Name: Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj technikę tworzenia i przeszczepiania arkuszy komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej w modelu gojenia ran cukrzycowych u szczurów. Metoda ta poprawia leczenie przewlekłych ran z odsłoniętą kością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Yukiko Koga z Wydziału Chirurgii Plastycznej i Rekonstrukcyjnej Juntendo University School of Medicine za udzielenie praktycznych porad. Dziękujemy również panu Hidekazu Muracie z Centrum Diabetyków Szkoły Medycznej Kobiecego Uniwersytetu Medycznego w Tokio za doskonałe wsparcie techniczne. Badanie to było wspierane przez Program Tworzenia Centrów Innowacji dla Zaawansowanych Interdyscyplinarnych Obszarów Badawczych w ramach Projektu Rozwoju Systemów Innowacji "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii.

Wszystkie przedstawione poniżej protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Szkoły Medycznej Kobiecego Uniwersytetu Medycznego w Tokio i spełniały wszystkie wymagania Wytycznych dotyczących prawidłowego przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach.
1. Przygotowanie zwierząt, instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną przy użyciu minimalnej ilości niezbędnej pożywki alfa zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Użyj dorosłych samców szczurów ZDF jako modelu otyłości cukrzycowej typu 2. Użyj poduszeczki tłuszczowej samców szczurów Lewisa, aby wyizolować tkankę tłuszczową w celu przygotowania arkuszy komórkowych.</li>
</ol>
2. Izolacja i kultura rASC
<ol>
	<li>Uzyskaj tkankę tłuszczową od szczurów Lewisa (8 - 33 tygodnie, samiec) w znieczuleniu ogólnym za pomocą izofluranu.
	<ol>
		<li>Przygotuj respirator mechaniczny dla gryzoni i 4% izofluranu. Przygotuj kilka sterylnych bawełnianych końcówek, czyste gazy, skalpel, uchwyt na igłę, nożyczki operacyjne, parę kleszczy i nylonowy szew 5-0. Wysterylizuj narzędzia i materiały chirurgiczne.</li>
		<li>Przygotować 100-milimetrową szalkę Petriego z 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu tymczasowego zachowania uzyskanej tkanki tłuszczowej. Zważyć szalkę Petriego za pomocą PBS za pomocą wagi przed rozpoczęciem operacji w celu zmierzenia pobranej tkanki tłuszczowej. Rozłóż narzędzia chirurgiczne i przybory na sterylnej zasłonie.</li>
		<li>Znieczulenie szczurów za pomocą izofluranu w stężeniu 3-4% za pomocą respiratora mechanicznego dla gryzoni i utrzymanie szczurów na poziomie 2-3% izofluranu podczas operacji. Monitoruj głębokość znieczulenia, obserwując głębokość i tempo oddychania każdego szczura.</li>
		<li>Nosząc sterylne rękawiczki, ułóż szczura w pozycji leżącej na sterylnym serwowaniu. Ogol obszar operacyjny elektryczną maszynką do golenia i oczyść część brzuszną szczura za pomocą sterylnej gazy nasączonej 70% etanolem.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie skóry o długości około 5 cm za pomocą skalpela w bocznej dolnej części brzucha szczura. Odsłoń i wypreparuj zewnętrzny mięsień skośny. Następnie należy odsłonić tkankę tłuszczową najądrza otaczającą najądrza. Delikatnie wyciągnij tkankę tłuszczową najądrza. 
		UWAGA: Tkankę tłuszczową można uzyskać po obu stronach brzucha szczura.</li>
		<li>Wytnij tylko tkankę tłuszczową najądrza, unikając uszkodzenia najądrza, jądra i naczyń krwionośnych najądrza (ryc. S1). Namocz wyciętą tkankę tłuszczową w PBS na szalce Petriego, aby zapobiec wysuszeniu i zważyć tkankę.</li>
		<li>Zamknij mięsień brzucha za pomocą 5-0 VICRYL, a skórę za pomocą nylonowego szwu 5-0. Następnie umieść każdego szczura, który przeszedł operację, do oddzielnej klatki (jeden szczur na klatkę). 
		UWAGA: Monitoruj szczury, aż w pełni wyzdrowieją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj rASC z 2 - 3 g tkanki tłuszczowej (wyciętej od szczura Lewisa i przetworzonej zgodnie z wcześniej opisaną metodą)27. Krótko, enzymatycznie trawić wyciętą tkankę tłuszczową 0,1% kolagenazą typu A w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu uzyskania frakcji zrębowo-naczyniowej (SVF; Rysunek S2).
	<ol>
		<li>Przygotuj kilka sitek do komórek o średnicy 100 μm, kilka probówek o pojemności 50 ml, kilka probówek o pojemności 15 ml i dwa skalpele na czystej biologicznie ławce. Włączyć wirówkę i podgrzać łaźnię wodną do temperatury 37 °C. Ponadto należy przygotować około 50 ml sterylnego PBS w probówce o pojemności 50 ml z 0,1% (stężeniem końcowym) kolagenazy typu A.</li>
		<li>Tkankę tłuszczową zmielić na małe kawałki za pomocą dwóch skalpeli.</li>
		<li>Przenieś całą zmieloną tkankę tłuszczową do probówki o pojemności 50 ml i dodaj PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 15 ml.</li>
		<li>Odstaw probówkę o pojemności 50 ml w pozycji pionowej przez 5 minut. Wyrzuć górną warstwę i zbierz dolną warstwę z wyjątkiem zanieczyszczeń.</li>
		<li>Dodać 0,1% roztworu kolagenazy typu A do 50-mililitrowej probówki z PBS zawierającej górną warstwę w celu enzymatycznego trawienia tkanki tłuszczowej. 
		UWAGA: Podgrzej około 20 ml PBS na 2 - 3 g tkanki tłuszczowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przechylić i delikatnie wstrząsnąć probówką o pojemności 50 ml z prędkością 120 - 130 obr./min przez 1 godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odstaw probówkę o pojemności 50 ml w pozycji pionowej na 5 minut po wstrząśnięciu.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór za pomocą sitka o pojemności 100 μm i wlać roztwór do nowej probówki o pojemności 50 ml. Dozować przefiltrowany roztwór do dwóch probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować roztwór w probówkach o pojemności 15 ml przez 5 minut przy sile 700 x g. Ostrożnie usunąć górną warstwę supernatantu i pozostawić 5 ml dolnej warstwy roztworu. Nie zasysać osadu.</li>
		<li>Dodać około 5 ml kompletnej pożywki do każdej probówki o pojemności 15 ml, do 10 ml na probówkę o pojemności 15 ml i ostrożnie ponownie zawiesić osad.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.2.8 - 2.2.9. Następnie uzyskaj SVF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj dwie naczynia z kulturami o średnicy 60 cm2. Zebrać SVF po dwóch wirowaniach w ilości 700 × g przez 5 minut. Zawiesić SVF i umieścić 10 ml roztworu SVF na każdym 60-centymetrowymnaczyniu hodowlanym 2.</li>
	<li>Hodować naczynia przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
	<li>Przygotować PBS i 0,25% kwas tetraoctowy (EDTA) trypsyny-etylenodiaminy, które można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Po wstępnym posiewie (24 godziny) umyj komórki PBS 3 razy, aby usunąć nieprzyczepione komórki i zanieczyszczenia. Dodaj świeże, kompletne podłoże.</li>
	<li>Przejdź przez komórki, które są prawie zlewające się w 3 dniu. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 3 - 5 minut. 
