Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

Ogólnym celem tej metody jest szybkie i niedrogie ilościowe oznaczenie wielu biomarkerów w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), aby ocenić ich przydatność w diagnostyce i monitorowaniu leczenia. Jest to nowy test, który umożliwia pomiar biomarkerów, których wcześniej nie można było zmierzyć. Uważamy, że może on być wykorzystywany do celów diagnostycznych, a także do różnicowania poszczególnych chorób neurodegeneracyjnych i potencjalnie do dostarczania informacji prognostycznych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że została ona zaprojektowana jako szybka, prosta w przygotowaniu próbek, wysoce specyficzna i kostoefficientna w kontekście wdrożenia do laboratorium klinicznego. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę, ponieważ ten test o wysokiej przepustowości może być wykorzystany w przyszłych badaniach klinicznych nad nowymi terapiami w neurodegeneracji. Metodologię tę można zastosować również do innych chorób i tkanek, takich jak mocz w przypadku schorzeń nerek, osocze w kardiomiopatii oraz komórki w celu oceny pluripotencji.

Aby rozpocząć tę procedurę, resuspender odpowiednie syntetyczne peptydy do stężenia roztworu zapasowego wynoszącego 1 mg/mL, zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować rozcieńczenia peptydów 1:10 z roztworu zapasowego, a następnie połączyć 1 000 pmol każdego peptydu w probówce do mikrocentryfugi o niskim stopniu wiązania. Próbkę połączonych peptydów wysuszyć w koncentratorze SpeedVac.

Po zakończeniu przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C. Następnie odmierzyć 100 µL CSF do probówek do mikrowirówki o niskim wiązaniu. Liofilizować próbki CSF.

Resuspender alikwot połączonej próbki peptydów w buforze do trawienia, aby uzyskać stężenia 10 oraz 1 pikomola na mikrolitr. Następnie dodać połączoną próbkę peptydów do liofilizowanych alikwotów CSF o objętości 100 mikrolitrów, aby uzyskać stężenia 0, 1, 2, 5, 10 i 15 pikomoli. Na koniec dodać 20 nanogramów nienaruszonego, niepowiązanego białka, które będzie pełnić funkcję standardu wewnętrznego i kontroli wydajności trawienia trypsyną.

Do aliquotów CSF dodać bufor trawienny do uzyskania końcowej objętości 20 microliters, a następnie wymieszać próbki w wirówce typu vortex. Następnie przeprowadzić trawienie próbek zgodnie ze standardowym protokołem, dodając 1,5 microliters ditiotreitolu i mieszając w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po tym kroku dodać do próbek trzy microliters jodoacetamidu i mieszać w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności.

Następnie należy dodać 165 µL wody dwukrotnie destylowanej. Do próbek dodaje się 10 µL roztworu modyfikowanej trypsyny o stężeniu 0,1 µg/µL klasy sekwencyjnej, resuspendowanej w 50 mM buforze wodorowęglanu amonu. Próbki inkubuje się w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez noc.

Następnie należy przerwać trawienie poprzez zamrożenie próbek. Po rozmrożeniu trawionych próbek CSF na lodzie, odwiruj je przy 16 000 ×g przez 10 minut. Po zakończeniu przenieś 60 µl każdego hydrolizatu do szklanego wkładnika o pojemności 300 µl.

Używając systemu LC-MS wyposażonego w kolumnę UPLC C18, wstrzyknij próbkę o najwyższym stężeniu z krzywej wzorcowej, stosując 10-minutowy gradient liniowy acetonitrylu od 1% do 40%. Po zakończeniu analizy otwórz otrzymany chromatogram w oprogramowaniu i odnotuj czas retencji oraz dwa najintensywniejsze przejścia dla każdego peptydu. Na podstawie tych informacji zaktualizuj wcześniej stworzoną metodę monitorowania wielu reakcji (MRM) z kanałami czasowymi w celu pomiaru peptydów.

Aby zachować czułość, należy zadbać, by w każdym kanale dla co najmniej jednego przejścia każdego peptydu liczba punktów na pik była większa niż osiem, a czas przebywania większy niż 0,01 sekundy. W metodzie MRM należy uwzględnić opóźnienia rozpuszczalnika, wybierając odpowiednie opóźnienia rozpuszczalnika w zdarzeniach metody w pliku metody MS. Kluczowe jest prawidłowe dopasowanie odpowiedniego piku w krótkiej metodzie HPLC.

Można to przeprowadzić, wykorzystując peptydy dodane do macierzy, które służą do sporządzenia krzywej wzorcowej, oraz obserwując wiele przejść podczas optymalizacji metody. Na koniec należy ręcznie sprawdzić adnotacje danych, aby zapewnić ich dokładność. Przeanalizuj każdy peptyd i stosunek do odpowiedniego wewnętrznego standardu znakowanego stabilnymi izotopami.

Tutaj przedstawiono chromatogram istotnych markerów peptydowych z wysokoprzepustowego testu CSF. Dane przedstawiają zestandaryzowane stosunki względem odpowiedniego wewnętrznego standardu znakowanego stabilnymi izotopami, które mogą być wykorzystane do oznaczenia bezwzględnych stężeń w CSF oraz analizowane statystycznie pod kątem zmian w próbkach klinicznych. Ilościowe oznaczenie 74 peptydów objętych tym testem CSF wykazało, że 25 z nich uległo istotnej zmianie w CSF pacjentów z otępieniem; tutaj wyświetlone są wyniki dla markerów otępienia: pro-oreksyny oraz białka YKL podobnego do chitinazy-3.

ApoE4 jest znanym czynnikiem ryzyka choroby Alzheimera, a wykrywanie izoform ApoE opiera się na identyfikacji odpowiednich peptydów odpowiadających zmianom aminokwasowym dla izoform E2 i E4. Przedstawiono tutaj spodziewany wzorzec pików dla każdej kombinacji izoform. Po skonfigurowaniu metody analizę można przeprowadzić w ciągu jednego dnia, jeśli jest ona wykonana prawidłowo. Po opracowaniu tej metody możliwe stało się pomiar nowego zestawu biomarkerów z wysoką czułością i specyficznością analityczną, co umożliwi badaczom nową metodę oceny chorób neurodegeneracyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak zaprojektować i zoptymalizować analizę MRM pod kątem czułości i specyficzności. Pamiętaj, że praca z DTE, termitami, kwasem mrówkowym i tkanką ludzką może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.