Name: Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metody badania aktywności chaperonu HdeB zależnej od pH w warunkach kwaśnych przy użyciu Escherichia coli. Techniki in vitro i in vivo pozwalają zdefiniować mechanizmy ochrony białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Claudii Cremers za jej pomocne porady dotyczące testów opiekuńczych. Ken Wan jest ceniony za swoją pomoc techniczną w oczyszczaniu HdeB. Praca ta była wspierana przez Howard Hughes Medical Institute (do J.C.A.B.) oraz National Institutes of Health grant RO1 GM102829 dla J.C.A.B. i U.J.-U. D. jest stypendystą Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) w ramach stażu podoktorskiego.

1. Ekspresja i oczyszczanie peryplazmatycznego HdeB
UWAGA: HdeB ulegał ekspresji w komórkach E. coli zawierających plazmid pTrc-hdeB 10 i został oczyszczony z peryplazmy po lizie polimyksyny.
<ol>
	<li>Przygotować nocną hodowlę komórek E. coli zawierających plazmid pTrc-hdeB 10 w 30 ml LB zawierającym 200 μg/ml ampicyliny (LBAmp). Zaszczepić cztery 1 l kultur LBAmp i hodować je w temperaturze 37 °C i 200 obr./min, aż do osiągnięcia średnicy zewnętrznej 600 nm 0,7. Następnie dodać 300 μM IPTG, aby wywołać ekspresję HdeB i obniżyć temperaturę wzrostu do 30 °C.</li>
	<li>Po 5 godzinach ekspresji białka w temperaturze 30 °C, zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać osad komórkowy 100 ml buforu A (50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) i ponownie odwirować komórki przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 ml buforze A, zawierającym 1 mg/ml siarczanu polimyksyny. W celu skutecznego rozerwania błony zewnętrznej należy delikatnie mieszać zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W celu usunięcia frakcji cytoplazmatycznej i resztek komórkowych należy odwirowywać zawiesinę przez 20 minut w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C. W ten sposób powstaje ~60 ml supernatantu zawierającego rozpuszczalny HdeB.</li>
	<li>Supernatant zawierający ekstrakt peryplazmatyczny należy dializować przez noc w stosunku do 150-krotnej objętości buforu B (20 mM Tris/HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) za pomocą membrany dializacyjnej z odcięciem 6 kDa MW. Zagęścić białka do 15 ml za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o masie cząsteczkowej odcięcia 3 kDa. Przefiltrować roztwór białkowy za pomocą filtra porowego 0,2 μm.</li>
	<li>Umieścić białko na kolumnie chromatografii anionowymiennej (objętość kolumny 5 ml), która została zrównoważona z buforem B o objętości 5 objętości kolumny o natężeniu przepływu 2,5 ml/min. Po załadowaniu białka do kolumny należy przemywać ją buforem B przez 10 minut przy natężeniu przepływu 2,5 ml/min. Elute HdeB z gradientem liniowym od 0 do 0,5 M NaCl w buforze B przez okres 50 minut z natężeniem przepływu 2,5 ml/min 6.</li>
	<li>Zidentyfikuj frakcje zawierające HdeB za pomocą 15% SDS-PAGE. Wymieszać 20 μl próbki z 5 μl 5x zredukowanego bufora ładującego SDS. Załadować 10 μl na żel i uruchomić w buforze Tris-glicyna (14,4 g/L glicyny, 2,9 g/L Tris, 1 g/L dodecylosiarczanu sodu, pH 8,3). Uruchom żel pod napięciem 150 V, aż prążek bromofenolu przesunie się blisko dna żelu (~45 min).</li>
	<li>Zebrać wszystkie frakcje zawierające HdeB, dializować w temperaturze 4 °C przez noc w stosunku do 4 l bufora do przechowywania HdeB (50 mM Tris/HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) i zagęścić białko do około 300 μM za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o masie cząsteczkowej odcięcia 3 kDa. Określić stężenie HdeB przy 280 nm, korzystając ze współczynnika ekstynkcji ε280nm = 15,595 M-1 cm-1. Przygotować 100 μl podwielokrotności i błyskawicznie zamrozić podwielokrotności w ciekłym azocie. 
