobliżu.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Wallace, D. C., Chalkia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+genetics+and+the+heteroplasmy+conundrum+in+evolution+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220(2013).</li>
<li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).</li>
<li>Riechmann, V., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+formation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Axis formation during Drosophila oogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).</li>
<li>Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+fusome%2C+a+germline-specific+organelle%2C+contains+membrane+skeletal+proteins+and+functions+in+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation.</a> Development. 120 (4), 947-956 (1994).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li>
<li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).</li>
<li>Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+mitochondrial+genomes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of mitochondrial genomes in human cells.</a> BMC Biol. 2, (2004).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+primate+neocortex%3A+an+evaluation+of+the+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propagation+of+functional+mitochondrial+DNA+during+oogenesis+restricts+the+transmission+of+a+deleterious+mitochondrial+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant.</a> Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).</li>
<li>Lentz, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28i%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Horwitz, H. B., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+by+ethidium+bromide+of+mitochondrial+DNA+synthesis+in+physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum.</a> J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).</li>
<li>Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+biochemistry+of+eucaryotic+DNA+replication+revealed+by+aphidicolin%2C+an+unusual+inhibitor+of+DNA+polymerase+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha.</a> Cell. 23 (3), 647-648 (1981).</li>
<li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-aminobutyric+acid+B+receptor+1+mediates+behavior-impairing+actions+of+alcohol+in+Drosophila%3A+adult+RNA+interference+and+pharmacological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znakowanie EdU to nowatorska i skuteczna metoda wykrywania syntezy DNA w proliferujących komórkach, która opiera się na włączaniu i barwieniu analogów nukleozydów w nowo zsyntetyzowanym DNA. Ta metoda jest lepsza od metody etykietowania BrdU, ponieważ jest szybsza i bardzo czuła. Co ważniejsze, pozwala na dobrą konserwację strukturalną i skuteczną penetrację barwnika EdU w całych tkankach 9, 10. Historycznie, jako lepsza alternatywa dla znakowania BrdU, znakowanie EdU było używane do badania replikacji jądrowego DNA podczas fazy S cyklu komórkowego. Afidikolina jest inhibitorem polimerazy DNA α, która jest główną polimerazą do replikacji jądrowego DNA w fazie S 1215. Replikacja mtDNA odbywa się za pomocą polimerazy DNA γ, która jest niewrażliwa na leczenie afidikoliną. W związku z tym leczenie afidikoliną przed i w trakcie inkubacji EdU znacznie hamowało inkorporację EdU do jądrowego DNA. Należy zauważyć, że afidikolina może być stabilna przez kilka tygodni, jeśli jest odpowiednio przechowywana, a skuteczność afidikoliny w hamowaniu replikacji jądrowego DNA była zmienna w naszych rękach. Jajniki lub komory jajowe z silnym znakowaniem jądrowym DNA powinny być wyłączone z dalszych analiz danych.
Replikację mtDNA można łatwo zwizualizować jako puncta w cytoplazmie, co zapewnia również prosty sposób ilościowego określenia poziomu replikacji mtDNA poprzez zliczenie liczby EdU puncta, znormalizowanej do całkowitej objętości cytoplazmy. Oprogramowanie do obrazowania może być stosowane do automatycznej identyfikacji punktów EdU na obrazach mikroskopowych, co jest szczególnie przydatne w przypadku analiz obliczeniowych dużych zbiorów danych. Należy jednak podjąć środki ostrożności, ponieważ niepełne zahamowanie replikacji jądrowego DNA może prowadzić do włączenia EdU do odrębnych loci na chromosomie i objawienia się jako puncta wewnątrz jądra. Również w innych przypadkach intensywność inkorporacji EdU do replikacji mtDNA może być słaba, podczas gdy tło i szum mogą być wysokie. W związku z tym należy dokładnie określić poszczególne parametry do automatycznych analiz obrazu. Zaleca się również, aby obrazy były badane wprawnymi oczami, aby upewnić się, że zidentyfikowano prawidłowe punkty EdU.
