Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Ogólnym celem tych testów opiekuńczych in vivo i in vitro jest scharakteryzowanie zależnej od pH aktywności chaperonu Escherichia coli HdeB w kwaśnych warunkach pH. Białka opiekuńcze aktywowane kwasem mają tylko jedno zadanie do wykonania, muszą chronić białka przed rozwijaniem i degradacją białek indukowaną kwasem. Funkcja ta jest szczególnie ważna w przypadku bakterii jelitowych, które muszą przetrwać w kwaśnym środowisku żołądka, jeśli chcą skutecznie skolonizować jelita.

Metody, które tutaj prezentujemy, pozwalają zidentyfikować i scharakteryzować białka opiekuńcze aktywowane kwasem, a także określić warunki pH, które prowadzą do ich aktywacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak scharakteryzować białka opiekuńcze, takie jak HdeB in vitro i in vivo, co pomoże Ci rozszyfrować mechanizm jego aktywacji. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane w przypadku innych kwasowych białek opiekuńczych, takich jak HDA, i mogą być dalej modyfikowane w celu pracy z innymi białkami opiekuńczymi i/lub warunkami stresu.

Monitorowany jest wpływ oczyszczonego HdeB na agregację rozwijającej się termicznie dehydrogenazy mitochondrialnej jabłczanu świń przy różnych wartościach pH. Dializowany MDH w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w stosunku do czterech litrów buforu C. Następnie zagęścić białko do około 100 mikromolów za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o granicy masy cząsteczkowej 30 kilodaltonów. Aby usunąć agregaty, odwiruj białko przez 20 minut w temperaturze 20 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Oznaczyć stężenie MDH przez absorbancję przy 280 nanomolach. Następnie przygotuj 50 mikrolitrów porcji MDH i błyskawicznie zamroź podwielokrotności do przechowywania. Umieść jednomililitrową kuwetę kwarcową w spektrofotometrze fluorescencyjnym wyposażonym w uchwyty na próbki i mieszadła o kontrolowanej temperaturze.

Ustaw długość fali wzbudzenia i wpuszczenia na 350 nanometrów. Dodać do kuwety odpowiednie objętości wstępnie podgrzanego buforu D o żądanych wartościach pH. Całkowita objętość wynosi 1 000 mikrolitrów.

Ustaw temperaturę w uchwycie kuwety na 43 stopnie Celsjusza. Dodać 12,5 mikromolowego HdeB do buforu, a następnie dodać 0,5 mikromolowego MDH. Rozpocznij monitorowanie rozpraszania światła.

Inkubować reakcję przez 360 sekund, aby umożliwić wystarczające rozwinięcie MDH. Podnieś pH do siedmiu, dodając od 0,16 do 0,34 objętości dwóch molowych niebuforowanych fosforanów dipotasowych i kontynuuj rejestrowanie rozpraszania światła przez kolejne 440 sekund. Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przekształć plazmid eksprymujący HdeB lub kontrolę wektora MD, PBAD 18, w szczep BB7224 Delta RPOH przy użyciu chemicznie kompetentnych komórek. Odmiana ta jest wrażliwa na temperaturę i musi być uprawiana w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po 45 sekundach szoku termicznego w temperaturze 42 stopni Celsjusza i przed posiewem inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min.

Wykonaj pojedynczą serię kolonii dodatnich klonów i wysiaduj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Przygotuj nocną hodowlę w 50 mililitrach LB z ampicyliną i hoduj komórki w temperaturze 200 obr./min i 30 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć w ciągu nocy 40-krotnie na 25 mililitrów LB za pomocą ampicyliny.

Hoduj bakterie w obecności 0,5% arabinozy w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min do gęstości optycznej przy 600 nanometrach lub OD 600 równej 1,0, aby indukować ekspresję białka HDEB. Do eksperymentów ze zmianą pH użyj LB z ampicyliną i arabinozą, aby rozcieńczyć komórki do OD 600 0,5. Dostosuj do odpowiednich wartości pH, dodając odpowiednie objętości pięciomolowego kwasu solnego.

Po upływie wskazanych punktów czasowych zneutralizować kultury poprzez dodanie odpowiednich objętości pięciu molowych wodorotlenków sodu. Monitoruj wzrost zneutralizowanych kultur i płynnych kultur przez 12 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, używając pomiarów OD. Aby zbadać optymalne pH aktywności białka opiekuńczego HdeB in vitro, natywny MDH rozcieńczono we wstępnie podgrzanym buforze o wskazanym pH w obecności lub braku HdeB.

Po 360 sekundach inkubacji, agregacja MDH w temperaturze 43 stopni Celsjusza została wyzwolona poprzez neutralizację. W obecności HdeB sygnał rozpraszania światła jest znacznie zmniejszony po neutralizacji z pH czwartego, co wskazuje, że HdeB zapobiega agregacji MDH. Pomiary agregacji są bardzo wrażliwe na zmiany temperatury lub zawartości buforu.

Aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie, zbadano wpływ bufora pamięci masowej białka opiekuńczego na agregację klientów. Bufor pamięci masowej HdeB nie miał wpływu na agregację MDH. Aby zbadać wpływ HdeB in vivo, przeprowadzono testy przeżycia zależne od pH przy użyciu wrażliwego na temperaturę szczepu delecyjnego RPOH.

Szczep ten nie ma większości białek opiekuńczych i dlatego jest bardziej podatny na podwyższoną temperaturę, niskie pH lub stres utleniony. Nadmierna ekspresja HdeB w warunkach neutralnego pH nie wykazała wpływu na tempo wzrostu szczepu, który rósł porównywalnie dobrze do szczepu kontrolnego, który zawiera pusty wektor, PBAD 18. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono wyraźne różnice w ich zdolności do wznowienia wzrostu po zabiegach o pH 3 lub 4, przy czym szczep z nadekspresją HdeB wykazywał odtwarzalnie lepszą regenerację po traktowaniu niskim pH w porównaniu ze szczepem kontrolnym.

Po opanowaniu oczyszczanie można przeprowadzić w ciągu trzech dni, test rozpraszania in vitro w ciągu jednego dnia, a test przeżycia in vivo w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. Wykonując te eksperymenty, upewnij się, że dokładnie przemyślałeś swój projekt eksperymentalny, zarówno w odniesieniu do rodzaju białek klienckich, ich stężeń, jak i warunków buforowych, których używasz. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga ona uzyskać bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmu aktywacji białka opiekuńczego i jej skutków w kontekście in vivo.

I nie zapominaj, że badanie optymalnego pH białka opiekuńczego chroniącego przed kwasami może być dość trudne. Dzieje się tak, ponieważ zachowanie agregacji białka klienta, którego używasz, prawdopodobnie zmieni się również wraz z pH. Dlatego upewnij się, że wybierasz systemy buforowe, które są odpowiednie zarówno dla białka opiekuńczego, jak i klienta.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak testy spin down za pomocą strony SCS, mogą być wykonywane w automatycznie określanym ilościowo tłumieniu agregacji klienta za pośrednictwem białka opiekuńczego.