	UWAGA: HdeB można przechowywać w temperaturze -70 °C przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Test aktywności białka opiekuńczego przy użyciu termicznie rozwijającej się dehydrogenazy jabłczanowej (MDH)
UWAGA: Wpływ oczyszczonego HdeB na agregację rozwijającej się termicznie dehydrogenazy mitochondrialnej jabłczanu świń (MDH) przy różnych wartościach pH monitorowano w sposób opisany poniżej. Wszystkie podane stężenia białek odnoszą się do stężenia monomeru.
<ol>
	<li>Aby przygotować MDH, należy dializować MDH w temperaturze 4 °C przez noc w stosunku do 4 l buforu C (50 mM fosforanu potasu, 50 mM NaCl, pH 7,5) i zagęścić białko do około 100 μM za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o granicy masy cząsteczkowej 30 kDa. 
	UWAGA: Wymagana jest ostrożna dializa MDH, ponieważ MDH jest dostarczany w postaci roztworu siarczanu amonu.</li>
	<li>W celu usunięcia agregatów należy odwirować białko przez 20 minut w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Oznaczyć stężenie MDH przez absorbancję przy 280 nm (ε280 nm = 7,950 M-1 cm-1). Przygotować 50 μl podwielokrotności MDH i błyskawicznie zamrozić podwielokrotności do przechowywania.</li>
	<li>Umieścić kuwetę kwarcową o pojemności 1 ml w spektrofotometrze fluorescencyjnym wyposażonym w uchwyty na próbki i mieszadło o kontrolowanej temperaturze. Ustawić λex/em na 350 nm.</li>
	<li>Dodać odpowiednie objętości wstępnie podgrzanego (43 °C) buforu D (150 mM fosforanu potasu, 150 mM NaCl) o żądanych wartościach pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 i pH 5,0) do kuwety i ustawić temperaturę w uchwycie kuwety na 43 °C. Całkowita objętość wynosi 1 000 μl.</li>
	<li>Dodać 12,5 μM HdeB (lub alternatywnie taką samą objętość bufora pamięci HdeB dla kontroli buforu) do buforu, a następnie dodać 0,5 μM MDH. Rozpocznij monitorowanie rozpraszania światła. Inkubować reakcję przez 360 sekund, aby umożliwić wystarczające rozwinięcie MDH.</li>
	<li>Podnieś pH do 7, dodając 0,16-0,34 objętości 2 M niebuforowanego K2HPO4 i kontynuuj rejestrowanie rozpraszania światła przez kolejne 440 sekund.</li>
	<li>Ustaw zakres agregacji MDH, który jest rejestrowany pod nieobecność białka opiekuńczego w określonym punkcie czasowym po neutralizacji (tutaj po 500 sekundach, gdy zaobserwowano maksymalne rozproszenie światła MDH) na 100%. Normalizuj aktywność HdeB do sygnału rozpraszania światła MDH przy braku HdeB przy każdej wskazanej wartości pH.</li>
</ol>
3. Wykrywanie tworzenia się kompleksu HdeB-LDH za pomocą analitycznego ultrawirowania (aUC)
UWAGA: Eksperymenty z prędkością sedymentacji HdeB samodzielnie lub w kompleksie z termicznie rozwijającą się dehydrogenazą mleczanową (LDH) przeprowadzono przy użyciu ultrawirówki analitycznej.
<ol>
	<li>Aby przygotować LDH, należy dializować LDH w temperaturze 4 °C przez noc w 4 l buforu C (50 mM fosforanu potasu, 50 mM NaCl, pH 7,5) i zagęścić białko do około 200 μM za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o granicy masy cząsteczkowej 30 kDa. 
	UWAGA: Wymagana jest ostrożna dializa LDH, ponieważ LDH jest dostarczany w postaci roztworu siarczanu amonu.</li>
	<li>W celu usunięcia agregatów należy odwirowywać LDH przez 20 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Oznaczyć stężenie LDH przez absorbancję przy 280nm (ε 280 nm = 43,680 M-1 cm-1). Przygotować 50 μl podwielokrotności LDH i błyskawicznie zamrozić podwielokrotności do przechowywania.</li>
	<li>Inkubować 3 μM LDH w obecności i pod nieobecność 30 μM HdeB w buforze D (odpowiednio pH 4 i 7) przez 15 minut w temperaturze 41 °C. 