	UWAGA: Zakończ etap trypsynizacji w ciągu 10 minut, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym po trypsynizacji, aby potwierdzić, że wszystkie komórki dokładnie oderwały się od naczyń. Następnie dodaj 9 ml kompletnej pożywki hodowlanej do szalek.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Subkulturuj komórki o gęstości 1,7 x 103 komórki/cm2 co 3 dni, aż do pasażu 3. Hodować subhodowlane komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze inkubatora o stężeniu 5%CO2</li>.
</ol>
3. Tworzenie arkuszy rASC
<ol>
	<li>Przygotuj kilka naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm reagujących na temperaturę. Wstępnie pokryć naczynia FBS (lub kompletną pożywką zawierającą FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez ponad 1 godzinę 
	UWAGA: Naczynie hodowlane reagujące na temperaturę o średnicy 35 mm jest produktem dostępnym na rynku.</li>
	<li>Przygotować płytkę termiczną i inkubować w temperaturze 37 °C w celu przeprowadzenia następujących procedur doświadczalnych. 
	UWAGA: Każdą procedurę należy wykonywać przy użyciu naczyń hodowlanych reagujących na temperaturę na płytce termicznej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec spontanicznemu odłączaniu się komórek od naczynia.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem eksperymentów ogrzać kompletną pożywkę hodowlaną użytą w procedurach do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Pasaż nasion: 3 rASC pochodzące od szczurów Lewisa na naczynie hodowlane o średnicy 35 mm reagującej na temperaturę o gęstości 1,5 x 105 komórek/szalkę przez 3 dni przy użyciu 2 ml całkowitej objętości kompletnej pożywki hodowlanej. 
		UWAGA: Po posianiu rASC na nowej szalce hodowlanej, naczynie należy powoli kołysać w przód iw tył oraz w lewo i w prawo w inkubatorze, aby uzyskać równomierny wysiew rASC i jednolicie gruby arkusz rASC.</li>
		<li>Zmienić 2 ml pożywki na 2 ml kompletnej pożywki zawierającej 16,4 μg/ml n-hydratu (AA) fosforanu kwasu L-askorbinowego i soli magnezu (AA) w 3. dniu po wysianiu na szalki hodowlane reagujące na temperaturę inkubowane na płytce termicznej o temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Rozpuszczony AA można przechowywać w temperaturze -30 °C przez wiele miesięcy.</li>
		<li>Hoduj komórki przez dodatkowe 4 - 5 dni i wymieniaj pożywkę co 2 dni na świeżą pożywkę zawierającą AA.</li>
		<li>Potwierdź proliferację i wytwarzanie ASC pod mikroskopem świetlnym, aby określić, czy wystąpiły przerwy między komórkami w ciągłym arkuszu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś arkusze komórek z inkubatora na stół na 15 - 20 minut, aby schłodzić je do temperatury pokojowej; obserwuj, jak komórki spontanicznie odrywają się jako ciągły arkusz komórek. Zbierz arkusz rASC z powierzchni naczynia za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Zazwyczaj arkusze rASC można obsługiwać za pomocą kleszczy. W razie potrzeby można użyć membrany transferowej do przeniesienia arkusza komórek z naczynia hodowlanego do miejsca rany, jeśli arkusz komórek jest kruchy i kruchy.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pełnogrubego modelu rany ubytku skóry i przeszczepienie arkuszy rASC
<ol>
	<li>Przygotuj respirator mechaniczny dla gryzoni i 4% izofluranu. Przygotuj kilka sterylnych bawełnianych końcówek, czystą gazę, nylonowy szew 5-0, skalpel, okostną raspatorium, uchwyt na igłę, nożyczki operacyjne i parę kleszczy. Wysterylizuj narzędzia i materiały chirurgiczne. Rozłóż narzędzia chirurgiczne i przybory na sterylnej zasłonie.</li>
	<li>Przygotuj PBS i utrzymuj go w temperaturze pokojowej, wraz ze sztuczną skórą i nieprzywierającym opatrunkiem. Wstępnie przyciąć sztuczną skórę (15 x 10 mm) i opatrunek nieprzywierający (20 × 15 mm). Namocz wewnętrzną warstwę gąbki kolagenowej sztucznej skóry w soli fizjologicznej przed użyciem sztucznej skóry. 
	UWAGA: Sztuczna skóra składa się z dwóch warstw: zewnętrznej warstwy arkusza silikonu i wewnętrznej gąbki kolagenowej.</li>
	<li>Użyj szczurów ZDF (16 - 18 tygodni, samce, 500 - 600 g) jako model gojenia się ran w cukrzycy typu 2 i otyłości.</li>
	<li>Znieczulić szczury ZDF poprzez wdychanie 4% izofluranu za pomocą respiratora mechanicznego gryzoni. Wywołać znieczulenie za pomocą izofluranu w dawce 4 - 5% za pomocą respiratora mechanicznego dla gryzoni i utrzymać je na poziomie 3 - 4% podczas operacji. Monitoruj głębokość znieczulenia, obserwując głębokość i szybkość oddychania każdego szczura za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.</li>
	<li>Nosząc sterylne rękawiczki, ułóż szczura w pozycji leżącej na sterylnym serwowaniu. Oczyść głowę szczura sterylną gazą nasączoną 70% etanolem, ogol obszar operacyjny elektryczną maszynką do golenia, a skórę po goleniu oczyść sterylną gazą nasączoną 70% etanolem.</li>
	<li>Stwórz kwadratową ubytek skóry o pełnej grubości (15 x 10 mm2) na głowie znieczulonych szczurów ZDF, usuwając tkankę skórną z naskórka do okostnej. Wyciąć skórę i tkankę skórną skalpelem i usunąć okostną za pomocą okostnej.</li>
	<li>Bezpośrednio przed przesadzeniem przenieść rASC na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm reagującej na temperaturę z inkubatora do środowiska o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obserwuj, jak rASC na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm reagującej na temperaturę samoistnie odrywają się jako arkusz od powierzchni szalki po utworzeniu się rany. Zbierz arkusze rASC po 7 dniach hodowli na szalkach hodowlanych reagujących na temperaturę. Usunąć pożywkę hodowlaną i trzykrotnie umyć arkusz rASC PBS. Namocz arkusz rASC w PBS do czasu przeszczepu, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Umieść arkusz rASC bezpośrednio nad wadą czaszki za pomocą kleszczy. Jeśli arkusz komórek jest kruchy i kruchy, membrana może być użyta jako rusztowanie do przenoszenia arkusza komórkowego z naczynia hodowlanego na miejsce rany.</li>
	<li>Przykryj arkusz rASC i ubytek sztuczną skórą (15 x 10 mm2) i zamknij ranę około 10 szwami za pomocą nylonowego szwu 5-0. Aby zabezpieczyć ranę, należy założyć nieprzylepny opatrunek (20 x 15 mm2) na sztuczną skórę, używając nylonowych szwów 5-0, aby utrzymać wilgotność rany i wchłonąć wysięk. 
	UWAGA: Opatrunki nieprzywierające zostaną usunięte przez szczury ZDF w ciągu kilku dni po aplikacji. Dlatego konieczne jest regularne monitorowanie szczurów po przeszczepie. Zazwyczaj opatrunek nieadhezyjny wymienia się co 2 dni w znieczuleniu ogólnym.</li>
	<li>Umieść każdego szczura, który przeszedł operację, do oddzielnej klatki, aż w pełni wyzdrowieją (jeden szczur na klatkę). Po okresie obserwacji szczury należy poddać eutanazji przy użyciu zatwierdzonej metody przedawkowania izofluranu.</li>
</ol>

