In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Ogólnym celem tego eksperymentu jest oznaczenie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach muszki za pomocą barwienia EdU. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mitochondriów, takie jak proces biogenezy mitochondriów i dziedziczenie mitochondrialnego DNA podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na dobre zachowanie struktury i skuteczną penetrację barwnika fluorescencyjnego przez całe związane tkanki.

Aby rozpocząć eksperyment, weź fiolkę z pożywką Drosophila zawierającą suche drożdże i posadź 10 dorosłych samic much z 10 dorosłymi samcami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni. Upewnij się, że muchy pozostają dobrze odżywione przez cały okres inkubacji. Znieczul muchy na podkładce przeciwmuchowej z dwutlenkiem węgla i wybierz samice much pędzlem.

Dodaj kilka kropli pożywki o temperaturze pokojowej Drosophila, uzupełnionej 10% FBS, do podkładki preparacyjnej i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą ostrych kleszczy z cienkim nosem chwyć utuczoną samicę muchy w dolnej części klatki piersiowej. Trzymając całą tkankę zanurzoną w podłożu, za pomocą drugiej pary kleszczy, delikatnie pociągnij za skrajną tylną część muchy, aż tkanki w jamie brzusznej zostaną odsłonięte.

Następnie odłącz dwa jajniki od otaczającego jelita i obcej tkanki. Otwórz jajniki, delikatnie pociągając i odsłoń jajniki. Aby wspomóc penetrację odczynników, kilkakrotnie przełóż końcówki kleszczy między każdym jajnikiem.

Na koniec przenieś jajniki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów czystej pożywki dla drosofili z 10% FBS. Powtórz preparację, aby zebrać tyle jajników, ile chcesz, umieszczając od 10 do 15 w każdej probówce z mikrowirówki. Aby rozpocząć znakowanie, należy odessać pożywkę z probówek zawierających jajniki, upewniając się, że tkanka pozostaje zanurzona w roztworze przez cały czas, i zastąpić ją 500 mikrolitrami pożywki zawierającej siedmioma mikromolowymi afidikolinami, środkiem blokującym syntezę jądrowego DNA.

Inkubuj jajniki przez trzy godziny w temperaturze pokojowej na bujaku stołowym z delikatnym obracaniem. Jeśli pożądane jest leczenie farmakologiczne, po dwóch godzinach inkubacji dodaj odpowiednie stężenie wybranego leku do pożywki, a następnie pozwól inkubacji postępować przez pożądany czas dla wybranego leku. Usuń pożywkę z jajników i krótko spłucz świeżą pożywką dwa razy.

Dodać jeden mililitr pożywki zawierającej dziesięć mikromolowych EdU i siedem mikromolowych mszycic i inkubować jajniki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny z delikatnym obracaniem. Na koniec usuń płyn zawierający EdU i afidikolinę i umyj jajniki czystym podłożem dla muszki dwa razy po trzy minuty. Aby utrwalić tkankę, najpierw inkubuj jajniki w 4% paraformaldehydzie przez dwadzieścia minut w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem.

Następnie usuń utrwalacz i umyj tkankę dwukrotnie w jednym mililitrze 3% BSA w PBS, za każdym razem przez pięć minut, z rotacją. W celu permeablacji usuń roztwór myjący, dodaj jeden mililitr 0,5% Triton X-100 w PBS, a następnie inkubuj jajniki w temperaturze pokojowej przez dwadzieścia minut z rotacją. Na koniec usuń roztwór i umyj tkankę dwukrotnie w jednym mililitrze 3% BSA w PBS.

Przed eksperymentem należy przygotować i przechowywać dodatek buforowy EdU zgodnie z zaleceniami producenta. Całkowicie rozpuść dodatek buforowy EdU w proszku w dwóch mililitrach wody dejonizowanej, aby uzyskać 10-krotny bulion. Aby rozpocząć wykrywanie, przygotuj świeży bufor reakcyjny EdU, rozcieńczając 10x bufor reakcyjny EdU zjonizowaną wodą do jednego mililitra 1x roztworu roboczego, który może oznaczyć dwie probówki jajników.

