Name: Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę przygotowania skośnych wycinków rdzenia kręgowego myszy P2–P11 do stymulacji korzeni brzusznych. Technika umożliwia identyfikację motoneuronów i badanie komórek zależnych od kolateralnych aksonów motoneuronalnych w badaniach neurofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Marinowi Manuelowi i Olivii Goldman-Szwajkajzer za pomoc w zrobieniu zdjęć. Autorzy dziękują również Arjunowi Masukarowi i Tobiasowi Bockowi za korektę rękopisu. Wsparcie finansowe zostało udzielone przez Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), NIH-NINDS (R01NS077863), Fundację Thierry'ego Latrana (projekt OHEX), francuskie stowarzyszenie na rzecz miopatii (numer grantu 16026) i Target ALS są z wdzięcznością. Felix Leroy otrzymał tytuł doktora nauk humanistycznych w Ecole Normale Supérieure w Cachan.

Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z dyrektywami europejskimi (86/609/CEE i 2010-63-UE) oraz francuskim ustawodawstwem, a protokół został zatwierdzony przez komisję etyczną Uniwersytetu Paryż Descartes.
1. Przygotowanie skrawków rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory codziennie lub z jednodniowym wyprzedzeniem. W przypadku przechowywania przez noc napowietrzyć mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 oraz przechowywać w lodówce w szczelnie zamkniętych butelkach.
	<ol>
		<li>Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) o niskiej zawartości Na+: 3 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 230 mM sacharozy, 26 mM NaHCO3, 0.8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 25 mM glukozy, 0.4 mM kwasu askorbinowego, 1 mM Na-kynurenianu, 2 mM Na-pirogronianu. Napowietrzyć mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 (pH 7.4). Ponieważ Na-kynurenian jest często trudny do rozpuszczenia, należy upewnić się, że zakupiono produkt wymieniony w tabeli materiałów.</li>
		<li>Przygotowanie roztworu K-glukonianu: 130 mM K-glukonianu, 15 mM KCl, 0.05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM glukozy, 1 mM Na-kynurenianu, 2 mM Na-pirogronianu, z pH dostosowanym do 7.4 za pomocą KOH.</li>
		<li>Przygotowanie ACSF: 130 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 25 mM glukozy, 0.4 mM kwasu askorbinowego, 2 mM Na-pirogronianu. Napowietrzyć mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 (pH 7.4).</li>
		<li>Przed rozpoczęciem sekcji rozpuścić 2% agar w 80 ml roztworu K-glukonianu i utrzymywać w temperaturze 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja wewnątrzsercowa
	<ol>
		<li>Wykonuje się tę procedurę na myszach żeńskich i męskich w wieku od P2 do P11.</li>
		<li>Zanurzyć mysz w narkozie poprzez podanie dootrzewnowe 0.1 ml 25 mM pentobarbitalu sodowego (50 mg/kg).</li>
		<li>Za pomocą igieł lub taśmy unieruchomić mysz na plecach w dużej szalce Petriego wypełnionej silikonem. W dalszej części sekcji używać mikroskopu sekcyjnego.</li>
		<li>Trzymając za koniec mostka, unieść klatkę piersiową i przeciąć przeponę za pomocą cienkich nożyczek. Następnie otworzyć klatkę piersiową po obu stronach, przecinając żebra, aby odsłonić serce.</li>
		<li>Przeciąć prawy przedsionek przed nakłuciem lewej komory igłą 27G.</li>
		<li>Przeprowadzić perfuzję lodowatym ACSF o niskiej zawartości Na+. Po 30 s ACSF o niskiej zawartości Na+ powinien wypływać z przedsionka. Niskie stężenie sodu zapobiega generowaniu potencjałów czynnościowych przez komórki i ogranicza obumieranie komórek podczas sekcji.</li>
		<li>Utrzymywać igłę w sercu pod mikroskopem sekcyjnym, aż wątroba zmieni kolor na żółty wskutek odprowadzenia krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja rdzenia kręgowego