<ol><li>International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetesatlas.org/">http://www.diabetesatlas.org/</a> (2015).</li>
<li>Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+diabetic+foot+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The global burden of diabetic foot disease.</a> Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).</li>
<li>Zannettino, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).</li>
<li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li>
<li>Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stromal+cells%3A+Their+identity+and+uses+in+clinical+trials%2C+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update.</a> World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Zuk, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuk%2C+P+%22The+ASC%3A+Critical+Participants+in+Paracrine-Mediated+Tissue+Health+and+Function%22">The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function</a>. , (2013).</li>
<li>Nie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+administered+adipose-derived+stem+cells+accelerate+wound+healing+through+differentiation+and+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis.</a> Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).</li>
<li>Shin, L., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cell+grafts+enhance+normal+and+impaired+wound+healing+by+recruiting+existing+endogenous+tissue+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).</li>
<li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly%28N-isopropylacrylamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide).</a> J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li>
<li>Yamato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+culture+dishes+allow+the+intact+harvest+of+multilayered+keratinocyte+sheets+without+dispase+by+reducing+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature.</a> Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+sheet+transplantation+improves+damaged+heart+function+via+superior+cell+survival+in+comparison+with+dissociated+cell+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).</li>
<li>Kuhlmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocellular+lipid+and+insulin+resistance%3A+a+longitudinal+in+vivo+1H-spectroscopic+study+in+Zucker+diabetic+fatty+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats.</a> Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).</li>
<li>Slavkovsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zucker+diabetic+fatty+rat%3A+a+new+model+of+impaired+cutaneous+wound+repair+with+type+II+diabetes+mellitus+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity.</a> Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).</li>
<li>Oltman, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+vascular+and+neural+dysfunction+in+sciatic+nerves+of+Zucker+diabetic+fatty+and+Zucker+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).</li>
<li>Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+endoneurial+blood+flow%2C+motor+nerve+conduction+velocity+and+vascular+relaxation+of+epineurial+arterioles+of+the+sciatic+nerve+in+ZDF-obese+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats.</a> Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).</li>
<li>Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+multi-layer+adipose-derived+stem+cell+sheet+in+a+full-thickness+wound+healing+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model.</a> Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).</li>
<li>McLaughlin, M. M., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+adipose-derived+stem+cells+as+sheets+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing.</a> Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).</li>
<li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+stem+cells+cell+sheet+constructs+impact+epidermal+morphogenesis+in+full-thickness+excisional+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li>
<li>Koga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+course+of+full-thickness+skin+defects+with+exposed+bone%3A+an+evaluation+by+a+quantitative+examination+of+new+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels.</a> J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).</li>
<li>Cianfarani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+impairs+adipose+tissue-derived+stem+cell+function+and+efficiency+in+promoting+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing.</a> Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).</li>
<li>Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-freeze+dried+bilayer+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Re-freeze dried bilayer artificial skin.</a> Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).</li>
<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).</li>
<li>Iwata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering+and+its+application+for+periodontal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering%3A+a+unique+nanotechnology+for+scaffold-free+tissue+reconstruction+with+clinical+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine.</a> J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+adipose+tissue-derived+stem%2Fstromal+cells%2C+using+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vectors%2C+in+the+treatment+of+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia.</a> B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).</li>
<li>Kim, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+effect+of+adipose-derived+stem+cells%3A+a+critical+role+of+secretory+factors+on+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Sci%22%5BJournal%5D)">Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts.</a> J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).</li>
<li>Nakagami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+autologous+cell+therapy+in+ischemic+limb+disease+through+growth+factor+secretion+by+cultured+adipose+tissue-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).</li>
<li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+contributes+to+postnatal+neovascularization+by+mobilizing+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells.</a> EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Allogeneic+transplantation+of+an+adipose-derived+stem+cell+sheet+combined+with+artificial+skin+accelerates+wound+healing+in+a+rat+wound+model+of+type+2+diabetes+and+obesity">Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity.</a> Diabetes. , db141133(2015).</li>
</ol>

