Ekstrakcja strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych z tlenowego osadu granulowanego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pokazanie metodologii ekstrakcji w celu uzyskania strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych lub EPS z biopianek, w szczególności z tlenowego osadu granulowanego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie osadów granulowanych. Takich jak zrozumienie procesu granulacji i analiza składu EPS.

Główną zaletą tej techniki jest to, że obecność polimerów żelpianotwórczych w EPS można przetestować w krótkim czasie. Odwirować granulowany osad w temperaturze 4 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut i zdekantować supernatant. Zbierz granulki w granulkach do ekstrakcji.

Podgrzej 150 mililitrów wody z kranu w szklanej zlewce o pojemności 1 000 mililitrów na mieszadle magnetycznym do 80 stopni Celsjusza. Przenieść trzy gramy granulek do 250-mililitrowej kolby z przegrodą i napełnić kolbę do 50 mililitrów wodą demineralizowaną. Dodać 0,67 g dekahydratu węglanu sodu do kolby, aby uzyskać stężenie węglanu sodu na poziomie 0,5% wagowo.

Umieścić kolbę zawierającą mieszaninę w łaźni wodnej. Przykryć kolbę i szklankę zlewki oddzielnie folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu. Mieszaj mieszaninę przez 35 minut przy 400 obr./min i 80 stopniach Celsjusza.

Przenieś mieszaninę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować probówkę zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.

Etap dializy jest opcjonalny w celu uzyskania strukturalnego EPS z tlenowego osadu granulowanego. Ma jednak kilka zalet, które są opisane w protokole. Odpipetować supernatant do worka dializacyjnego z odciętą masą cząsteczkową 3 500 daltonów i dializować przez 24 godziny w 1000 ml ultraczystej wody.

Zmień wodę do dializy po 12 godzinach, aby wzmocnić efekt dializy. Przenieś dializowany ekstrakt do szklanej zlewki o pojemności 250 ml i powoli mieszaj ekstrakcję z prędkością 100 obr./min i w temperaturze pokojowej. Stale monitorować zmiany pH za pomocą elektrody pH, dodając jednocześnie 1 molowy kwas solny do końcowego pH 2,2 05 w celu uzyskania piwa w postaci kwaśnej.

Po dostosowaniu pH do 2,2 przenieś ekstrakt do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwiruj w temperaturze 4000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez dwadzieścia minut. Odrzucić sklarowany osad i zebrać żelopodobny osad. Żelowaty granulat to piwo w postaci kwaśnej.

Aby uzyskać formę sodową piwa, powoli dodawaj 0,5 molowego wodorotlenku sodu do żelu, powoli mieszając żel szklanym patyczkiem ręcznie, aż do osiągnięcia pH 8,5. Za pomocą pipety Pasteura powoli wlej ekstrakt z piwa sodowego do roztworu chlorku wapnia. Jeśli wyekstrahowany EPS ma właściwości jonowo-hydrożelowo-żelowe, utworzą się perełki w kształcie kropli.

Alternatywnie, jeśli wyekstrahowany EPS nie ma właściwości jonowo-hydrożelowych tworzących żel, ekstrakt rozproszy się w roztworze chlorku wapnia. Przechowuj kulki hydrożelowe i roztwór chlorku wapnia przez 30 minut. Za pomocą łyżki wyjmij kulki hydrożelowe z roztworu chlorku wapnia i przenieś je do roztworu EDTA.

Przechowuj kulki hydrożelowe w 10 ml roztworu EDTA przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza. Test ten przedstawia jeden z przykładów testów stabilności opisanych w protokole. Monitoruj, czy podczas tego przechowywania nie ma widocznego rozpadu koralików, aby ocenić, czy koraliki mogą wytrzymać te warunki.

Jeśli ekstrakcja zakończyła się sukcesem, tlenowy osad granulowany zostanie solubulizowany po etapie ekstrakcji alkalicznej, a po zakwaszeniu i odwirowaniu wyekstrahowanego EPS zostanie otrzymany granulek. Jeśli wyekstrahowany EPS jest EPS strukturalnym i ma zdolność tworzenia hydrożeli z jonami wapnia, podczas kapania wyekstrahowanego EPS w roztworze wapnia powstaną kulki żelowe. Jeśli EPS, który nie ma tej zdolności tworzenia żelu, zostanie wyekstrahowany, roztwór EPS rozproszy się w roztworze wapnia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić ekstrakcję strukturalnego EPS z tlenowego osadu granulowanego. Powinieneś również być w stanie przetestować zdolność do tworzenia żelu przez otrzymany EPS z jonami wapnia. Zdecydowaliśmy się pokazać tę metodologię ekstrakcji, aby zilustrować wpływ techniki ekstrakcji na otrzymany EPS z tlenowego osadu granulowanego.

Poza tym chcieliśmy pokazać, że żadna technika ekstrakcji EPS nie ma uniwersalnego zastosowania.