Wizualizacja nowo zsyntetyzowanego mtDNA podczas oogenezy Drosophila daje możliwość zbadania, w jaki sposób replikacja mtDNA jest regulowana w warunkach fizjologicznych lub patologicznych, poprzez przeprowadzenie eksperymentu na muszkach poddanych różnym zaburzeniom farmakologicznym lub genetycznym. W poprzednim badaniu test inkorporacji EdU przeprowadzono w zmutowanym mtDNA Drosophila mt:CoIT300I11. Ponadto, aby zakłócić potencjał błony mitochondrialnej, jajniki traktowano różnymi stężeniami rozprzęgacza mitochondriów FCCP lub 2,4-dinitrofenolu (DNP) przed włączeniem EdU. W zależności od celów eksperymentalnych i charakterystyki leku, można zastosować różne metody skutecznego dostarczania. W przypadku dorosłych much narkotyki mogą być prezentowane w postaci pary (np. etanolu i kokainy) 16,17 lub narkotyki mogą być wstrzykiwane do brzucha, gdzie szybko dyfundują po całym ciele 18. Najczęstszą praktyką jest dodawanie leków do pokarmu dla much lub bibuły filtracyjnej nasyconej sacharozą/lekami. Na przykład inhibitor składania mikrotubul, kolchicyna, podawano muszkom przez 2-3 dni przed rozwarstwieniem jajników 19. Dlatego ważne jest, aby ocenić sposób dostarczania leku i dobrać odpowiednie stężenia.
Aby zapewnić pomyślne obrazowanie replikacji mtDNA w jajnikach Drosophila , należy starannie wykonać kilka krytycznych kroków. Przede wszystkim niezbędne jest zachowanie żywotności i zdrowia jajników podczas rozwarstwiania i inkorporacji EdU (kroki 1 i 2). Pożywka Schneider's Drosophila z FBS musi być podgrzana do RT przed użyciem. Należy zminimalizować bezpośredni kontakt komór na jaja z narzędziami sekcyjnymi lub końcówkami pipet. Jajniki powinny być cały czas zanurzone w roztworach, aby uniknąć odwodnienia. Niewłaściwe obchodzenie się z tkankami może łatwo doprowadzić do słabych sygnałów fluorescencyjnych lub ich braku. Na etapie montażu tkanki jajniki powinny być oddzielone od siebie i rozłożone na szkiełku mikroskopowym. Upewnij się, że komory na jajka nie są ułożone jedna na drugiej. Zauważyliśmy, że komory jajowe poza etapem 14 wykazywały niewielką inkorporację EdU. Dodatkowo, ze względu na duży rozmiar, komory jajowe w późnym stadium często powodują, że sąsiednie młodsze komory jajowe są nieostre. Dlatego zaleca się odrzucenie komór jajowych w późnym stadium.
Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół znakowania replikującego mtDNA w dorosłych jajnikach Drosophila . Metoda ta pozwala na prostą kwantyfikację replikacji mtDNA w warunkach różnych zaburzeń genetycznych i farmakologicznych i będzie przydatna do analizy mechanizmów leżących u podstaw rozwojowej biogenezy mitochondriów i dziedziczenia mtDNA.

Oprócz genomu jądrowego, każda komórka eukariotyczna zawiera również tysiące kopii małego kolistego DNA w macierzy mitochondrialnej. Podczas gdy mitochondrialne DNA (mtDNA) koduje niezbędne podjednostki łańcucha transportu elektronów, większość proteomu mitochondrialnego, w tym wszystkie czynniki replikacji i transkrypcji mtDNA, jest kodowana przez genom jądrowy. W przeciwieństwie do genomu jądrowego, który podlega mendlowskim prawom dziedziczenia, zwierzęcy genom mitochondrialny jest dziedziczony wyłącznie przez linię matczyną. Dlatego zrozumienie, w jaki sposób mtDNA jest proliferowane i przekazywane z pokolenia na pokolenie przez żeński oocyt, ma fundamentalne znaczenie. Trwa jednak debata na temat tego, w jaki sposób replikacja mtDNA jest regulowana w żeńskiej linii zarodkowej. Ponadto powszechnie akceptowana teoria wąskiego gardła mtDNA dla transmisji mtDNA sugeruje, że populacja mtDNA w pierwotnych komórkach rozrodczych jest podpróbkowana do stosunkowo niewielkiej liczby podczas rozwoju 12. Oznacza to również, że replikacja mtDNA jest regulowana czasowo i przestrzennie podczas oogenezy. W związku z tym wykrycie replikacji mtDNA in situ podczas rozwoju linii zarodkowej ułatwi zrozumienie mechanizmu dziedziczenia mtDNA.