	<ol>
		<li>Dekapitować zwierzę i położyć je na brzuchu.</li>
		<li>Szybko usunąć skórę z pleców (Rycina 1A1). Wykonać dwa cięcia przez barki, prowadząc je w dół klatki piersiowej (Rycina 1A2). Następnie przeciąć rdzeń jak najniżej w sekcji ogonowej, aby odizolować kręgosłup z początkiem żeber od dolnej części zwierzęcia. Ponownie obrócić zwierzę i usunąć wnętrzności wciąż przytwierdzone do żeber.</li>
		<li>Przenieść kręgosłup do drugiej, mniejszej szalki Petriego wypełnionej silikonem i za pomocą 4 szpilek entomologicznych przymocować go stroną grzbietową do góry (Rycina 1A).</li>
		<li>Ciągle perfundować zwierzę ACSF napowietrzonym karbogenem (w temperaturze ok. 4 °C), wykonując laminektomię strony grzbietowej i odsłaniając rdzeń kręgowy od końca rostralnego (Rycina 1B). W tym celu wsunąć końcówkę cienkich nożyczek między kość a rdzeń kręgowy i odcinać kość stopniowo od końca rostralnego, dbając o zachowanie odstępu od istoty białej. Przeplatać działania na obu stronach, używając pęsety do odsuwania już odciętego pasma kości (Rycina 1B1).</li>
		<li>Używając najmniejszych dostępnych nożyczek sprężynowych i pęsety, unieść oponę twardą i przeciąć ją po obu stronach, trzymając luźną część opony, aby uniknąć uszkodzenia rdzenia kręgowego nożyczkami. Ciąć wzdłuż osi rostralno-kaudalnej. 
		UWAGA: Opona twarda jest półprzezroczystą, ciągłą błoną; w tym wieku opona miękka jest zbyt krucha i ulegnie przerwaniu podczas sekcji i krojenia (Rycina 1B2).</li>
		<li>Po usunięciu opony twardej użyć tępego szklanego lub plastikowego pręta, aby delikatnie przesunąć rdzeń na lewą stronę rowka utworzonego przez częściowo przecięty kręgosłup, a następnie przeciąć korzenie brzuszne i grzbietowe po prawej stronie, zaczynając od strony rostralnej, najdalej od miejsca ich wejścia do rdzenia (przynajmniej kilka mm, Rycina 1B2).</li>
		<li>Powtórzyć czynność po lewej stronie, zawsze kierując się od strony rostralnej do kaudalnej. Osoby leworęczne powinny zacząć od lewej strony, a następnie przejść na prawą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatopienie w agarze
	<ol>
		<li>Wysunąć rdzeń z kręgosłupa. Użyć mniejszej szpilki entomologicznej, aby przymocować rdzeń powierzchnią grzbietową do góry i delikatnie usunąć wszelkie fragmenty błony wciąż do niego przytwierdzone (Rycina 1C1).</li>
		<li>Po oczyszczeniu przyciąć oba końce (Rycina 1C2). Wsunąć zgiętą szpilkę entomologiczną w przednią część rdzenia, aby umożliwić jego manipulację i zaznaczyć orientację (strzałka na Rycynie 1C2). Następnie przenieść rdzeń kręgowy do lodowatego roztworu K-glukonianu. 
		UWAGA: Roztwór ten naśladuje wewnątrzkomórkowy skład płynu mózgowo-rdzeniowego i zapobiegnie obumieraniu komórek wskutek szoku osmotycznego po przecięciu motoneuronów26.</li>
		<li>Gdy rdzeń kręgowy znajdzie się w roztworze wewnątrzkomórkowym, wyjąć z łaźni suchej zlew z agarem i schłodzić go w mieszaninie lodu i wody.</li>
		<li>Mieszać, mierząc temperaturę. Gdy temperatura osiągnie 38 °C, zanurzyć rdzeń kręgowy, trzymając go za szpilkę entomologiczną, i umieścić go stroną rostralną w dół. Upewnić się, że rdzeń kręgowy jest jak najprostszy, z dala od ścianek, z częścią kaudalną skierowaną lekko ku górze (Rycina 1D1).</li>
		<li>Pozostawić zlew w mieszaninie lodu i wody, aby agar zastygł jak najszybciej. Upewnić się, że blok pozostaje na miejscu, a rdzeń jest jak najprostszy (Rycina 1D1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krojenie
	<ol>
		<li>Po zastygnięciu odciąć blok agaru zawierający rdzeń kręgowy w taki sposób, aby podstawa bloku tworzyła kąt 35° z częścią lędźwiową rdzenia (strzałka na Rycynie 1D2). Powierzchnia grzbietowa powinna być skierowana w stronę przeciwną do podstawy (Rycina 1D2). 