Następujący autorzy ujawniają powiązania finansowe związane z tą publikacją: Teruo Okano jest założycielem i dyrektorem zarządu firmy Cell Seed Inc., która udziela licencji na technologię i patenty z Tokijskiego Kobiecego Uniwersytetu Medycznego, a Teruo Okano i Masayuki Yamato są udziałowcami Cell Seed Inc. Tokijski Kobiecy Uniwersytet Medyczny otrzymuje fundusze na badania od Cell Seed Inc. Pozostali autorzy oświadczają, że nie łączą ich powiązania finansowe mające związek z niniejszą publikacją.

Najbardziej krytyczne kroki dla pomyślnego wyhodowania arkusza rASC są następujące: 1) Temperatura musi być utrzymywana na poziomie około 37 °C podczas hodowli na szalkach hodowlanych reagujących na temperaturę. Podczas tworzenia arkusza rASC każda procedura była wykonywana na płytce termicznej o temperaturze 37 °C, a każdy odczynnik był podgrzewany do 37 °C, aby zapobiec samoistnemu odłączaniu się komórek od naczynia31. 2) Szczury ZDF biorcy muszą być monitorowane, aby zapobiec usunięciu opatrunk...

Populacja pacjentów z cukrzycą rośnie na całym świecie i osiągnęła 400 milionów w 2015 roku1; szacuje się, że 15 - 25% pacjentów z cukrzycą jest zagrożonych progresją owrzodzenia cukrzycowego kończyny dolnej2. Owrzodzenia cukrzycowe kończyn dolnych są trudne do leczenia i mogą wymagać przedłużonego okresu terapeutycznego z treningiem rehabilitacyjnym po całkowitym wyzdrowieniu. Długi okres terapii często prowadzi do znacznego obniżenia jakości życia pacjenta. W związku z tym należy opracować nowe terapie, które zmniejszają lub zapobiegają zaostrzeniu choroby w leczeniu ran cukrzycowych. Aby ocenić gojenie się ran cukrzycowych, zoptymalizowaliśmy model gojenia się ran po wrzodach cukrzycowych u szczurów, który naśladuje praktyczne warunki kliniczne, i oceniliśmy, czy przeszczepianie arkuszy komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych przyspiesza gojenie się ran.
Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) wykazują doskonały potencjał do przyspieszania gojenia się ran ze względu na ich zdolność do samoodnawiania, działanie immunomodulujące i zdolność do różnicowania się w różne linie komórkowe3. ASC są rodzajem MSC pochodzącego z tkanki tłuszczowej i wykazują kilka zalet w porównaniu z MSCs pochodzących z innych tkanek, w tym ich potencjał angiogenny i aktywność parakrynną4,5. Tkanka tłuszczowa występuje w organizmie człowieka stosunkowo obficie, a jej dostępność pozwala na pobieranie za pomocą mało inwazyjnych zabiegów. W związku z tym ASC zostały eksperymentalnie wykorzystane do zastosowań związanych z gojeniem ran6,7.
Poprzednie raporty wykazały, że bezpośrednie wstrzyknięcie zawiesin jednokomórkowych MSC w obszary wokół ran może przyspieszyć gojenie się ran8,9. Jednak pomimo doniesień o przyspieszeniu gojenia się ran w modelach owrzodzeń cukrzycowych po wstrzyknięciu zawiesin jednokomórkowych, czas przeżycia przeszczepionych komórek w miejscu rany nie jest jasny.
W tym badaniu zastosowaliśmy inżynierię arkuszy komórkowych, używając naczyń hodowlanych reagujących na temperaturę. Naczynia te mają wrażliwy na temperaturę polimer N-izopropylacrylamid kowalencyjnie związany na ich powierzchni10. Szczepiona warstwa polimeru pozwala na kontrolowane temperatury przyleganie komórek do powierzchni szalki hodowlanej lub oderwanie się od niej. Powierzchnia naczynia staje się hydrofobowa w temperaturze 37 °C, co pozwala komórkom przylegać i namnażać się, podczas gdy komórki spontanicznie odrywają się od powierzchni, gdy staje się ona hydrofilowa w temperaturach poniżej 32 °C. Hodowane komórki można zbierać jako ciągły arkusz komórek z nienaruszonymi połączeniami komórka-komórka i matrycami zewnątrzkomórkowymi (ECM) po prostu poprzez obniżenie temperatury; w związku z tym enzymy proteolityczne, które uszkadzają ECM, takie jak trypsyna, nie są wymagane11. Dlatego inżynieria arkuszy komórkowych może zachować połączenia między komórkami i poprawić skuteczność przeszczepu komórek.
Ponadto, przeszczep arkusza komórkowego zwiększa przeżywalność komórek w porównaniu do iniekcji komórek12. W tym protokole szczury z cukrzycowym tłuszczem cukrzycowym (ZDF) zostały wybrane jako model cukrzycy typu 2 i otyłości z opóźnionym gojeniem się ran. U szczurów ZDF spontanicznie rozwija się otyłość po około 4 tygodniach. Następnie rozwija się u nich cukrzyca typu 2 z otyłością między 8 a 12 tygodniem życia, w którym to momencie wykazują hiperglikemię związaną z insulinoopornością, dyslipidemią i hipertriglicerydemią13. Obserwuje się również opóźnione gojenie się ran, zmniejszony przepływ krwi w obwodowych naczyniach krwionośnych i nefropatię cukrzycową14,15,16. Co więcej, szczury ZDF mogą być odpowiednim modelem do badania gojenia trudnych do leczenia owrzodzeń skóry, takich jak wrzody cukrzycowe.