Oogeneza Drosophila dostarcza genetycznie elastycznego systemu do badania replikacji i transmisji mtDNA. W każdym z dwóch jajników Drosophila znajduje się 16-20 niezależnych ciągów komór jajowych zwanych jajnikami 3, które są funkcjonalnymi jednostkami produkcji jaj (patrz ryc. 1A). Każdy jajnik zawiera postępującą liniową organizację oogenezy, w której przedni wierzchołek składa się ze struktury zwanej germarium. Germarium jest dalej podzielone na cztery regiony, które zawierają komórki rozrodcze na różnych etapach rozwoju. W regionie 1 komórki macierzyste linii rozrodczej przechodzą asymetryczny podział w celu wytworzenia komórek potomnych zwanych cystoblastami. Region 2a zawiera cystoblasty, które zakończyły swój ostateczny podział. Cystoblasty przechodzą cztery rundy podziału, w wyniku których powstają grupy 16-komórkowe. 16 komórek pozostaje połączonych ze sobą mostkami cytoplazmatycznymi zwanymi kanałami pierścieniowymi. Tylko jedna z komórek zobowiązuje się do różnicowania jako oocyt, podczas gdy pozostałe 15 rozwija się jako poliploidalne komórki pielęgniarskie. Proponuje się, aby niezbędna struktura cytoplazmatyczna, znana jako dymos, ułatwiała tworzenie kanałów pierścieniowych, określała polarność torbieli i interakcje komórka pielęgniarka-oocyt 4,5. Gdy torbiele przesuwają się w kierunku regionu 2b, struktury torbieli rozciągają się na całej szerokości zarodka i stają się bardziej związane z komórkami pęcherzykowymi. Struktury germarium kończą się regionem 3 zawierającym pierwszą komorę pączkującą jaja. Następnie komory jajowe są montowane na tylnym końcu germarium, które przechodzą przez jajnik w 14 morfologicznie odrębnych stadiach. Wzrost oocytu zależy od komórek pielęgniarskich, które transportują białka, mRNA i struktury endobłonowe (np. Golgiego) przez kanały pierścieniowe do oocytu. Podczas oogenezy Drosophila stwierdzono, że część mitochondriów w każdej 16-komórkowej torbieli była związana z dymem, przemieszczała się przez kanały pierścieniowe i była dostarczana do pojedynczego oocytu w dużej masie zwanej ciałem Balbiani 6. Zaproponowano, aby zjawisko to przyczyniło się do kontroli jakości dziedziczenia mitochondriów przez żeńskie jajniki.
Wykrywanie syntezy mtDNA polega na włączeniu znakowanych prekursorów DNA do DNA komórkowego. Tradycyjnie, analog nukleozydu 5-bromo-2'-deoksyurydyny tymidyny (BrdU) stosowano do znakowania replikacji mtDNA w komórkach hodowli tkankowej 7,8. Jednak znakowanie BrdU oparte na przeciwciałach ma kilka ograniczeń, szczególnie w przypadku barwienia tkanek w całości. Jedną z głównych wad znakowania BrdU jest to, że wymaga denaturacji DNA w celu odsłonięcia epitopu BrdU, tak aby mógł on zostać wykryty przez przeciwciało anty-BrdU. Próbka musi zostać poddana obróbce w trudnych warunkach denaturacji, takich jak chemikalia (np. kwas solny lub mieszaniny metanolu i kwasu octowego), ciepło lub mineralizacja za pomocą DNazy, które mogą zakłócić strukturę próbki i skomplikować następującą procedurę barwienia 9,10.