		UWAGA: Jest to krytyczny etap procedury, niezbędny do zachowania ciągłości grup motoneuronów z korzeniami brzuszznymi, przez które one wychodzą.</li>
		<li>Przykleić blok do komory wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Zanurzyć go w roztworze K-glukonianu i dodać zmrożony, rozkruszony roztwór K-glukonianu, aby utrzymać niską temperaturę kąpieli (poniżej 2 °C).</li>
		<li>Wyciąć skrawki o grubości 350 - 400 µm z regionu lędźwiowego (rozpoznawalnego po zakrzywieniu i większej średnicy). W odpowiedniej orientacji (patrz 1.4.1.), użyć ostrza, aby ciąć od powierzchni grzbietowej do brzusznej, wykonując skrawki sukcesywnie bardziej rostralnie. Zazwyczaj uzyskuje się 4-5 odpowiednich skrawków z korzeniami brzusznymi o długości 2 mm lub więcej. Zastosować następujące parametry: kąt 10°, częstotliwość wibracji 70 Hz i prędkość krojenia 10 mm/min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja
	<ol>
		<li>Przenieść skrawki do ACSF w temperaturze 34 °C. Po około 30 min schłodzić skrawki do temperatury pokojowej (RT) i rozpocząć sesję rejestracyjną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces sekcji i przygotowanie tkanek, seria obrazów eksperymentalnych, badania biologiczne." src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Sekcja 
A1: Usunięcie skóry z grzbietu w celu odsłonięcia kolumny grzbietowej. A2: Przecięcie okolic barków i żeber w celu uwolnienia kolumny grzbietowej. B1: Kolumna kręgowa przypięta do szalki Petriego wypełnionej silikonem (strona grzbietowa u góry, strona ogonowa po lewej). B2: To samo z odsłoniętym i wypreparowanym rdzeniem kręgowym. C1: Izolowany rdzeń kręgowy (strona rostralna po lewej). C2: Rdzeń kręgowy przygotowany do zatopienia (strona brzuszna u góry, strona rostralna po lewej). Zwróć uwagę na mniejszą szpilkę entomologiczną po stronie rostralnej. D1: Rdzeń kręgowy w zlewce z agarem (strona rostralna skierowana w dół, strona brzuszna skierowana ku dnu). D2: Wycięty blok agaru z zatopionym rdzeniem kręgowym. Zwróć uwagę na kąt 35° tworzony przez rdzeń kręgowy z podstawą bloku oraz na zgrubienie lędźwiowe (Strzałka). Paski skali 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Umieszczanie skrawka w komorze
UWAGA: Korzenie brzuszne mają zmienną wielkość.
<ol>
	<li>Z wyprzedzeniem przygotuj zestaw różnorodnych pipet o średnicach końcówek od 40 do 170 µm. Aby przygotować pipety ssące, przygotuj wiele pipet z długim zwężeniem. Za pomocą noża diamentowego wykonaj nacięcia w różnych miejscach. Następnie pod mikroskopem stereotypowym przełam je, uderzając pęsetą w końcówkę.</li>
	<li>Wyjmij komorę z mikroskopu rejestracyjnego i umieść ją pod mikroskopem stereotypowym.</li>
	<li>Wybierz skrawek zawierający korzeń brzuszny o wystarczającej długości (2 mm lub więcej), aby można go było zamocować na ssącej elektrodzie stymulującej. Wybierz odpowiednią orientację skrawka tak, aby korzenie brzuszne były skierowane do góry (Rycina 2A) i delikatnie wytnij agar wokół korzeni brzusznych, pozostawiając resztę agaru wokół skrawka (Rycina 2B). 
	UWAGA: Ponieważ agar jest twardszy niż skrawek, pozwoli to nitkom kotwicy skrawka opierać się na agarze, a nie na skrawku, dzięki czemu kotwica nie uszkodzi tkanki. Upewnij się, że nitki kotwicy skrawka znajdują się powyżej puli motoneuronów (zaznaczonej na czerwono na Rycynie 2C).</li>