Różnice między ludźmi a gryzoniami w mechanizmach gojenia ran są związane z anatomicznymi różnicami w skórze. Gojenie się ran u normalnych szczurów opiera się na skurczu rany, podczas gdy gojenie się ran u ludzi opiera się na ponownym nabłonku i tworzeniu ziarniny. Zazwyczaj szynowanie ran stosowane w modelach gryzoni pomaga zminimalizować skurcz rany i pozwala na stopniowe tworzenie się ziarniny tkanki17, chociaż rany u szczurów bez cukrzycy są prawie całkowicie zamykane przez skurcz. Jednak skurcz rany cukrzycowej u szczurów ZDF jest upośledzony, a gojenie się ran następuje głównie poprzez reepitelializację i tworzenie ziarniny; Tak więc proces ten jest bardziej podobny do gojenia się ran u ludzi14.
Rany cukrzycowe z odsłoniętą kością po oczyszczeniu są często spotykane klinicznie. Poprzednie badania dotyczyły ran skóry o pełnej grubości 12 mm na grzbietach nagich myszy atymicznych18,19 oraz rany skóry o pełnej grubości 10 mm na grzbietach normalnych myszy20. Aby opracować model kliniczny dla ciężkich ran cukrzycowych, u szczurów z cukrzycą typu 2 i otyłością stworzono większe (15 x 10 mm2) pełnogrube defekty skóry z odsłoniętą kością i bez okostnej, jak wcześniej opisano21.
Rat ASC (rASC) arkusze z ASC normalnych szczurów Lewisa zostały stworzone poprzez allogeniczne przeszczepienie arkuszy ASC. W praktyce klinicznej przeszczep autologiczny jest niewykonalny, ponieważ pacjenci z cukrzycą z wrzodami często wykazują ciężkie powikłania cukrzycowe, takie jak niekontrolowany wysoki poziom glukozy we krwi i wysokie wskaźniki masy ciała, a powikłania te powodują zaburzenia gojenia się ran, które zwiększają trudność pozyskania tkanki tłuszczowej od tych pacjentów. Co więcej, ASC pochodzące od zwierząt z cukrzycą wykazują zmienione właściwości i upośledzone funkcjonowanie22. Dlatego przedstawiony tutaj protokół opisuje allogeniczny przeszczep arkuszy rASC od normalnych szczurów i zastosowanie sztucznej skóry u szczurów z cukrzycą.
Dwuwarstwowa sztuczna skóra używana w tym protokole zapobiega spontanicznemu kurczeniu się ran, wspomaga syntezę nowej macierzy tkanki łącznej i przypomina prawdziwą skórę właściwą23. W tym protokole sztuczna skóra jest umieszczana na arkuszu rASC i mocowana nylonowymi nitkami, aby zapobiec skurczowi lub powiększeniu rany wynikającej z luźnej skóry szczura. Ponadto sztuczna skóra zapewnia trójwymiarową ramę dla prześcieradeł ASC, utrzymuje wilgotne środowisko dla przeszczepionych prześcieradeł ASC i ran oraz chroni rany przed infekcjami i siłami zewnętrznymi. Na koniec na ranę nakłada się nieprzywierający opatrunek, aby chronić ją przed uderzeniami zewnętrznymi, utrzymać wilgotne środowisko rany i wchłonąć wysięk.
Arkusz rASC jest cienki, elastyczny i odkształcalny i może być przyklejony do ruchomych miejsc odbiorców, takich jak bijące serce24. Inżynieria arkuszy komórkowych została wykorzystana do rekonstrukcji różnych tkanek i może generować efekty lecznicze25,26. Arkusze ASC, które wykazują kliniczny potencjał terapeutyczny, mogą przyspieszać gojenie się wielu rodzajów ran. Co więcej, allogeniczne przeszczepienie arkuszy ASC, w połączeniu z użyciem sztucznej skóry, może mieć zastosowanie w leczeniu trudnych do leczenia owrzodzeń lub oparzeń, takich jak te obserwowane w chorobie tętnic obwodowych lub chorobie kolagenu, lub może być podawane pacjentom niedożywionym lub stosującym sterydy. Takie podejście zwiększa skuteczność przesadzania ASC. Model szczura gojącego się ran ZDF wytwarza ciężki stan rany, który przypomina proces gojenia się ran u ludzi i naśladuje warunki kliniczne u małego zwierzęcia doświadczalnego.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>32571-036</td><td>Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Japan Bioserum Co Ltd.</td><td>S1650-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10 103 578 001</td><td>Mannheim, Niemcy</td></tr><tr><td>60 cm2 Naczynie do hodowli tkankowej Primaria</td><td>BD Biosciences</td><td>353803</td><td>Franklin Lakes, NJ</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforu fosforanowego Dulbecco (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>1490-144</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kwasu L-askorbinowego sól magnezowa n-hydrat</td><td>Wako</td><td>013-19641</td><td></td></tr><tr><td>35-milimetrowe naczynie hodowlane reagujące na temperaturę (UpcellTM)</td><td>CellSeed</td><td>NUNC-174904</td><td>Tokio, Japonia</td></tr><tr><td>Mikrociepła płytka (MP-1000)</td><td>Kitazato Science Co., Ltd. </td><td>1111</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator mechaniczny gryzoni</td><td>Stoelting</td><td>#50206</td><td>Wood Dale, IL</td></tr><tr><td>4% izofluran</td><td>Pfizer Japan</td><td>114-13340-3</td><td>Tokio, Japonia</td></tr><tr><td>Sztuczna skóra (Pelnac&reg; )Smith</td> <td>& Siostrzeniec</td><td>PN-R40060</td><td>&nbsp; Tokio, Japonia</td></tr><tr><td>Opatrunek nieadhezyjny (Hydrosite plus&reg; )Smith</td> <td>& Siostrzeniec</td><td>66800679</td><td>Znany jako Allevyn non-hessing&reg; w Stanach Zjednoczonych</td></tr><tr><td>5-0 nylonowy szew</td><td>Alfresa</td><td>EP1105NB45-KF2</td><td></td></tr><tr><td>20 PROBÓWKI CELLSTAR</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówka wirówkowa</td><td>Corning Incorporated</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL</td><td>Hu-Friedy</td><td>P14</td><td>Chicago, IL</td></tr></tbody></table>

tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (asc) w modelu gojenia się ran cukrzycowych

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Sztuczna skóra osiągnęła znaczące wyniki terapeutyczne w praktyce klinicznej. Jednak leczenie sztucznej skóry ran u pacjentów z cukrzycą z utrudnionym przepływem krwi lub z dużymi ranami może być przedłużone. Terapie komórkowe pojawiły się jako nowa technika leczenia wrzodów cukrzycowych, a inżynieria arkuszy komórkowych poprawiła skuteczność przeszczepu komórek. Wiele doniesień sugeruje, że komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC), rodzaj mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC), wykazują potencjał terapeutyczny ze względu na ich względną obfitość w tkance tłuszczowej i dostępność do pobrania w porównaniu z MSCs z innych tkanek. Dlatego ASC wydają się być dobrym źródłem komórek macierzystych do użytku terapeutycznego. W tym badaniu z powodzeniem stworzono arkusze ASC z tłuszczu tłuszczowego najądrza normalnych szczurów Lewisa przy użyciu szalek hodowlanych reagujących na temperaturę i normalnej pożywki hodowlanej zawierającej kwas askorbinowy. Arkusze ASC zostały przeszczepione szczurom Zuckera z cukrzycowym tłuszczem (ZDF), szczurzemu modelowi cukrzycy typu 2 i otyłości, które wykazują zmniejszone gojenie się ran. Na tylnej powierzchni czaszki powstała rana, do rany przeszczepiono prześcieradła ASC, a do pokrycia prześcieradeł użyto dwuwarstwowej sztucznej skóry. Szczury ZDF, które otrzymały prześcieradła ASC, miały lepsze gojenie się ran niż szczury ZDF bez przeszczepu prześcieradeł ASC. Podejście to było ograniczone, ponieważ arkusze ASC są wrażliwe na suche warunki, co wymaga utrzymania wilgotnego środowiska rany. Dlatego do pokrycia arkusza ASC użyto sztucznej skóry, aby zapobiec wysuszeniu. Allogeniczny przeszczep arkuszy ASC w połączeniu ze sztuczną skórą może mieć również zastosowanie do innych trudnych do leczenia owrzodzeń lub oparzeń, takich jak te obserwowane w przypadku choroby tętnic obwodowych i choroby kolagenu, i może być podawany pacjentom, którzy są niedożywieni lub stosują sterydy. Tak więc leczenie to może być pierwszym krokiem w kierunku poprawy możliwości terapeutycznych gojenia się ran cukrzycowych.