	UWAGA: Inkubacja LDH w wyższych temperaturach powoduje jego całkowitą agregację i nie można zaobserwować efektu opiekuńczego HdeB.</li>
	<li>Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Następnie załaduj próbki do komórek zawierających standardowe 2-kanałowe elementy centralne w kształcie sektora o długości ścieżki 1,2 cm. Załadować komórki do ultrawirówki i wyrównać temperaturę 22 °C przez co najmniej 1 godzinę przed sedymentacją.</li>
	<li>Wirować próbki w temperaturze 22 °C i 167 000 x g w odpowiednim wirniku przez 12 godzin i monitorować sedymentację białka w sposób ciągły przy długości fali 280 nm. Jak wykazano wcześniej, stosunek sygnału do szumu poprawia się, gdy mierzy się natężenie światła przepuszczanego w każdym kanale, a nie absorbancję. Poprawia to również jakość późniejszego dopasowywania danych.</li>
	<li>Przeprowadź analizę danych za pomocą SEDFIT (wersja 15.01b, grudzień 2015 r.), przy użyciu modelu ciągłej dystrybucji c(s) 17. Samouczek opisujący, jak korzystać z SEDFIT, można znaleźć w odnośniku 18.
	<ol>
		<li>Ustaw poziom ufności dla regularyzacji ME (maksymalnej entropii) na 0,7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz gęstość buforu oraz lepkość za pomocą SEDNTERP 19. Aby oszacować ilość zagregowanego białka klienta, porównaj całki osadzonego LDH o pH 4 z pH 7 jako odniesienie. 
	UWAGA: Integrację wykresów rozkładu sedymentacji można przeprowadzić bezpośrednio w SEDFIT. Alternatywne oprogramowanie do analizy danych dotyczących prędkości sedymentacji można znaleźć w niedawnym przeglądzie 20.</li>
</ol>
4. Monitorowanie inaktywacji i reaktywacji MDH w obecności HdeB
UWAGA: Wpływ oczyszczonego HdeB na ponowne fałdowanie MDH o nieuregulowanym pH określono poprzez monitorowanie aktywności MDH po neutralizacji.
<ol>
	<li>Inkubować 1 μM MDH w buforze D przy pożądanych wartościach pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 i pH 5,0) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy braku lub w obecności 25 μM HdeB. Następnie zmień temperaturę na 20°C na 10 min. 
	UWAGA: Nie zaobserwowano ponownego fałdowania MDH nawet w obecności HdeB, gdy MDH inkubowano w temperaturach wyższych niż 37 °C.</li>
	<li>Aby zainicjować ponowne fałdowanie MDH zdenaturowanego kwasem, należy zneutralizować próbki do pH 7 przez dodanie 0,13-0,42 objętości 0,5 M fosforanu sodu o pH 8,0.</li>
	<li>Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 20 °C oznaczyć aktywność MDH, monitorując spadek NADH przy 340 nm 9, 
	UWAGA: MDH katalizuje zależną od NADH redukcję szczawiooctanu do L-jabłczanu.
	<ol>
		<li>Zmieszać 50 μl reakcji inkubacji z 950 μl buforu do oznaczania (50 mM fosforanu sodu, pH 8,0, 1 mM szczawiooctanu i 150 μM NADH). 
		UWAGA: Końcowe stężenie MDH w buforze testowym powinno wynosić 44 nM.</li>
		<li>Monitorować zmianę absorbancji za pomocą spektrofotometru wyposażonego w blok regulacji temperatury Peltiera ustawiony na 20 °C.</li>
		<li>Należy podać aktywność MDH w stosunku do natywnego MDH 44 nM, który był utrzymywany na poziomie pH 7,0.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wpływ nadekspresji HdeB na przeżycie E. coli w warunkach stresu kwasowego
UWAGA: Genomowe DNA E. coli MG1655 wyizolowano przy użyciu opublikowanego protokołu 21.
