Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

Ogólnym celem tej metody jest szybkie i niedrogie ilościowe określenie wielu biomarkerów w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), aby ocenić ich zastosowanie w diagnostyce i monitorowaniu leczenia. Jest to nowy test, który pozwala nam mierzyć biomarkery, które wcześniej nie były możliwe do zmierzenia. Uważamy, że można to wykorzystać do celów diagnostycznych, a także do rozróżnienia różnych chorób neurodegeneracyjnych, a potencjalnie także dostarczyć informacji prognostycznych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że została zaprojektowana tak, aby była szybka, prosta w przygotowaniu próbki, wysoce specyficzna i opłacalna do przeniesienia do laboratorium klinicznego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnozę, ponieważ ten wysokoprzepustowy test może być wykorzystany w przyszłych badaniach klinicznych nad nowymi terapiami w neurodegeneracji. Metodologia ta może być również stosowana do innych chorób i tkanek, takich jak mocz w przypadku zaburzeń nerek, osocze w kardiomiopatii i komórki w przypadku pluripotencji.

Aby rozpocząć tę procedurę, ponownie zawiesić pożądane syntetyczne peptydy do stężenia podstawowego jednego miligrama na mililitr, zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj rozcieńczenia peptydu jeden na 10 ze stężenia podstawowego i umieść 1 000 pikomoli każdego peptydu w probówce mikrowirówkowej o niskim poziomie wiązania. Wysuszyć zebraną próbkę peptydu w koncentratorze SpeedVac.

Po zakończeniu przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie podwielokrotność 100 mikrolitrów płynu mózgowo-rdzeniowego do probówek mikrowirówek o niskim stopniu wiązania. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego należy liofilizować na zimno.

Zawiesić podwielokrotność zbiorczej próbki peptydu w buforze do wytrawiania, aby uzyskać stężenie 10 i jednego pikomolu na mikrolitr. Teraz zwiększ zbiorczą próbkę peptydu do liofilizowanych 100-mikrolitrowych podwielokrotności płynu mózgowo-rdzeniowego o stężeniach zero, jeden, dwa, pięć, 10 i 15 pikomolarnych. Następnie dodaj 20 nanogramów nienaruszonego, niepowiązanego białka, aby działało jako wewnętrzny wzorzec i kontrolowało wydajność trawienia trypsyny.

Dodać bufor trawienny do podwielokrotności płynu mózgowo-rdzeniowego do końcowej objętości 20 mikrolitrów i zagłodzić próbki. Następnie należy roztrawić próbki zgodnie ze standardowym protokołem, dodając 1,5 mikrolitra ditiotreitolu i wstrząsając w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie dodaj trzy mikrolitry jodoacetamidu do próbek i wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności.

Następnie dodaj 165 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Dodać do próbek 10 mikrolitrów zmodyfikowanego roztworu trypsyny o stopniu sekwencjonowania 0,1 mikrograma na mikrolitr, zawieszonego w 50-milimolowym buforze wodorowęglanu amonu. Próbki inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnie przerwij trawienie, zamrażając próbki. Po rozmrożeniu płynu wartościowego trawionego na lodzie, odwirować pod ciśnieniem 16 000 razy g przez 10 minut. Po zakończeniu przenieś 60 mikrolitrów każdego digestu do szklanej wkładki o pojemności 300 mikrolitrów.

Korzystając z systemu LC-MS, wyposażonego w kolumnę C18 UPLC, wstrzyknij najwyższe stężenie ze standardowego punktu krzywej za pomocą 10-minutowego gradientu liniowego od jednego do 40% acetonitrylu. Po zakończeniu przebiegu otwórz wynikowy chromatogram w oprogramowaniu i zanotuj czas retencji oraz dwie najbardziej intensywne przejścia na peptyd. Na podstawie tych informacji zaktualizuj wcześniej utworzoną metodę monitorowania wielu reakcji lub metodę MRM z kanałami czasowymi do pomiaru peptydów.

Aby zachować czułość, utrzymuj każdy kanał z punktami na pik większymi niż osiem i czasem przebywania dłuższym niż 0,01 sekundy przez co najmniej jedno przejście dla każdego peptydu. Uwzględnij opóźnienia rozpuszczalnika w metodzie MRM, wybierając opóźnienia rozpuszczalnika w zdarzeniach metody w pliku metody MS. Bardzo ważne jest prawidłowe dopasowanie prawidłowego piku w krótkiej metodzie HPLC.

Można to zrobić za pomocą kolczastych peptydów w matrycy, które są używane do krzywej standardowej i obserwując wielokrotne przejścia podczas opracowywania metody. Na koniec ręcznie przejrzyj adnotację danych, aby zapewnić dokładność. Przeanalizować każdy peptyd i stosunek do odpowiedniego stabilnego wzorca wewnętrznego znakowanego izotopem.

Pokazano tutaj chromatogram istotnych markerów peptydowych z wysokoprzepustowego testu płynu mózgowo-rdzeniowego. Dane dają znormalizowane proporcje do odpowiedniego wzorca wewnętrznego znakowanego stabilnym izotopem, który można wykorzystać do określenia bezwzględnych stężeń płynu mózgowo-rdzeniowego i analizować statystycznie pod kątem zmian w próbkach klinicznych. Ilościowe oznaczenie 74 peptydów zawartych w tym teście płynu mózgowo-rdzeniowego wykazało, że 25 z nich uległo znaczącym zmianom w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z demencją, a wyniki markerów demencji pro-oreksyny i białka podobnego do chitynazy-3 YKL są wyświetlane tutaj.

ApoE4 jest znanym czynnikiem ryzyka choroby Alzheimera, a wykrywanie izoform ApoE opiera się na wykrywaniu odpowiednich peptydów dla zmian aminokwasowych dla izoform E2 i E4. Wzór piku oczekiwany dla każdej kombinacji izoform jest pokazany tutaj. Po skonfigurowaniu metody test można wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po opracowaniu tej metody udało się zmierzyć nowy zestaw biomarkerów o wysokiej czułości analitycznej i swoistości, a to umożliwi naukowcom ocenę chorób neurodegeneracyjnych w nowy sposób.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować i zoptymalizować test MRM pod kątem czułości i swoistości. Nie zapominaj, że praca z DTE, termitami, kwasem mrówkowym i tkanką ludzką może być niezwykle niebezpieczna i podczas tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.