Ekstrakcja strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych z tlenowego osadu granulowanego

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przedstawienie metodologii ekstrakcji w celu pozyskania strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS) z biopianek, a konkretnie z tlenowego osadu granulowanego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie osadów granulowanych, takie jak zrozumienie procesu granulacji oraz analiza składu EPS.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego przetestowania obecności polimerów tworzących żel w EPS. Wirować osad granulowany przy 4 000 ×g i temperaturze 4°C przez 20 minut, a następnie zdekantować supernatant. Zebrać granulki z osadu w celu przeprowadzenia ekstrakcji.

Podgrzej 150 ml wody z kranu w zlewce szklanej o pojemności 1 000 ml na mieszadle magnetycznym do 80 °C. Przenieś trzy gramy granulatu do kolby z przegrodami o pojemności 250 ml i dopełnij kolbę wodą zdemineralizowaną do objętości 50 ml. Dodaj do kolby 0,67 g dziesięciowodnianu węglanu sodu, aby uzyskać stężenie węglanu sodu 0,5% w/v.

Umieść kolbę zawierającą mieszaninę w łaźni wodnej. Przykryj osobno kolbę oraz zlewka folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu. Mieszaj mieszaninę przez 35 minut przy 400 RPM i 80 °C.

Przenieś mieszaninę do probówki do wirowania o pojemności 50 ml. Wirowarkę z probówką zawierającą mieszaninę ustaw na 4 000 ×g i 4 °C na 20 minut. Zbierz nadsącz, a osad odrzuć.

Krok dializy w celu otrzymania strukturalnych EPS z tlenowego osadu granularnego jest opcjonalny. Ma on jednak kilka zalet, które opisano w protokole. Przenieś nadsącz pipetą do worka do dializy o progu odcięcia masy cząsteczkowej 3 500 daltonów i prowadź dializę przez 24 godziny przeciwko 1000ml ultra-czystej wody.

Wymień wodę do dializy po 12 godzinach, aby zwiększyć efektywność procesu. Przenieś dializowany ekstrakt do szklanego zlewki o pojemności 250ml i powoli mieszaj ekstrakt przy 100 rpm w temperaturze pokojowej. Stale monitoruj zmiany pH za pomocą elektrody pH, dodając 1 molarny kwas solny aż do osiągnięcia końcowego pH 2,2 05, aby uzyskać albuminę w formie kwasowej.

Po dostosowaniu pH do poziomu 2.2, przenieś ekstrakt do probówki do wirowania o pojemności 50ml i wiruj przy 4000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius przez dwadzieścia minut. Odlej nadsącz i zbierz żelowaty osad. Żelowaty osad stanowi ale w formie kwasowej.

Aby otrzymać formę sodową alginianu, powoli dodaj 0,5 molarnego wodorotlenku sodu do żelu, powoli mieszając go ręcznie szklaną bagietką, aż do osiągnięcia pH 8,5. Za pomocą pipety Pasteura powoli wprowadzaj ekstrakt sodowy alginianu w formie kropel do roztworu chlorku wapnia. Jeśli wyekstrahowane EPS wykazują właściwości żelujące jonowego hydrożelu, utworzą się kuleczki o kształcie kropli.

Alternatywnie, jeśli wyekstrahowany EPS nie posiada właściwości tworzenia jonowego hydrożelu, ekstrakt rozproszy się w roztworze chlorku wapnia. Pozostaw kulek hydrożelowych w roztworze chlorku wapnia przez 30 minut. Za pomocą łyżki wyjmij kulki hydrożelowe z roztworu chlorku wapnia i przenieś je do roztworu EDTA.

Przechowywać kule hydrożelowe w 10ml roztworu EDTA przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Test ten stanowi przykład testów stabilności opisanych w protokole. Należy monitorować, czy podczas przechowywania następuje widoczna dezintegracja kulek, aby ocenić, czy kule że są w stanie wytrzymać te warunki.

Jeśli ekstrakcja przebiegła pomyślnie, tlenowy osad granulowany ulegnie rozpuszczeniu po etapie ekstrakcji alkalicznej, a po zakwaszeniu i odwirowaniu ekstraktu EPS powstanie pellet. Jeśli wyekstrahowane EPS są EPS strukturalnymi i posiadają zdolność do tworzenia hydrożeli w obecności jonów wapnia, podczas wkraplania ekstraktu EPS do roztworu wapnia powstaną żelowe kuleczki. Jeśli wyekstrahowane zostaną EPS pozbawione tej zdolności do żelowania, roztwór EPS rozproszy się w roztworze wapnia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś potrafić przeprowadzić ekstrakcję strukturalnych EPS z tlenowego osadu granulowanego. Powinieneś być również w stanie przetestować zdolność żelowania otrzymanych EPS w obecności jonów wapnia. Wybraliśmy tę metodologię ekstrakcji, aby zilustrować wpływ techniki ekstrakcji na charakterystykę EPS otrzymanych z tlenowego osadu granulowanego.

Poza tym chcieliśmy wykazać, że żadna technika ekstrakcji EPS nie jest uniwersalnie stosowalna.