	<li>Zamocuj komorę z powrotem na mikroskopie i stale perfunduj komorę rejestracyjną roztworem ACSF z prędkością 1 - 2 ml/min w temperaturze RT. Używając szklanej pipety wypełnionej ACSF i połączonej ze strzykawką, zassij jeden z korzeni brzusznych (strzałka na Rycynie 2C). Aby uzyskać dobrą stymulację korzenia brzusznego, końcówka pipety musi ściśle przylegać do korzenia brzusznego. Jeden biegun powinien znajdować się w elektrodzie stymulującej, a drugi w kąpieli (lub być połączony z referencją elektrody do patch-clampingu).</li>
	<li>Przeprowadź rejestrację metodą patch-clamp z pożądanego typu komórek i zarejestruj efekt stymulacji korzenia brzusznego zgodnie z wcześniejszym opisem10.
	<ol>
		<li>W tym celu użyj wzmacniacza do akwizycji danych. Filtruj rejestracje whole-cell przy 3 kHz. Cyfryzuj przy 10 kHz. Skompensuj rezystancję mostkową w trybie current-clamp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Penetracja barwnika histologicznego, obrazy mikroskopowe przekrojów tkanki pokazujące techniki barwienia." src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przygotowanie korzenia brzusznego 
A: Przekrój lędźwiowego rdzenia kręgowego zatopiony w agarozie z korzeniem brzusznym skierowanym ku górze. B: Przekrój lędźwiowego rdzenia kręgowego z korzeniami brzusznymi uwolnionymi z agarozy. C: Przekrój lędźwiowego rdzenia kręgowego z elektrodą stymulującą ściśle umieszczoną wokół korzeni brzusznych (strzałka). Zwróć uwagę na lokalizację komórek Renshawa wykazujących czerwoną fluorescencję u myszy chrna2-Cre28 skrzyżowanej z myszą reporterową R26Tom 17. Paski skali 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li>
<li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li>
<li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li>
<li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417(2007).</li>
<li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li>
<li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals%3A+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li>
<li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li>
<li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86(1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li>
<li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G%2893A-Low%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li>
<li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li>
<li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li>
<li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li>
<li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li>
<li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li>
<li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li>
<li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li>
<li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li>
<li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gower%27s+tract+and+spinal+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li>
<li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Psychiatr+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li>
<li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li>
<li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-%2C+T-%2C+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li>
<li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ukośne cięcie rdzenia kręgowego jest ważne, ponieważ pozwala na jednostronną stymulację puli neuronów ruchowych i komórek Renshawa w pojedynczym segmencie kręgu w niezawodny, kompleksowy i specyficzny sposób. Co więcej, pozwala na szybką, elegancką i jednoznaczną identyfikację zarejestrowanych neuronów ruchowych. Następnie podkreślimy zalety tej techniki w porównaniu z innymi metodami przygotowania plastrów, a następnie podkreślimy najczęstsze pułapki, których należy unikać podczas wykonywania tej procedury.
<p class...