Tutaj alternatywny analog tymidyny 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) jest używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA w jajnikach dorosłych Drosophila. Ta metoda jest szybsza i bardzo czuła. EdU jest łatwo włączany do DNA komórkowego podczas replikacji DNA. Następujące wykrywanie opiera się na reakcji "kliknięcia", katalizowanej Cu (I) reakcji kowalencyjnej między końcową grupą alkinową a fluorescencyjnym azydkiem 10. Ponieważ reakcja nie wymaga denaturacji próbki, pozwala na dobrą konserwację strukturalną. Co więcej, wielkość azydku barwnika wynosi zaledwie 1/500 wielkości cząsteczki przeciwciała 10, co umożliwia szybką i skuteczną penetrację całych tkanek. Użyliśmy tej metody do wykrycia replikacji mtDNA podczas oogenezy Drosophila i znaleźliśmy uderzający wzór przestrzenny w regionie germarium jajnika Drosophila 11, co skłoniło nas do zaproponowania zależnego od replikacji mechanizmu selektywnego dziedziczenia mtDNA. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół znakowania EdU replikacji mtDNA w jajnikach Drosophila. Aby zademonstrować zastosowanie protokołu, przetestowaliśmy również replikację mtDNA w mutancie mtDNA Drosophila (mt:CoIT300I) 11, a także z różnorodnym traktowaniem rozprzęgaczy mitochondriów, które rozpraszają potencjał błony mitochondrialnej i potencjalnie zakłócają replikację mtDNA.

<table><tbody><tr><td>Schneidera" s Drosophila medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Para kleszczy Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma</td><td>A0781</td><td>Aliquot po rozpuszczeniu w DMSO. Unikaj powtarzającego się rozmrażania i zamrażania. Chronić przed światłem. Można zużyć w ciągu 6 tygodni po rozpuszczeniu.&nbsp;</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% Mikroskopia elektronowa klasy EM</td><td>Sciences</td><td>15710</td><td>Formaldehyd jest toksyczny; należy się z nim obchodzić w dygestorium z ochroną skóry i oczu.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3190</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>EdU, CuSO4, azydek Alexa Fluor 488, bufor reakcyjny EdU i dodatek buforowy Edu</td></tr><tr><td>W zestawie znajduje się podjednostka i przeciwciało mysiej syntazy ATP (15H4C4)</td><td>MitoSciences</td><td>Ab14748</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało Hts (klon RC)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>hts RC</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysie Alexa Fluor 568 przeciwciało drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane, #1,5 22 mm x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Elf</td><td></td><td>Wiele pigmentów stosowanych w lakierach do paznokci jest fluorescencyjnych i wypłukuje się do próbek. Należy używać wyłącznie bezbarwnego lakieru do paznokci.</td></tr></tbody></table>

in situ znakowanie replikacji mitochondrialnego dna w dorosłych jajnikach drosophila za pomocą barwienia edu

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Genom mitochondrialny jest dziedziczony wyłącznie przez linię matczyną. Zrozumienie, w jaki sposób mitochondrium i jego genom są proliferowane i przekazywane z pokolenia na pokolenie przez żeński oocyt, ma fundamentalne znaczenie. Ze względu na wykonalność genetyczną i elegancką, uporządkowaną prostotę, z jaką przebiega rozwój oocytów, oogeneza Drosophila stała się nieocenionym systemem do badań mitochondrialnych. Metodę znakowania EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyny) wykorzystano do wykrycia replikacji mitochondrialnego DNA (mtDNA) w jajnikach Drosophila. Metoda ta jest lepsza od metody znakowania BrdU (5-bromo-2'-deoksyurydyny), ponieważ pozwala na dobrą konserwację strukturalną i skuteczną penetrację barwnika fluorescencyjnego w tkankach pełnomocowanych.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół oznaczania replikującego mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą EdU. Niektóre rozwiązania techniczne są oferowane w celu poprawy żywotności jajników, utrzymania ich zdrowia podczas preparacji i zapewnienia wysokiej jakości obrazowania. Wizualizacja nowo zsyntetyzowanego mtDNA w jajnikach nie tylko ujawnia uderzający czasowy i przestrzenny wzorzec replikacji mtDNA poprzez oogenezę, ale także pozwala na proste ilościowe określenie replikacji mtDNA w różnych perturbacjach genetycznych i farmakologicznych.