Niniejszy protokół był próbą opracowania nowej terapii komórkowej w leczeniu opornych ran cukrzycowych. W skrócie (jak zilustrowano na Rysunku 1), allogeniczne arkusze rASC stworzono z normalnych szczurów przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych, a następnie przeszczepiono je za pomocą dwuwarstwowej sztucznej skóry na ubytek skóry pełnej grubości u szczura z cukrzycą. Obrazy z mikroskopu świetlnego przedstawiające prawidłowy przykład arkusza rASC (Rysunek 2A</st...

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są łatwo izolowane i zbierane z tłuszczu normalnych szczurów. Arkusze ASC mogą być tworzone przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych i mogą być przeszczepiane do tłustych szczurów z cukrzycą Zuckera, wykazujących defekty skóry na całej grubości z odsłoniętą kością, a następnie pokryte dwuwarstwą sztucznej skóry.

Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Ogólnym celem tej procedury jest sprawdzenie wpływu arkuszy komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w połączeniu ze sztuczną skórą na gojenie się ran w przypadku dużego ubytku skóry o pełnej grubości u szczura z cukrzycą. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące gojenia się ran przewlekłych, takich jak duża rana cukrzycowa z odsłoniętą kością. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są przeszczepiane do rany w litych arkuszach przy użyciu technologii arkuszy komórkowych, a rezultatem jest żywy, stabilny przeszczep.Jako dawcę poduszeczki tłuszczowej zaplanuj użycie szczurów Lewisa w wieku od ośmiu do 33 tygodni. W miejscu operacji przygotuj kilka sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, gazy, skalpel, uchwyt na igły, nożyczki operacyjne, parę kleszczyków i szew nylonowy 5-0. W celu tymczasowego umieszczenia tkanki załaduj 100-mililitrową szalkę Petriego 10 mililitrami PBS.Zważyć naczynie załadowane PBS, aby później określić masę pobranej tkanki. Po znieczuleniu szczura ułóż go na wznak na sterylnym serwecie. Następnie ogol obszar operacyjny i wyszoruj odsłoniętą skórę za pomocą kilku naprzemiennych peelingów z 70% etanolu.Teraz wykonaj trzycentymetrowe nacięcie skóry w bocznej dolnej części brzucha. Następnie odsłoń i wypreparuj zewnętrzny mięsień skośny. Następnie należy odsłonić tkankę tłuszczową najądrza otaczającą najądrza.Następnie ostrożnie wytnij tkankę tłuszczową najądrza. Unikaj uszkadzania najądrzy, jąder i naczyń krwionośnych najądrza. Przenieś tkankę do naczynia PBS.Następnie zamknij szczura dawcę i postępuj zgodnie ze standardowymi praktykami opieki pooperacyjnej. Wyizoluj ASC od dwóch do trzech gramów pobranej tkanki tłuszczowej. Trawić tkankę przez godzinę w 0,1% kolagenazie typu A, aby uzyskać frakcję naczyniową zrębu lub SVF.Po oczyszczeniu SVF zawiesić SVF w 20 mililitrach podłoża. Podziel zawiesinę na dwie szalki hodowlane o powierzchni 60 centymetrów kwadratowych i hoduj je przez 24 godziny w standardowych warunkach. Następnego dnia umyj płytki trzykrotnie PBS, aby usunąć wszelkie nieprzyczepione komórki i zanieczyszczenia.Po ostatnim umyciu dodaj z powrotem świeże, kompletne podłoże. Następnie kontynuuj przechodzenie komórek, aż będą prawie zlewające się w trzecim dniu hodowli. Następnie przy użyciu jednego mililitra 0,25% trypsyny EDTA w krótkiej inkubacji.Usuń komórki z płytki. Nie pozwól, aby komórki były wystawione na działanie aktywnej trypsyny dłużej niż 10 minut. Po obserwacji i policzeniu komórek, posadź je w subkulturze o gęstości 1 700 na centymetr kwadratowy.Następnie przechodź przez komórki co trzy dni i wykonaj trzy przejścia przed kontynuowaniem. Po przejściu subkulturowanych szczurów ASC po raz trzeci, umieść 150 000 komórek na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 milimetrów i dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Hoduj naczynie przez trzy dni w inkubatorze, aby uzyskać jednolity arkusz komórek.Trzy dni później zmień pożywkę i dodaj 16,4 mikrograma na mililitr AA. Następnie hoduj komórki, zmieniając pożywkę AA co drugi dzień. Po czterech lub pięciu dniach na pożywce zawierającej AA należy sprawdzić proliferację ASC. Poszukaj przerw między komórkami a ciągłym arkuszem komórek.Po ustanowieniu ciągłego arkusza komórek można użyć komórek w modelu. W razie potrzeby zbierz arkusz komórek, umieszczając płytkę w temperaturze pokojowej na 15 do 20 minut. Ponieważ płytka jest wrażliwa na temperaturę, komórki spontanicznie odczepią się jako ciągły arkusz, a arkusz można usunąć za pomocą kleszczy.Do modelu gojenia się ran po otyłości należy użyć dorosłych samców szczurów ZDF w wieku od 16 do 18 tygodni o wadze od 500 do 600 gramów. Ustaw i znieczul szczura na polu operacyjnym, a przed goleniem głowy wyczyść go przy użyciu 70% etanolu. Następnie ogol obszar operacyjny i oczyść odsłoniętą skórę naprzemiennymi peelingami z 70% etanolu.Mniej więcej w tym czasie przenieś wrażliwą na temperaturę płytkę komórek macierzystych tłuszczu na ławkę. Zanim arkusz komórek oderwie się od płytki, należy usunąć pożywkę i trzykrotnie umyć arkusz ogniw PBS. Po zebraniu arkusza komórek namocz go w PBS, aż będzie potrzebny.Gdy komórki będą gotowe, wykonaj ubytek skóry o wymiarach 15 na 10 milimetrów na głowie szczura. Najpierw usuń tkankę skórną aż do okostnej. Następnie wytnij skórę i tkankę skórną za pomocą skalpela i nożyczek chirurgicznych.Aby uzupełnić wadę, usuń okostną za pomocą okostnej. Następnie umieść arkusz komórek na wadzie. Arkusz komórek macierzystych jest miękki i elastyczny.Użyj kleszczy, aby przedłużyć go do każdego zakątka wady. Teraz przykryj arkusz komórek i ubytek plastrem sztucznej skóry o wymiarach 10 na 15 milimetrów nasączonym solą fizjologiczną tuż przed użyciem i zamknij ranę około 10 szwami za pomocą nylonowego szwu 5-0. Aby zabezpieczyć ranę, użyj nylonowego szwu 5-0, aby zabezpieczyć plaster nieprzywierającego opatrunku o wymiarach 15 na 20 milimetrów na sztucznej skórze.Zaplanuj obserwację opatrunku co drugi dzień, ponieważ szczur niezmiennie go zdejmie, a w razie potrzeby natychmiast wymieni opatrunek. W dwóch grupach po sześć tłustych szczurów z cukrzycą Zuckera opisany protokół zastosowano w celu stworzenia wady czaszki. Szczury doświadczalne były leczone arkuszem komórek macierzystych tłuszczu szczura, a grupy kontrolne nie.Po 14 dniach rany w grupie leczonej były znacznie mniejsze niż w grupie kontrolnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrobić dużą ranę z odsłoniętą kością u szczurów, a następnie leczyć tę ranę komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy stosować ścisłe zarządzanie temperaturą podczas całego procesu korzystania z naczyń hodowlanych reagujących na temperaturę.W przeciwnym razie komórki mogą spontanicznie oderwać się od naczyń, opóźniając eksperymenty.