Historycznie, zapisy motoneuronów za pomocą ostrej elektrody były przeprowadzane in vivo na dużych zwierzętach, takich jakkoty czy szczury1 lub na izolowanym całym rdzeniu kręgowym u myszy2. Pojawienie się techniki nagrywania patch-clamp w latach 80. wymagało bezpośredniego dostępu do somy neuronów ruchowych, ponieważ uszczelnienie musiało być osiągnięte pod nadzorem wizualnym. W związku z tym przygotowanie plastra rdzenia kręgowego jest łatwo osiągane od wczesnych lat 90.3. Jednak wczesne przygotowanie plastrów często nie pozwalało na stymulację korzeni brzusznych. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, tylko dwa badania wykazały skuteczną stymulację korzeni brzusznych w poprzecznych warstwach, a żadne nie uzyskano od myszy4,5.
W tym artykule prezentujemy technikę uzyskiwania żywotnych wycinków rdzenia kręgowego u noworodków myszy (P2 - P11), w których pula motoneuronów zachowuje swoje aksony opuszczające korzeń brzuszny. Stymulacja korzeni brzusznych wyzwala antydromiczny potencjał czynnościowy z powrotem do somy puli neuronów ruchowych wychodzących z tego samego korzenia brzusznego. Pobudza również cele poboczne neuronów ruchowych, inne neurony ruchowe6-10 i komórki Renshawa11-13. Ponieważ tylko neurony ruchowe wysyłają swoje aksony w dół korzeni brzusznych, używamy zapisu antydromicznych potencjałów czynnościowych jako prostego i ostatecznego sposobu fizjologicznej identyfikacji neuronów ruchowych10.
Oprócz stosowania potencjalnie niewłączających lub wprowadzających w błąd kryteriów elektrofizjologicznych i morfologicznych w celu potwierdzenia tożsamości motoneuronów, ostatnie badania nad neuronami rdzenia kręgowego opierały się również na żmudnych i czasochłonnych barwieniach post hoc 16. Taka identyfikacja jest zwykle wykonywana tylko na próbce zarejestrowanych komórek. Inne strategie identyfikacji opierają się na liniach myszy, w których neurony ruchowe wyrażają endogeniczną fluorescencję17-19. Jednak stosowanie markerów kodowanych genetycznie może być trudne w młodym wieku, gdy ekspresja markerów jest nadal zmienna lub jeśli badanie wymaga już użycia transgenicznej linii myszy. Alternatywnie, zapisy antydromicznego potencjału czynnościowego mogą być wykonywane rutynowo na wszystkich myszach od początku zapisu komórki. Eksperymentatorzy pracujący nad nienaruszonymi preparatami rdzenia kręgowego u kotów, szczurów i myszy niezawodnie stosowali takie techniki identyfikacji od lat 50-tych XX wieku1,2,20,21. W optymalnych warunkach udało nam się wydobyć antydromiczne potencjały czynnościowe z praktycznie wszystkich zarejestrowanych neuronów ruchowych.
Ponadto, stymulacja korzeni brzusznych może być wykorzystana do niezawodnego pobudzania innych neuronów ruchowych22,23 lub ich celów. komórki Renshawa10,24,25. Przedstawiono tu zastosowania stymulacji korzenia brzusznego w postaci zapisów potencjału czynnościowego antydromicznego z somy neuronów ruchowych, a także pobudzenia komórek Renshawa.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenian</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>rozpuszcza się lepiej niż inne marki</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glukoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>z pirogronianem&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-glukonian&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glukonowy</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku cezu</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - 2.5mm&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>używany wyłącznie do cięcia opony twardej, może ulec uszkodzeniu w przypadku cięcia kości</td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Systemy AM</td><td>Izolowany stymulator impulsów Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td></td><td>Campden Wibracyjny mikrotom 7000 - Model 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Zapisy elektrofizjologiczne z wycinków rdzenia kręgowego okazały się cenną techniką do badania szerokiego zakresu pytań, od właściwości komórkowych po sieciowe. Pokazujemy, jak przygotować żywotne skośne plastry rdzenia kręgowego młodych myszy (P2 - P11). W tym przygotowaniu motoneurony zachowują swoje aksony wychodzące z brzuszne korzenie rdzenia kręgowego. Stymulacja tych aksonów wyzwala wstecznie propagujące potencjały czynnościowe atakujące somy neuronów ruchowych i pobudzające zabezpieczenia neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym. Rejestracja antydromicznych potencjałów czynnościowych jest natychmiastowym, ostatecznym i eleganckim sposobem scharakteryzowania tożsamości neuronu ruchowego, który przewyższa inne metody identyfikacji. Co więcej, stymulacja zabezpieczeń motoneuronów jest prostym i niezawodnym sposobem na pobudzenie celów pobocznych neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym, takich jak inne neurony ruchowe lub komórki Renshawa. W protokole tym przedstawiono zapisy antydromiczne z somy motoneuronów oraz pobudzenie komórek Renshawa, wynikające ze stymulacji korzeni brzusznych.