<ol>
	<li>Amplifikuj hdeB z E. coli, MG1655 metodą PCR, używając starterów, hdeB-BamH,I-rev, GGT, GGT, GGA, TCC, TTA, ATT, CGG, CAA, GTC, ATT i hdeB-EcoR, I-fw, GGT, GCC, GAA, TTC, AGG, CGC, AAT, TCT, TC, C, C.</li>
	<li>Ustawić reakcję PCR w 50 μl w następujący sposób: 10 μl 5x bufor polimerazy, 200 μM dNTPs, 0,5 μM starter JUD2, 0,5 μM starter JUD5, 150 ng genomowe DNA MG1655, 0,5 μl polimerazy DNA, dodać ddH2O do 50 μl.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację hdeB w następujący sposób: Krok 1: 5 minut w 95 °C, 1 cykl; Krok 2: 30 sekund w 95 °C, 30 sekund w 55 °C, 30 sekund w 72 °C, 40 cykli; Krok 3: 10 min w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Sklonuj powstały fragment PCR do miejsc EcoRI i BamHI plazmidu pBAD18 przy użyciu standardowych metod klonowania miejsca ograniczenia. Oczyść plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Sprawdź otrzymany plazmid, sekwencjonując 10.</li>
	<li>Przekształć plazmid eksprymujący HdeB lub pustą kontrolę wektora pBAD18 w szczep BB7224 (ΔrpoH) (genotyp: F-, λ-, e14-, [araD139]B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(SmR) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(TcS) suhX401 deoC1 araD+ rpoH::kan+; 16) przy użyciu kompetentnych chemicznie ogniw. 
	UWAGA: Ta odmiana jest wrażliwa na temperaturę.</li>
	<li>Po 45 sekundach szoku termicznego w temperaturze 42 °C, a przed posiewem, inkubować komórki w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. Wykonać pojedyncze smugi kolonii dodatnich klonów i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. Przygotować hodowlę przez noc w 50 ml LBAmp i hodować komórki przy 200 obr./min i 30 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć kultury przez noc 40-krotnie w 25 ml LBAmp i hodować bakterie w obecności 0,5% arabinozy (Ara) w temperaturze 30 °C i 200 obr./min do średnicy zewnętrznej 600 nm = 1,0 w celu indukcji ekspresji białka HdeB.</li>
	<li>Do eksperymentów ze zmianą pH użyj LBAmp + Ara, aby rozcieńczyć komórki do średnicy zewnętrznej 600 nm 0,5 i dostosować do odpowiednich wartości pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0 i pH 4,0), dodając odpowiednie objętości 5 M HCl.</li>
	<li>Po przekroczeniu wskazanych punktów czasowych (pH 2,1 min; pH 3,5 min; pH 4,30 min) należy zneutralizować kultury przez dodanie odpowiednich objętości 5 M NaOH.</li>
	<li>Monitorować wzrost zneutralizowanych kultur w płynnych kulturach przez 12 godzin w temperaturze 30 °C za pomocą pomiarów średnicy zewnętrznej.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li>
<li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li>
<li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins%3A+barrels+in+a+nutshell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li>
<li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+out+of+Disorder%3A+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li>
<li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+disorder+in+chaperone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li>
<li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li>
<li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li>
<li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li>
<li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li>
<li>Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li>
<li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li>
<li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li>
<li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li>
<li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li>
<li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Molecular%2C+Modeling%2C+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li>
<li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li>
<li>Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm">http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm</a> (2016).</li>
<li>Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page">http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</a> (2012).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol%3AChloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li>
<li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+activation+by+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li>
<li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Express+Purif%22%5BJournal%5D)">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li>
<li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog%2C+Hsp40%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li>
<li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li>
<li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

W celu zbadania mechanizmu aktywacji i funkcji opiekuńczej HdeB, duże ilości HdeB muszą zostać wyrażone i oczyszczone. Dostępnych jest wiele systemów wektorów ekspresyjnych do produkcji wysokich poziomów białka docelowego, w tym wektory pTrc lub pBAD, które zostały wykorzystane w tym badaniu. Promotory są łatwo dostępne dla polimerazy RNA E. coli , a tym samym umożliwiają silnie podwyższoną ekspresję HdeB w dowolnym szczepie E. coli . Ten aspekt jest szczególnie istotny w przypadku badania nadekspre...