Przygotuj 100 mikrolitrów świeżego roztworu buforowego 1x EdU, rozcieńczając 10x bulion 1:10 w wodzie dejonizowanej. Przygotuj jeden mililitr koktajlu reakcyjnego EdU, łącząc odczynniki w następującej kolejności: 860 mikrolitrów 1x bufor EdU, 40 mikrolitrów siarczanu miedzi, 2,5 mikrolitra azydku barwnika i 100 mikrolitrów dodatku buforowego EdU. Ważne jest, aby dodać odczynniki w tej konkretnej kolejności i zużyć w ciągu 15 minut od przygotowania.

Usunąć roztwór BSA z próbek i dodać 0,5 mililitra koktajlu reakcyjnego EdU do każdej probówki. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut z delikatną rotacją. Chronić próbki przed światłem.

Na koniec umyj próbki raz w jednym mililitrze 3% BSA w PBS, a następnie umyj raz w jednym mililitrze PBS. Aby rozpocząć znakowanie przeciwciałami, najpierw usuń roztwór do płukania z jajników i dodaj jeden mililitr roztworu blokującego zawierającego 0,2% BSA i 0,1% Triton X-100 w PBS. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, zwracając uwagę na ochronę próbek przed światłem na każdym etapie etykietowania.

Usuń roztwór blokujący. Zastąp go przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Umyj próbki jednym mililitrem roztworu blokującego trzy razy, po dziesięć minut każda, a następnie umyj dwa kolejne razy po 30 minut każda, aby zminimalizować plamienie tła.

Na koniec usuń roztwór blokujący. Następnie inkubować tkankę w 500 mikrolitrach przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w roztworze blokującym przez dwie godziny, w temperaturze pokojowej, z mieszaniem. Powtórz kroki mycia przy użyciu jednego mililitra roztworu blokującego trzy razy przez 10 minut i dwa razy przez 30 minut.

Na koniec spłucz chusteczkę jednym mililitrem PBS, aby usunąć detergent. Ostrożnie usuń cały PBS i natychmiast przykryj tkankę 50 mikrolitrami podłoża montażowego. Za pomocą pipety z naciętą końcówką ostrożnie przenieś jajniki na szkiełko mikroskopowe.

Pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą kleszczyków z cienkim noskiem całkowicie oddziel każdy jajnik. Usuń tkanki łączące w tylnej i stadium 14 lub dojrzałych komorach jajowych, pozostawiając młode, przezroczyste komory jajowe we wnętrzu. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyrównaj komory na jajka, aby nie zachodziły na siebie.

Powoli opuść szklaną szkiełko nakrywkowe o numerze 1,5 na próbki i pozwól medium montażowemu polimeryzować przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci i zobrazuj próbki lub przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemnych warunkach, aż będą potrzebne. Preparaty można przechowywać przez około dwa tygodnie.

Wizualizuj preparaty pod mikroskopem konfokalnym za pomocą 63-krotnej soczewki obiektywowej z olejkiem i uchwyć trójwymiarowe obrazy tkanki jajnika w kształcie litery Z. Pokazane tutaj Drosophila ovarioles, przedstawiające typowe kolejne etapy rozwoju komór jajowych od przodu do tyłu. Obrazy konfokalne pokazują barwienie EdU punktowej struktury związanej z mitochondriami i potwierdzono, że EdU jest włączone do DNA i jąder MT podczas oogenezy drosophila.

Tutaj replikacja MT DNA w germarium drosophila jest wizualizowana przez włączenie EdU w obecności inhibitora polimerazy jądrowej DNA afidikoliny. W tych warunkach wykazano, że inkorporacja jądrowa EdU jest zmniejszona, a wiele puncta zostało zlokalizowanych w mitochondriach. W przypadku braku leczenia afidikoliną, replikacja DNA MT jest wykrywana na bardzo niskim poziomie u drosophila germarium.

Przekrój konfokalny germarium typu dzikiego wykazuje intensywną inkorporację EdU w jądrach, z ledwo wykrywalnym punktem MT DNA DNA. Gdy germaria typu dzikiego jest traktowana rozprzęgaczem mitochondrialnym, FCCP, w różnych stężeniach, replikacja MT DNA jest upośledzona. Potwierdza to zmniejszenie barwienia EdU, co widać w dwóch zabiegach mikrotrzonowych, pięciu mikromolowych i 10 mikromolowych.

Po tej procedurze można przeprowadzić prostą kwantyfikację replikacji mitochondrialnego DNA pod różnymi preparatami genetycznymi i farmakologicznymi.