Potwierdzenie tożsamości motoneuronów za pomocą antidromicznych potencjałów czynnościowych
Targetowanie komórkowe
Motoneurony znajdują się w rogu przednim (widoczne na czerwono na Rysunku 2C). Należy rozpocząć od pęczka aksonów tworzących korzeń przedni i przesuwać się w górę, aż do pełnego rozproszenia pęczka i pojawien...

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie skośnych przekrojów rdzenia kręgowego, które umożliwiają stymulację korzeni brzusznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na identyfikację motoneuronów podczas stymulacji korzeni brzusznych oraz na badanie komórek brzusznych unerwionych przez odgałęzienia aksonów motoneuronów. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy pojawiła się potrzeba opracowania niezawodnego sposobu stymulacji komórek brzusznych.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na złożoność prawidłowego wykonania poszczególnych etapów sekcji. Należy zacząć od perfuzji myszy w wieku od P2 do P11 niskosodowym roztworem ACSF. Po zdekapitowaniu myszy i usunięciu skóry z grzbietu, należy wykonać dwa nacięcia w obrębie barków i wzdłuż klatki piersiowej.Następnie przetnij rdzeń kręgowy jak najniżej w odcinku ogonowym, aby oddzielić kręgosłup i żebra od dolnej części zwierzęcia. Obróć kręgosłup i usuń wnętrzności wciąż przyczepione do żeber. Przenieś kręgosłup do innej, mniejszej szalki Petriego wypełnionej silikonem.Dodaj zimny ACSF, napowietrzaj mieszanką carbogen i użyj czterech szpilek entomologicznych, aby przymocować tkankę stroną grzbietową do góry. Następnie wykonaj laminektomię strony grzbietowej, wprowadzając najpierw końcówkę cienkich nożyczek między kość a rdzeń kręgowy i przecinając kość od końca rostralnego, dbając o to, aby nie uszkodzić istoty białej. Wykonuj cięcia naprzemiennie po każdej stronie, używając pęsety do podtrzymywania odciętego już fragmentu kości.Następnie za pomocą małej pęsety unieś oponę twardą i przy użyciu małych nożyczek przetnij ją wzdłuż dostępu rostralno-kaudalnego po obu stronach. Usunięcie opony twardej jest krytycznym etapem. Warto poświęcić kilka dodatkowych minut, aby wykonać tę czynność dokładnie.Po usunięciu opony twardej należy użyć tępego szklanego narzędzia, aby delikatnie przesunąć rdzeń w stronę lewej strony rowka utworzonego przez połowiczne przecięcie kolumny kręgosłupa. Następnie należy przeciąć korzenie brzuszne i grzbietowe po stronie jasnej w jak największej odległości od miejsca ich wnikania do rdzenia. Operację należy powtórzyć po stronie lewej, zawsze kierując się od strony rostralnej do caudalnej.Po sekcji wysuń rdzeń kręgowy z kanału kręgowego. Następnie za pomocą małej szpilki entomologicznej przymocuj rdzeń powierzchnią grzbietową do góry. Delikatnie usuń wszelkie fragmenty przyczepionej błony.Po oczyszczeniu przytnij oba końce rdzenia i wprowadź zagiętą szpilkę entomologiczną do przedniej części rdzenia, aby zaznaczyć jego orientację. Następnie przenieś rdzeń kręgowy do lodowatego roztworu wewnątrzkomórkowego. W kolejnym kroku schłodź wcześniej przygotowaną roztopioną agar na mieszaninie lodu i wody.Mieszać agar, mierząc jego temperaturę. Gdy temperatura agaru osiągnie 38 °C, chwycić rdzeń kręgowy za szpilkę entomologiczną i zanurzyć go w agarze stroną rostralną w dół. Należy upewnić się, że rdzeń kręgowy jest jak najprostszy, znajduje się w odległości od ścianek naczynia, a jego część kaudalna jest lekko skierowana w górę.Pozostaw zlewkę w mieszaninie lodu i wody, aby agar mógł zastygnąć wokół rdzenia tak szybko, jak to możliwe. Po zastygnięciu odetnij blok agaru zawierający rdzeń kręgowy w taki sposób, aby podstawa bloku znajdowała się pod kątem 35 stopni względem odcinka lędźwiowego rdzenia. Powierzchnia grzbietowa powinna być skierowana w stronę przeciwną do podstawy.Przyklej blok do komory mikrotomu wibracyjnego, używając kleju cyjanoakrylowego. Prawidłowe zamocowanie bloku jest kluczowe dla zachowania ciągłości pul motorowych z korzeniami brzusznymi, z których wychodzą. Zanurz blok