Powyższy protokół umożliwia wizualizację struktur punktowych związanych z mitochondriami (Rysunek 1B-C), które wskazują na replikację mitochondrialnego DNA podczas oogenezy u Drosophila. Punkty EdU zlokalizowano w mitochondriach znakowanych barwieniem na podjednostkę alfa syntazy ATP (Rysunek 2). Obserwowane sygnały nie występowały w jajnikach traktowanych bromkiem etydium 11, inhibitorem replikacji mtDNA 14, co potwierdza, że punkty te rzeczywiście znakują replikujące się mtDNA. Do zahamowania barwienia DNA jądrowego bez wpływu na replikację mtDNA zastosowano afidikolinę (Rysunek 2). Bez zastosowania afidikoliny intensywne sygnały EdU znakowały jądra komórkowe, a punkty mtDNA były ledwo wykrywalne (Rysunek 3). Jednak w obecności afidikoliny wbudowanie w jądra zostało drastycznie ograniczone i zaobserwowano wiele punktów związanych z mitochondriami.
W komorach jajowych znajdujących się za germarium obserwuje się wysoki poziom replikacji mtDNA (Rysunek 1B). Co istotne, replikacja mtDNA w germarium wykazuje wzorzec przestrzenny. Jak wskazuje liczba punktów EdU, w regionie 1 germarium występuje umiarkowany poziom replikacji mtDNA, natomiast w regionie 2A niemal nie stwierdzono wbudowania EdU (Rysunek 1C). W miarę przesuwania się cysty do regionu 2B germarium, replikacja mtDNA zostaje wznowiona, a liczba punktów EdU w tylnej cysty regionu 2B jest znacznie wyższa niż w regionie 2A (Rysunek 1C). W szczególności intensywne wbudowanie EdU skoncentrowane było wokół kanałów pierścieniowych oraz struktur fusomy, barwionych za pomocą białka hu li tai shao (Hts). mtDNA nadal replikowało się na wysokim poziomie w regionie 3 germarium (Rysunek 1C)
Aby wykazać powiązanie konkretnych genów lub zastosowanego leczenia z proliferacją mtDNA, jajniki Drosophila można poddać manipulacjom genetycznym lub leczeniu farmakologicznemu. Potraktowaliśmy jajniki różnymi stężeniami FCCP, klasycznego mitochondrialnego protonofora, który rozprasza potencjał błony mitochondrialnej. Jako kontrolę zastosowano DMSO, który nie wpłynął na replikację mtDNA (Rysunek 4A). Wysokie dawki FCCP (10 µM) niemal całkowicie zahamowały replikację mtDNA w całym germarium (Rysunek 4D). Niemniej jednak niższe stężenia FCCP (2 lub 5 µM) miały niewielki wpływ na replikację mtDNA w regionie 1, ale zahamowały replikację w regionach 2B i 3 (Rysunek 4B-C), co sugeruje, że regiony 2B i 3 są bardziej wrażliwe na zaburzenia mitochondrialne lub charakteryzują się względnie wolniejszą kinetyką replikacji. Powyższe wyniki wskazują, że replikacja mtDNA jest powiązana z aktywnością mitochondriów. W szczególności różne regiony germarium w odmienny sposób reagowały na upośledzenie funkcji mitochondriów.
<img alt="Schemat etapów oogenezy muchy; obraz z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiający lokalizację EdU-Hts w pęcherzykach." src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Replikacja mtDNA podczas oogenezy u Drosophila. (A) Schemat owarioli Drosophila oraz powiększony widok germarium. Owariola przedstawia od lewej do prawej, od strony przedniej do tylnej, kolejne etapy rozwoju komór jajowych. W germarium pokazano fusomę (czerwony), komórki macierzyste linii zarodkowej (niebieski), mitochondria (zielony), przyszły oocyt (linia przerywana, rozpoznany po położeniu, strukturze fusomy i skupiskach mitochondriów), rozwijające się cyster (brzoskwiniowy) oraz cztery regiony rozwojowe. (B) Reprezentatywna projekcja stosu z-stack owarioli typu dzikiego, znakowanej EdU oraz przeciwciałem przeciwko Hts-RC, markerem kanałów pierścieniowych i fusomy. W obecności afidikoliny EdU została włączona do mtDNA (groty strzałek) i jąder (strzałki). Pasek skali, 10 µm. (C) Powiększony widok germariów zaznaczonych w ramce na rysunku B. Wskazano cztery regiony rozwojowe. Pasek skali, 5 µm 11 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza obrazowania komórek, wpływ afidikoliny na EdU, syntaza ATP, komórki barwione DAPI; schemat mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. replikacja mtDNA w Muszka owocówka germarium zwizualizowane poprzez wbudowanie EdU z zastosowaniem afidikoliny. (A)-(D) reprezentatywny przekrój konfokalny germarium typu dzikiego wykazujący wbudowanie EdU (zielony, b) oraz mitochondria, znakowane barwieniem na podjednostkę alfa syntazy ATP (czerwony, C), a także jądra komórkowe, znakowane barwnikiem DAPI (kolor niebieski, D) z preinkubacją z afidikoliną, inhibitorem polimerazy DNA-α. (A'-D') Powiększony obraz obszaru zaznaczonego ramką w (A) przedstawiające wbudowanie EdU (B'), mitochondria (C') oraz jądra (D'). W obecności afidykoliny wbudowywanie do jądra (strzałki) jest zredukowane, a wiele punktów zlokalizowano wewnątrz mitochondriów (groty strzałek). Paski skali, 10 µmRysunek został zmodyfikowany na podstawie 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna jąder komórkowych z barwieniem EdU, syntazy ATP i DAPI; analiza komórkowa." src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Replikacja mtDNA jest ledwo wykrywalna w germarium Drosophila bez zastosowania afidikoliny. (A)-(D) Reprezentatywny przekrój konfokalny germarium typu dzikiego ukazujący wbudowanie EdU (zielony), mitochondria zaznaczone barwieniem podjednostki alfa syntazy ATP (czerwony) oraz jądra komórkowe znakowane barwieniem DAPI (niebieski) w obecności inhibitora polimerazy DNA-α, afidikoliny. (A'-D') Powiększony obraz obszaru zaznaczonego ramką w (A) ukazujący wbudowanie EdU (B'), mitochondria (C') oraz jądra (D'). Bez afidikoliny intensywne sygnały EdU znakują jądra (strzałki), a punkty mtDNA są ledwo wykrywalne. Paski skali, 10 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna EdU; wpływ potencjału błony mitochondrialnej przy różnych stężeniach FCCP." src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Odsprzęgacz mitochondrialny upośledza replikację mtDNA. Reprezentatywne projekcje stosu z (z-stack) przedstawiające germarium typu dzikiego traktowane DMSO (A) lub odsprzęgaczem mitochondrialnym FCCP w stężeniach 2 µM (B), 5 µM (C), 10 µM (D) podczas wbudowywania EdU. Zwróć uwagę na upośledzone znakowanie EdU w regionie 2B traktowanym 2 µM FCCP (B) oraz w regionach 2B i 3 traktowanych 5 µM FCCP (obramowane ramkami). Przedstawiono cztery regiony rozwojowe. Strzałki: DNA jądrowe; groty strzałek: mtDNA. Pasek skali, 10 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Oogeneza Drosophila nadal jest wyjątkowo przydatna w badaniach nad proliferacją i dziedziczeniem mitochondriów. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy protokół używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA (mtDNA) w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), co ułatwia odkrycie mechanizmów związanych z dziedziczeniem mitochondriów, które wcześniej były dyskusyjne.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w jajnikach dorosłych osobników drosophila za pomocą barwienia EdU. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad mitochondriami, takie jak proces biogenezy mitochondriów oraz dziedziczenie mitochondrialnego DNA podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na dobrą konserwację struktury oraz efektywną penetrację całych związanych tkanek przez barwnik fluorescencyjny.Aby rozpocząć eksperyment, należy pobrać fiolkę z pożywką dla drosofil zawierającą suchy drożdże i hodować 10 dorosłych samic oraz 10 dorosłych samców w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni. Należy upewnić się, że muchy są odpowiednio karmione przez cały okres inkubacji. Muchy należy znieczulić na podkładce do znieczulania dwutlenkiem węgla, a następnie wyselekcjonować samice za pomocą pędzla.Nanieś kilka kropli pożywki dla drosofil w temperaturze pokojowej, uzupełnionej o 10% FBS, na podkładkę do sekcji i umieść ją pod stereomikroskopem. Za pomocą ostrych pęsety z cienkimi końcówkami chwyć za dolną część klatki piersiowej tuczoną samicę muchy. Utrzymując