Powszechnym naturalnym środowiskiem, w którym patogeny mikrobiologiczne doświadczają warunków rozwoju białek wywołanych kwasem, jest żołądek ssaków (zakres pH 1-4), którego kwaśne pH służy jako skuteczna bariera przed patogenami przenoszonymi przez żywność 1. Rozwijanie i agregacja białek, która jest spowodowana protonacją łańcucha bocznego aminokwasów, wpływa na procesy biologiczne, uszkadza struktury komórkowe i ostatecznie powoduje śmierć komórki 1,2. Ponieważ pH peryplazmy bakteryjnej niemal natychmiast równoważy się z pH środowiska dzięki swobodnej dyfuzji protonów przez porowatą błonę zewnętrzną, białka peryplazmatyczne i błony wewnętrznej bakterii Gram-ujemnych są najbardziej wrażliwymi składnikami komórkowymi w warunkach stresu kwasowego 3. Aby chronić swój proteom peryplazmatyczny przed szybkim uszkodzeniem za pośrednictwem kwasów, bakterie Gram-ujemne wykorzystują aktywowane kwasem peryplazmatyczne białka opiekuńcze HdeA i HdeB. HdeA jest warunkowo nieuporządkowanym przyzwoitkiem 4,5: Przy neutralnym pH HdeA występuje jako pofałdowany, nieaktywny dimer opiekuńczy. Po przesunięciu pH poniżej pH 3 funkcja opiekuńcza HdeA jest szybko aktywowana 6,7. Aktywacja HdeA wymaga głębokich zmian strukturalnych, w tym jego dysocjacji na monomery i częściowego rozwinięcia monomerów 6-8. Po aktywacji HdeA wiąże się z białkami, które rozwijają się w kwaśnych warunkach. Skutecznie zapobiega ich agregacji zarówno podczas inkubacji przy niskim pH, jak i przy neutralizacji pH. Po powrocie do pH 7,0 HdeA ułatwia ponowne fałdowanie białek klienta w sposób niezależny od ATP i przekształca się z powrotem w swoją dimeryczną, nieaktywną konformację opiekuńczo-opiekuńczą 9. Podobnie, homologiczny chaperon HdeB jest również nieaktywny opiekuńczo przy pH 7,0. Jednak w przeciwieństwie do HdeA, aktywność opiekuńcza HdeB osiąga pozorne maksimum przy pH 4,0, w warunkach, w których HdeB jest nadal w dużej mierze pofałdowany i dimeryczny 10. Co więcej, dalsze obniżanie pH powoduje inaktywację HdeB. Wyniki te sugerują, że pomimo ich rozległej homologii, HdeA i HdeB różnią się sposobem aktywacji funkcjonalnej, co pozwala im objąć szeroki zakres pH dzięki ochronnej funkcji opiekuńczej. Innym chaperonem, który jest zaangażowany w kwasoodporność E. coli, jest cytoplazmatyczny Hsp31, który wydaje się stabilizować niesfałdowane białka klienta do czasu przywrócenia neutralnych warunków. Dokładny sposób działania Hsp31 pozostał jednak enigmatyczny 12. Biorąc pod uwagę, że inne bakterie enteropatogenne, takie jak Salmonella, nie mają operonu hdeAB, jest bardzo prawdopodobne, że mogą istnieć inne, jeszcze niezidentyfikowane peryplazmatyczne białka opiekuńcze, które są zaangażowane w kwasoodporność tych bakterii 11.
Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na monitorowanie zależnej od pH aktywności opiekuńczej HdeB in vitro i in vivo 10 i mogą być stosowane do badania innych białek opiekuńczych, takich jak Hsp31. Alternatywnie, złożona sieć czynników transkrypcyjnych, które kontrolują ekspresję hdeAB, może być potencjalnie zbadana za pomocą testu stresu in vivo. Aby scharakteryzować funkcję opiekuńczą białek in vivo, można zastosować różne konfiguracje eksperymentalne. Jedną ze ścieżek jest zastosowanie warunków stresu związanego z rozwijaniem białek i fenotypowe scharakteryzowanie zmutowanych szczepów, które albo wykazują nadekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, albo zawierają delecję genu. Badania proteomiczne można przeprowadzić w celu określenia, które białka nie agregują się już w warunkach stresu, gdy obecny jest opiekun, lub można określić wpływ białka opiekuńczego na określony enzym w warunkach stresu za pomocą testów enzymatycznych 14-16. W tym badaniu zdecydowaliśmy się na nadekspresję HdeB w szczepie delecyjnym rpoH, który nie ma czynnika sigma szoku cieplnego 32. RpoH kontroluje ekspresję wszystkich głównych białek opiekuńczych E. coli, a jego delecja zwiększa wrażliwość na warunki stresu środowiskowego, które powodują rozwijanie się białek 15. Aktywność opiekuńczą HdeB in vivo określono poprzez monitorowanie jego zdolności do tłumienia wrażliwości pH szczepu ΔrpoH. Podsumowując, przedstawione tutaj protokoły zapewniają szybkie i proste podejście do scharakteryzowania aktywności białka opiekuńczego aktywowanego kwasem in vitro, a także w kontekście in vivo.