creation-transplantation-an-adipose-derived-stem-cell-asc-sheet

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opracowaliśmy małoinwazyjną technikę tworzenia modelu niedokrwiennej rany ucha u królika poprzez przerwanie tętnicy centralnej, nerwu oraz czaszkowego pęczka naczyniowo-nerwowego. Następnie wykonuje się tunel podskórny, przecinając wszystkie tkanki podskórne. Procedura ta powoduje minimalne uszkodzenie skóry i może być bezpiecznie stosowana u zwierząt z cukrzycą.

Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

To badanie opisuje udaną metodę endoskopowego przeszczepu komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) w celu zapobiegania zwężeniu przełyku po rozszerzonej endoskopowej dyssekcji podśluzówkowej (ESD) w modelu trzody chlewnej.

Przeszczep arkusza ADSC w celu zapobiegania zwężeniu po rozszerzonym endoskopowym rozwarstwieniu podśluzówkowym przełyku

Przedstawiono przygotowanie i przeszczep arkuszy komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) na niedostatecznie zszyte zespolenia jelita grubego w modelu szczurzym. To nowatorskie zastosowanie pokazuje, że arkusze ASC mogą zmniejszyć nieszczelność zespolenia jelita grubego.

Przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Model ran cukrzycowych wywołanych streptozotocyną u samców szczurów SD jest obecnie najczęściej używanym modelem do badania gojenia się ran w cukrzycy typu I. Niniejszy protokół opisuje metody użyte do skonstruowania tego modelu. Przedstawiono również potencjalne wyzwania i omówiono je, a także zbadano progresję i charakterystykę angiogenną ran cukrzycowych.

Protokół konstruowania modelu rany szczurzej cukrzycy typu 1

Obecny protokół opisuje prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne, które ocenia wstrzyknięcie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do pępowiny w leczeniu przewlekłych owrzodzeń stopy cukrzycowej.

Prospektywne, randomizowane i kontrolowane badanie wstrzyknięcia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny w leczeniu owrzodzeń stopy cukrzycowej

To badanie przedstawia protokół wytwarzania rusztowań drukowanych biologicznie w 3D do przewlekłego gojenia ran. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są izolowane z mezenchymalnych komórek macierzystych i ładowane do rdzenia (alginianu) za pomocą osłonki wykonanej z karboksymetylocelulozy i liazy alginianowej. Taka konstrukcja umożliwia kontrolowaną degradację rusztowania i wydajne uwalnianie pojazdów elektrycznych.

Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych

Poznaj technikę tworzenia i przeszczepiania arkuszy komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej w modelu gojenia ran cukrzycowych u szczurów. Metoda ta poprawia leczenie przewlekłych ran z odsłoniętą kością.

Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych

Przeglądaj więcej filmów