wszystkie tkanki zanurzone w pożywce, za pomocą drugiej pęsety delikatnie pociągnij za tylny koniec muchy, aż tkanki w odwłoku zostaną odsłonięte.Następnie oddziel oba jajniki od otaczającego jelita i tkanek zbędnych. Otwórz jajniki, delikatnie je rozciągając, aby odsłonić ovariola. Aby ułatwić penetrację odczynników, wprowadź końcówki pęsety między poszczególne ovariola kilka razy.Na koniec przenieś jajniki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µl czystego medium dla drosophila z 10% FBS. Powtórz sekcję, aby zebrać pożądaną liczbę jajników, umieszczając od 10 do 15 w każdej probówce do mikrocentryfugi. Aby rozpocząć znakowanie, odessij medium z probówek zawierających jajniki, upewniając się, że tkanka przez cały czas pozostaje zanurzona w roztworze, i zastąp je 500 µl medium zawierającego siedem µM afidikoliny, która jest inhibitorem syntezy jądrowego DNA.Inkubować jajniki przez trzy godziny w temperaturze pokojowej na wahadle laboratoryjnym przy łagodnym obrocie. W przypadku chęci zastosowania leku, po dwóch godzinach inkubacji dodać do pożywki odpowiednie stężenie wybranego leku, a następnie kontynuować inkubację przez czas wymagany dla wybranego leku. Usunąć pożywkę z jajników i krótko przepłukać je dwukrotnie świeżą pożywką dla drosophila.Dodaj jeden mililitr pożywki zawierającej 10 µM EdU i 7 µM afidikoliny, a następnie inkubuj jajniki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny przy delikatnym obracaniu. Na koniec usuń ciecz zawierającą EdU i afidikolinę i dwukrotnie przemyj jajniki czystą pożywką dla drosofil, za każdym razem przez trzy minuty. Aby utrwalić tkankę, najpierw inkubuj jajniki w 4% paraformaldehydzie przez dwadzieścia minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym obracaniu.Następnie należy usunąć utrwalacz i przemyć tkankę dwukrotnie w 1 ml 3%BSA w PBS, przez pięć minut za każdym razem, przy zastosowaniu rotacji. W celu permeabilizacji należy usunąć roztwór do płukania, dodać 1 ml 0,5%Triton X-100 w PBS, a następnie inkubować jajniki w temperaturze pokojowej przez dwadzieścia minut z rotacją. Na koniec należy usunąć roztwór i przemyć tkankę dwukrotnie w 1 ml 3%BSA w PBS.Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować i przechowywać dodatek do buforu EdU zgodnie z instrukcjami producenta. Proszek dodatku do buforu EdU należy całkowicie rozpuścić w dwóch mililitrach wody dejonizowanej, aby otrzymać roztwór stokowy 10x. Aby rozpocząć detekcję, należy przygotować świeży bufor reakcyjny EdU poprzez rozcieńczenie 10x buforu reakcyjnego EdU wodą zjonizowaną do jednego mililitra 1x roztworu roboczego, który wystarczy do znakowania dwóch probówek z jajnikami.Przygotuj 100 µL świeżego 1x buforu dodatkowego do EdU poprzez rozcieńczenie 10x roztworu zapasowego w stosunku 1:10 w wodzie dejonizowanej. Przygotuj 1 mL koktajlu reakcyjnego EdU, łącząc odczynniki w następującej kolejności: 860 µL 1x buforu EdU, 40 µL siarczanu miedzi, 2,5 µL azydku barwnika oraz 100 µL dodatku do buforu EdU. Ważne jest, aby dodawać odczynniki w tej konkretnej kolejności i zużyć roztwór w ciągu 15 minut od przygotowania.Usunąć roztwór BSA z próbek i dodać 0,5 milliliters koktajlu reakcyjnego EdU do każdej probówki. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy łagodnym obracaniu. Chronić próbki przed światłem.Na koniec przemyj próbki raz w 1 ml 3%BSA w PBS, a następnie raz w 1 ml PBS. Aby rozpocząć znakowanie przeciwciałami, najpierw usuń roztwór do płukania z jajników i dodaj 1 ml roztworu blokującego zawierającego 0,2%BSA i 0,1%Triton X-100 w PBS. Inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu, dbając na każdym etapie znakowania o ochronę próbek przed światłem.Usunąć roztwór blokujący. Zastąpić go przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze four degrees Celsius w ciemności. Przemyć próbki jednym mililitrem roztworu blokującego trzy razy po dziesięć minut, a następnie przemyć dwa kolejne razy po 30 minut, aby