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta E. komórki coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Mieszanka bulionowa, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan polimyksyny B&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0,2 &mikro; m sterylny filtr strzykawkowy</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>dehydrogenaza jabłczanowa (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu (monozasadowy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potas fosforan (dwuzasadowy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 spektrofotometr fluorescencyjny</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Szczawiooctan</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka analityczna Beckman Proteome Lab XL-I</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render& wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr><tr><td>Element centralny, 12 mm, Epon Węglowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, analityczny, 8-miejscowy</td><td>zestaw Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>używany do oczyszczania plazmidu (Protokół 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinoza</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta fluorescencyjna</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP zestaw</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml</td> Wirówka do <td>UFC900324</td><td></td><td>miliporowej</td> 3K NMWL</tr><tr><td>Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr Varian Cary 50</td> Membrana dializowa <td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Filtry odśrodkowe Amicon 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-dołkowy termocykler</td><td>Thermo Fisher 4375786</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie zależnej od ph aktywności escherichia coli chaperone hdeb in vitro i in vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bakterie są często narażone na zmiany środowiskowe, takie jak zmiany pH, temperatury, statusu redoks, ekspozycji na światło lub siły mechanicznej. Wiele z tych schorzeń powoduje rozwój białek w komórce i ma szkodliwy wpływ na przetrwanie organizmu. Wykazano, że grupa niepowiązanych, specyficznych dla stresu molekularnych białek opiekuńczych odgrywa istotną rolę w przetrwaniu tych warunków stresowych. Podczas gdy białka te są w pełni sfałdowane i nieaktywne opiekuńczo przed stresem, szybko się rozwijają i stają się aktywne opiekuńczo w określonych warunkach stresu. Po aktywacji, te warunkowo nieuporządkowane białka opiekuńcze wiążą się z dużą liczbą różnych białek podatnych na agregację, zapobiegają ich agregacji i bezpośrednio lub pośrednio ułatwiają ponowne fałdowanie białek po powrocie do warunków niestresowych. Podstawowym podejściem do uzyskania bardziej szczegółowego zrozumienia mechanizmu ich aktywacji i rozpoznawania przez klienta jest oczyszczanie, a następnie charakteryzacja tych białek za pomocą testów opiekuńczych in vitro. Kontrolne testy stresu in vivo są absolutnie niezbędne do niezależnego potwierdzenia uzyskanych wyników in vitro.
Ten protokół opisuje metody in vitro i in vivo do charakteryzowania aktywności opiekuńczej E. coli HdeB, białka opiekuńczego aktywowanego kwasem. Pomiary rozpraszania światła wykorzystano jako wygodny odczyt zdolności HdeB do zapobiegania indukowanej kwasem agregacji uznanego modelowego białka klienckiego, MDH, in vitro. Analityczne eksperymenty ultrawirowania zostały zastosowane w celu ujawnienia złożonego tworzenia się między HdeB a jego białkiem klienckim LDH, aby rzucić światło na los białek klienta po ich powrocie do warunków bezstresowych. Przeprowadzono testy aktywności enzymatycznej białek klienta w celu monitorowania wpływu HdeB na inaktywację i reaktywację klienta wywołaną pH. Wreszcie, badania dotyczące przeżycia wykorzystano do monitorowania wpływu funkcji opiekuńczej HdeB in vivo.

HdeA i HdeB są homologicznymi białkami E. coli, o których wiadomo, że chronią białka periplazmatyczne przed warunkami stresu kwasowego 10. Nasze prace wykazały, że podobnie jak HdeA, HdeB również pełni funkcję aktywowanego kwasem chaperonu molekularnego. Jednak w przeciwieństwie do HdeA, HdeB działa przy pH, które jest wciąż potencjalnie bakteriobójcze, ale znacznie wyższe niż pH optymalne dla HdeA 6,9,10,22. Aby zbadać pH optymalne dla aktywności chaperonow...