w roztworze gluconianu potasu.Ustaw parametry wibrotomu. Następnie wykonaj przekroje o grubości 350–400 µm z obszaru lędźwiowego, który można rozpoznać po jego zakrzywieniu i większej średnicy. Przenieś odpowiednie przekroje do ACSF w temperaturze 34 °C.Zazwyczaj uzyskuje się od czterech do pięciu odpowiednich przekrojów z korzeniami brzusznymi o długości 2 mm lub więcej. Po około 30 minutach w temperaturze 34 °C schłodzić przekroje do temperatury pokojowej, a następnie rozpocząć sesję rejestracji. Należy wcześniej przygotować zestaw różnych pipet z końcówkami o średnicach od 40 do 170 µm.Aby przygotować pipety sekcyjne, należy wybrać pipety z długim zakończeniem. Następnie, używając noża diamentowego, należy wykonać nacięcia w różnych miejscach, a następnie pod mikroskopem dissectingowym przełamać każdą pipetę, uderzając w końcówkę pęsetą. W kolejnym kroku należy wyjąć komorę z mikroskopu rejestrującego i umieścić ją pod mikroskopem dissectingowym.Wybierz skrawek zawierający korzeń brzuszny o długości wystarczającej do zamocowania go na elektrodzie stymulującej z przyssawką. Zamocuj skrawek, orientując go tak, aby korzenie brzuszne były skierowane do góry, następnie delikatnie wytnij agar wokół korzeni brzusznych, pozostawiając resztę agaru wokół skrawka, i umieść siatkę, aby przytrzymać próbkę. Zamontuj komorę z powrotem na mikroskopie i stale perfunduj komorę rejestracyjną płynem ACSF z prędkością od 1 do 2 ml/min w temperaturze pokojowej.Używając szklanej pipety wypełnionej ACSF i połączonej ze strzykawką, zasajsuguj jeden z korzeni brzusznych. Aby uzyskać skuteczną stymulację korzenia brzusznego, końcówka pipety musi ściśle przylegać do korzenia brzusznego. Wykonaj rejestrację metodą patch-clamp z wybranego typu komórek i zarejestruj efekt stymulacji korzenia brzusznego zgodnie z wcześniejszym opisem.Ten obraz przedstawia wyniki rejestracji metodą clampy napięciowej. Rejestracje na górnych panelach pochodzą z innych motoneuronów niż te na panelach dolnych. Górny panel pokazuje odpowiedź antidromiczną motoneuronu na stymulację jeden wolt w kolorze czerwonym oraz stymulację pięć woltów w kolorze czarnym.Dolny ślad przedstawia ortodromiczną odpowiedź potencjału czynnościowego na stymulację o napięciu 20 V (kolor czerwony) oraz 30 V (kolor czarny). Czarne kropki wskazują momenty podania bodźca. Podwójne groty strzałek podkreślają różnicę w latencjach między skokami ortodromicznymi a antydromicznymi.Tutaj przedstawiono rejestracje w trybie clamp prądowy. Górny panel pokazuje odpowiedź antydromiczną na stymulację 10-voltową i 15-voltową, odpowiednio na czerwono i na czarno. Dolny panel przedstawia odpowiedź ortodromiczną na stymulacje 25- i 40-voltowe, odpowiednio na czerwono i na czarno.Ponownie wskazano czas stymulacji oraz różnice w latencjach. Ten obraz puli komórek Renshawa został wykonany przy użyciu kondensora skośnego i obiektywu 20x. Należy zwrócić uwagę na aksony motoneuronów zlewające się w korzeń brzuszny, co pokazano za pomocą strzałki.Ten obraz tego samego obszaru został wykonany przy użyciu obiektywu 40x. Domniemane komórki Renshawa są zaznaczone grotami strzałek. Przedstawiono tutaj rejestrację metodą clampy napięciowej (voltage-clamp) z komórki Renshawa po stymulacji korzenia brzusznego, zaznaczonej czarną kropką.QX-314 w roztworze wewnątrzkomórkowym zapobiegał wyładowaniom komórki, a odpowiedzi na glicynę i GABA zostały zablokowane odpowiednio przez 3 µM gabazyny i 1 µM strychniny. Czerwony ślad jest średnią ze śladów szarych. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w 20 lub 30 minut.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymywaniu preparatu w zimnym medium przez cały czas. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania skośnych przekrojów rdzenia kręgowego odpowiednich do stymulacji korzeni brzusznych. Stymulacja korzeni brzusznych może być wykorzystana do łatwego potwierdzenia tożsamości motoneuralnej, a co ważniejsze, do niezawodnej stymulacji komórek brzusznych.