zminimalizować tło barwienia.Na koniec usunąć roztwór blokujący. Następnie inkubować tkankę w 500 µL przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w roztworze blokującym przez dwie godziny, w temperaturze pokojowej, z mieszaniem. Powtórzyć etapy płukania, używając 1 mL roztworu blokującego trzy razy przez 10 minut oraz dwa razy przez 30 minut.Na koniec opłucz tkankę 1 mL PBS, aby usunąć detergent. Ostrożnie odlej cały PBS i natychmiast przykryj tkankę 50 µL medium montażowego. Używając pipety z odciętym końcem, ostrożnie przenieś jajniki na szkiełko mikroskopowe.Pod mikroskopem stereoskopowym, używając pęsety z cienkimi końcówkami, całkowicie odseparuj każdy ovariole. Usuń tkanki łączące w części tylnej oraz komory jajowe w stadium 14 lub dojrzałe, pozostawiając wewnątrz młode, przezroczyste komory jajowe. Za pomocą pęsety ostrożnie wyrównaj komory jajowe tak, aby nie nachodziły na siebie.Powoli nałóż szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 na próbki i pozostaw medium montażowe do polimeryzacji przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Brzegi uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci, a następnie wykonaj obrazowanie próbek lub przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsius w ciemności do momentu użycia. Preparaty można przechowywać przez około dwa tygodnie.Próbki należy zobrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego z użyciem obiektywu imersyjnego 63x, a następnie zarejestrować trójwymiarowe obrazy Z-stack tkanki jajnika. Przedstawione tutaj owariol drosophila ukazują typowe, następujące po sobie stadia rozwojowe komór jajowych od strony przedniej do tylnej. Obrazy konfokalne pokazują barwienie EdU struktur punktowych związanych z mitochondriami; potwierdzono, że EdU ulega wbudowaniu do MT DNA oraz jąder komórkowych podczas oogenezy drosophila.Tutaj replikacja MT DNA w germarium drozozili jest wizualizowana poprzez wbudowywanie EdU w obecnościy inhibitora polimerazy DNA jądrowego, afidikoliny. W tych warunkach wykazano, że wbudowywanie EdU do jądra jest zredukowane, a liczne punkty zlokalizowano wewnątrz mitochondriów. W przypadku braku traktowania afidikoliną, replikacja MT DNA w germarium drozozili jest wykrywana na bardzo niskim poziomie.Przekrój konfokalny germarium typu dzikiego wykazuje intensywną inkorporację EdU w jądrach, podczas gdy punkty MT DNA są ledwo wykrywalne. Gdy germaria typu dzikiego są traktowane FCCP, odsprzęgaczem mitochondrialnym, w różnych stężeniach, replikacja MT DNA zostaje upośledzona. Potwierdza to zmniejszenie barwienia EdU, widoczne w wariantach traktowania dawkami 2 µM, 5 µM oraz 10 µM.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić prostą kwantyfikację replikacji mitochondrialnego DNA w różnych warunkach genetycznych i farmakologicznych.

in-situ-labeling-mitochondrial-dna-replication-drosophila-adult

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Opracowaliśmy czułą technikę znakowania nowo syntetyzowanego mitochondrialnego DNA (mtDNA) w pojedynczych komórkach w celu zbadania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy wbudowywanie EdU z protokołem tyramidowej amplifikacji sygnału (TSA), aby zwizualizować replikację mtDNA w obrębie przedziałów subkomórkowych neuronów.

Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Tutaj opisujemy technikę używaną do wizualizacji genomowego DNA u stałych, nienaruszonych nicieni. Film zawiera przykładowy protokół liczenia chromatyny w niezapłodnionych oocytach C. elegans.

Utrwalanie etanolu i barwienie DAPI: metoda wizualizacji DNA u C. elegans

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Poznaj metodę znakowania replikacji DNA mitochondrialnego w jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU. Technika ta umożliwia zachowanie struktury tkanek i skuteczną penetrację barwnika fluorescencyjnego.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Przeglądaj więcej filmów