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Ogólnym celem tych testów chaperonowych in vivo i in vitro jest charakterystyka aktywności zależnej od pH chaperonu HdeB z Escherichia coli w warunkach niskiego pH. Chaperony aktywowane kwasem mają tylko jedno zadanie: muszą chronić białka przed indukowanym kwasem rozfałdowaniem i degradacją białek. Funkcja ta jest szczególnie istotna dla bakterii jelitowych, które muszą przetrwać kwaśne środowisko żołądka, aby móc skutecznie kolonizować jelita.Metody, które tutaj prezentujemy, pozwalają na identyfikację i charakterystykę chaperonów aktywowanych kwasem oraz określenie warunków pH prowadzących do ich aktywacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak charakteryzować chaperony, takie jak HdeB in vitro oraz in vivo, co pomaga w rozszyfrowaniu mechanizmu ich aktywacji. Metody te zostały z sukcesem zastosowane w przypadku innych chaperonów chroniących przed kwasem, takich jak HDA, i mogą być dalej modyfikowane w celu pracy z innymi chaperonami i/lub warunkami stresowymi.Monitorowany jest wpływ oczyszczonego białka HdeB na agregację termicznie rozfałdowującej się mitochondrialnej dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) z krwi świni przy różnych wartościach pH. Próbkę MDH dializowano przez noc w temperaturze 4 °C przeciwko 4 L buforu C. Następnie białko skoncentrowano do stężenia około 100 µM, używając wirówkowych jednostek filtrujących z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 30 kDa. W celu usunięcia agregatów, białko wirowano przez 20 minut przy 20 000 ×g w temperaturze 4 °C.Wyznacz stężenie MDH poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm. Następnie przygotuj aliquoty MDH o objętości 50 µL i zamroź je gwałtownie w celu przechowywania. Umieść kuwetę kwarcową o objętości 1 mL w spektrofotometrze fluorescencyjnym wyposażonym w mieszadła oraz uchwyty na próbki z kontrolą temperatury.Ustaw długość fali wzbudzenia i emisji na 350 nanometrów. Do kuwety dodaj odpowiednie objętości uprzednio ogrzanego buforu D o pożądanych wartościach pH. Objętość całkowita wynosi 1 000 mikrolitrów.Ustaw temperaturę w uchwycie na kuwetę na 43 °C. Do buforu dodaj 12,5 µM HdeB, a następnie dodaj 0,5 µM MDH. Rozpocznij monitorowanie rozpraszania światła.Inkubować reakcję przez 360 sekund, aby umożliwić wystarczające rozfałdowanie MDH. Podnieść pH do poziomu siedmiu, dodając od 0,16 do 0,34 objętości dwumolowego niebuforowanego fosforanu dipotasu, a następnie kontynuować pomiar rozpraszania światła przez kolejne 440 sekund. Przeanalizować dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przetransformuj plazmid wykazujący ekspresję HdeB lub wektor kontrolny MD, PBAD 18, do szczepu BB7224 Delta RPOH, wykorzystując komórki kompetentne chemicznie. Szczep ten jest wrażliwy na temperaturę i musi być hodowany w 30 °C. Po 45 sekundach szoku termicznego w 42 °C i przed wysianiem na płytki, inkubuj komórki w 30 °C przy 200 RPM.Wykonaj posiewy pojedynczych kolonii dodatnich klonów i inkubuj je przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Przygotuj kulturę nocną w 50 mililitrach LB z ampicyliną i hoduj komórki przy 200 RPM i w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Rozcieńcz kultury nocne 40-krotnie w 25 mililitrach LB z ampicyliną.Hoduj bakterie w obecności 0,5% arabinozy w temperaturze 30 °C przy 200 RPM do gęstości optycznej przy 600 nanometrach, czyli OD 600 równej 1,0, aby zindukować ekspresję białka HDEB. W eksperymentach z przesunięciem pH użyj pożywki LB z ampicyliną i arabinozą, aby rozcieńczyć komórki do OD 600 wynoszącej 0,5. Dostosuj wartości pH do odpowiednich poziomów poprzez dodanie właściwych objętości pięciomolarnego kwasu solnego.Po wskazanych punktach czasowych zneutralizuj kultury poprzez dodanie odpowiednich objętości pięciomolarnego wodorotlenku sodu. Monitoruj wzrost zneutralizowanych kultur oraz kultury płynnej przez 12 godzin w temperaturze 30°C, stosując pomiary OD. Aby zbadać optymalne pH aktywności chaperonowej HdeB in vitro, natywną MDH rozcieńczono w uprzednio ogrzanym buforze o wskazanym pH w obecności lub braku HdeB.Po 360 sekundach inkubacji, poprzez neutralizację, wywołano agregację MDH w temperaturze 43 