Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych

Ogólnym celem tej procedury jest sprawdzenie wpływu arkuszy komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w połączeniu ze sztuczną skórą na gojenie się ran w przypadku dużego ubytku skóry o pełnej grubości u szczura z cukrzycą. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące gojenia się ran przewlekłych, takich jak duża rana cukrzycowa z odsłoniętą kością. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są przeszczepiane do rany w litych arkuszach przy użyciu technologii arkuszy komórkowych, a rezultatem jest żywy, stabilny przeszczep.

Jako dawcę poduszeczki tłuszczowej zaplanuj użycie szczurów Lewisa w wieku od ośmiu do 33 tygodni. W miejscu operacji przygotuj kilka sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, gazy, skalpel, uchwyt na igły, nożyczki operacyjne, parę kleszczyków i szew nylonowy 5-0. W celu tymczasowego umieszczenia tkanki załaduj 100-mililitrową szalkę Petriego 10 mililitrami PBS.

Zważyć naczynie załadowane PBS, aby później określić masę pobranej tkanki. Po znieczuleniu szczura ułóż go na wznak na sterylnym serwecie. Następnie ogol obszar operacyjny i wyszoruj odsłoniętą skórę za pomocą kilku naprzemiennych peelingów z 70% etanolu.

Teraz wykonaj trzycentymetrowe nacięcie skóry w bocznej dolnej części brzucha. Następnie odsłoń i wypreparuj zewnętrzny mięsień skośny. Następnie należy odsłonić tkankę tłuszczową najądrza otaczającą najądrza.

Następnie ostrożnie wytnij tkankę tłuszczową najądrza. Unikaj uszkadzania najądrzy, jąder i naczyń krwionośnych najądrza. Przenieś tkankę do naczynia PBS.

Następnie zamknij szczura dawcę i postępuj zgodnie ze standardowymi praktykami opieki pooperacyjnej. Wyizoluj ASC od dwóch do trzech gramów pobranej tkanki tłuszczowej. Trawić tkankę przez godzinę w 0,1% kolagenazie typu A, aby uzyskać frakcję naczyniową zrębu lub SVF.

Po oczyszczeniu SVF zawiesić SVF w 20 mililitrach podłoża. Podziel zawiesinę na dwie szalki hodowlane o powierzchni 60 centymetrów kwadratowych i hoduj je przez 24 godziny w standardowych warunkach. Następnego dnia umyj płytki trzykrotnie PBS, aby usunąć wszelkie nieprzyczepione komórki i zanieczyszczenia.

Po ostatnim umyciu dodaj z powrotem świeże, kompletne podłoże. Następnie kontynuuj przechodzenie komórek, aż będą prawie zlewające się w trzecim dniu hodowli. Następnie przy użyciu jednego mililitra 0,25% trypsyny EDTA w krótkiej inkubacji.

Usuń komórki z płytki. Nie pozwól, aby komórki były wystawione na działanie aktywnej trypsyny dłużej niż 10 minut. Po obserwacji i policzeniu komórek, posadź je w subkulturze o gęstości 1 700 na centymetr kwadratowy.

Następnie przechodź przez komórki co trzy dni i wykonaj trzy przejścia przed kontynuowaniem. Po przejściu subkulturowanych szczurów ASC po raz trzeci, umieść 150 000 komórek na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 milimetrów i dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Hoduj naczynie przez trzy dni w inkubatorze, aby uzyskać jednolity arkusz komórek.

Trzy dni później zmień pożywkę i dodaj 16,4 mikrograma na mililitr AA. Następnie hoduj komórki, zmieniając pożywkę AA co drugi dzień. Po czterech lub pięciu dniach na pożywce zawierającej AA należy sprawdzić proliferację ASC. Poszukaj przerw między komórkami a ciągłym arkuszem komórek.

Po ustanowieniu ciągłego arkusza komórek można użyć komórek w modelu. W razie potrzeby zbierz arkusz komórek, umieszczając płytkę w temperaturze pokojowej na 15 do 20 minut. Ponieważ płytka jest wrażliwa na temperaturę, komórki spontanicznie odczepią się jako ciągły arkusz, a arkusz można usunąć za pomocą kleszczy.

Do modelu gojenia się ran po otyłości należy użyć dorosłych samców szczurów ZDF w wieku od 16 do 18 tygodni o wadze od 500 do 600 gramów. Ustaw i znieczul szczura na polu operacyjnym, a przed goleniem głowy wyczyść go przy użyciu 70% etanolu. Następnie ogol obszar operacyjny i oczyść odsłoniętą skórę naprzemiennymi peelingami z 70% etanolu.

Mniej więcej w tym czasie przenieś wrażliwą na temperaturę płytkę komórek macierzystych tłuszczu na ławkę. Zanim arkusz komórek oderwie się od płytki, należy usunąć pożywkę i trzykrotnie umyć arkusz ogniw PBS. Po zebraniu arkusza komórek namocz go w PBS, aż będzie potrzebny.

Gdy komórki będą gotowe, wykonaj ubytek skóry o wymiarach 15 na 10 milimetrów na głowie szczura. Najpierw usuń tkankę skórną aż do okostnej. Następnie wytnij skórę i tkankę skórną za pomocą skalpela i nożyczek chirurgicznych.

Aby uzupełnić wadę, usuń okostną za pomocą okostnej. Następnie umieść arkusz komórek na wadzie. Arkusz komórek macierzystych jest miękki i elastyczny.

Użyj kleszczy, aby przedłużyć go do każdego zakątka wady. Teraz przykryj arkusz komórek i ubytek plastrem sztucznej skóry o wymiarach 10 na 15 milimetrów nasączonym solą fizjologiczną tuż przed użyciem i zamknij ranę około 10 szwami za pomocą nylonowego szwu 5-0. Aby zabezpieczyć ranę, użyj nylonowego szwu 5-0, aby zabezpieczyć plaster nieprzywierającego opatrunku o wymiarach 15 na 20 milimetrów na sztucznej skórze.

Zaplanuj obserwację opatrunku co drugi dzień, ponieważ szczur niezmiennie go zdejmie, a w razie potrzeby natychmiast wymieni opatrunek. W dwóch grupach po sześć tłustych szczurów z cukrzycą Zuckera opisany protokół zastosowano w celu stworzenia wady czaszki. Szczury doświadczalne były leczone arkuszem komórek macierzystych tłuszczu szczura, a grupy kontrolne nie.

Po 14 dniach rany w grupie leczonej były znacznie mniejsze niż w grupie kontrolnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrobić dużą ranę z odsłoniętą kością u szczurów, a następnie leczyć tę ranę komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy stosować ścisłe zarządzanie temperaturą podczas całego procesu korzystania z naczyń hodowlanych reagujących na temperaturę.

W przeciwnym razie komórki mogą spontanicznie oderwać się od naczyń, opóźniając eksperymenty.