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy procedury przygotowania oraz rejestracji elektrofizjologicznej z plastrów mózgu, które zachowują oś grzbietowo-brzuszną przyśrodkowej kory entorynalnej (MEC). Ponieważ neuronalne kodowanie lokalizacji wykazuje organizację grzbietowo-brzuszną w obrębie MEC, procedury te ułatwiają badanie mechanizmów komórkowych istotnych dla nawigacji i pamięci.

Przygotowanie przekrojów parasagitalnych do badania organizacji grzbietowo-brzusznej przyśrodkowej kory entorynalnej gryzoni

Ten film opisuje wewnątrzkomórkowy zapis in vivo motoneuronów szczura pod wpływem przezrdzeniowej stymulacji prądem stałym. Protokół opisuje, w jaki sposób mierzyć właściwości błony i rejestrować rytmiczne odpalanie neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.

Transrdzeniowa stymulacja prądem stałym motoneuronu rdzeniowego szczura

Ten film demonstruje test oparty na matrycy mikroelektrod do badania aktywności sieci neuronalnej w odcinkach rdzenia kręgowego myszy. Najpierw rejestruje się aktywność elektrofizjologiczną z powierzchownego rogu grzbietowego (SDH) warstwy. Następnie wprowadza się inhibitor kanału potasowego w celu przedłużenia depolaryzacji, co skutkuje synchroniczną aktywnością rytmiczną w całej sieci neuronalnej.

Oparta na mikroelektrodach ocena sieci neuronalnych w wycinkach rdzenia kręgowego myszy

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Skuteczność domięśniowego wychwytu i wstecznego transportu cząsteczek do odpowiednich neuronów ruchowych zależy od lokalizacji miejsc wstrzyknięć w stosunku do płytek końcowych silnika (MEP). W tym miejscu opisujemy, jak zlokalizować MEP na mięśniach szkieletowych, aby zoptymalizować wsteczny transport znaczników do neuronów ruchowych.

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Ten protokół zarówno wizualnie komunikuje przygotowanie pnia mózgu i rdzenia kręgowego, jak i wyjaśnia przygotowanie przekrojów poprzecznych pnia mózgu w kompleksowy sposób krok po kroku. Został on zaprojektowany w celu zwiększenia odtwarzalności i zwiększenia prawdopodobieństwa uzyskania żywotnych, długotrwałych, rytmicznie aktywnych wycinków do rejestrowania wyjścia neuronalnego z obszarów oddechowych pnia mózgu.

Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

Ten protokół opisuje in vivo wewnątrzkomórkowy zapis neuronów lędźwiowych szczura z jednoczesną przezrdzeniową stymulacją prądem stałym. Metoda ta pozwala na pomiar właściwości błony i rejestrację rytmicznego odpalania neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.

Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo zidentyfikowanych typów neuronów rdzeniowych szczura podczas transrdzeniowej stymulacji prądem stałym

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

Poznaj metodę przygotowania skośnych wycinków rdzenia kręgowego myszy P2–P11 do stymulacji korzeni brzusznych. Technika umożliwia identyfikację motoneuronów i badanie komórek zależnych od kolateralnych aksonów motoneuronalnych w badaniach neurofizjologicznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Przeglądaj więcej filmów