stopni Celsjusza. W obecności HdeB sygnał rozpraszania światła po neutralizacji z pH cztery ulega znacznemu zmniejszeniu, co wskazuje, że HdeB zapobiega agregacji MDH. Pomiary agregacji są bardzo wrażliwe na zmiany temperatury lub składu buforu.Aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie, zbadano wpływ buforu do przechowywania chaperonów na agregację klienta. Bufor do przechowywania HdeB nie miał wpływu na agregację MDH. W celu zbadania efektów działania HdeB in vivo przeprowadzono testy przeżywalności zależne od pH z wykorzystaniem temperaturoczułego szczepu z delecją RPOH.Szczep ten jest pozbawiony większości chaperonów, przez co jest bardziej podatny na podwyższoną temperaturę, niskie pH lub stres oksydacyjny. Nadekspresja HdeB w warunkach neutralnego pH nie wpłynęła na szybkość wzrostu szczepu, który rósł porównywalnie dobrze jak szczep kontrolny zawierający pusty wektor, PBAD 18. Z kolei wyraźne różnice odnotowano w zdolności do wznowienia wzrostu po traktowaniu pH 3 lub pH 4, przy czym szczep z nadekspresją HdeB wykazywał powtarzalnie lepszą regenerację po traktowaniu niskim pH w porównaniu ze szczepem kontrolnym.Po opanowaniu metody, oczyszczanie można przeprowadzić w ciągu trzech dni, test rozpraszania in vitro w jeden dzień, a testy przeżycia in vivo w dwa dni, pod warunkiem ich prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tych eksperymentów należy starannie zaplanować układ doświadczalny, biorąc pod uwagę rodzaj białek klienckich, ich stężenia oraz zastosowane warunki buforowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona uzyskać bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmu aktywacji chaperonów oraz ich efektów w kontekście in vivo.Należy również pamiętać, że badanie pH optymalnego dla kaperony ochronnej przed kwasami może być dość wymagające. Wynika to z faktu, że właściwości agregacyjne białka klienckiego, którego używamy, prawdopodobnie również będą zmieniać się wraz z pH. W związku z tym należy upewnić się, że wybrane układy buforowe są odpowiednie zarówno dla kaperony, jak i dla białka klienckiego.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy wirowania z wykorzystaniem elektroforezy SCS-PAGE, w celu automatycznej kwantyfikacji supresji agregacji klienta zapośredniczonej przez białka opiekuńcze.

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Źródło: Dahl, J. i in. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje test oparty na spektrofotometrze fluorescencyjnym, który pozwala ocenić aktywność chaperonów na białku substratu pod wpływem stresu kwasowego i cieplnego. Opisuje on kroki monitorowania rozwijającego się i agregującego się podłoża poprzez rozpraszanie światła, porównując warunki z i bez chaperone.

Ocena aktywności bakteryjnego chaperonów poprzez termiczne rozwijanie białka modelowego

Źródło: Dahl, J. i inni. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje stosowanie rekombinowanych hodowli E. coli do oceny ochronnego efektu kwasowo aktywowanego chaperonu podczas stresu kwasowego. Monitorowanie wzrostu bakterii wykazuje zwiększoną przeżywalność w hodowlach ekspresujących chaperony w porównaniu z grupami kontrolnymi, podkreślając rolę chaperonów w stabilizacji białek w warunkach stresu.

Ocena ochrony roli chaperonu aktywowanego kwasem w E. coli pod wpływem stresu kwasowego

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Ten protokół opisuje zestaw metod, które obejmują analityczną chromatografię wykluczającą wielkość do badania oligomeryzacji i stabilności histonów opiekuńczych, test pull-down do rozwikłania interakcji chaperon-histon histon, AUC do analizy stechiometrii kompleksów białkowych oraz test opiekuńczy histonów do funkcjonalnego scharakteryzowania domniemanego chaperonu histonów in vitro.

In vitro Charakterystyka białek opiekuńczych histonów za pomocą testów analitycznych, pull-down i chaperoningowych

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Poznaj metody badania aktywności chaperonu HdeB zależnej od pH w warunkach kwaśnych przy użyciu Escherichia coli. Techniki in vitro i in vivo pozwalają zdefiniować mechanizmy ochrony białek.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Przeglądaj więcej filmów