Name: Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj metody analizy układu krwiotwórczego Drosophila z naciskiem na preparowanie gruczołów limfatycznych i immunohistochemię. Techniki te pozwalają badać wpływ czynników genetycznych i środowiskowych na hematopoezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Matthew O'Connellowi, Maryam Jahanshahi i Andreasowi Jenny'emu za pomoc. Dziękujemy Istvánowi Andó za przeciwciała specyficzne dla plazmatocytów, Utpalowi Banerjee za muchom kopułkowo-mezo-EBFP2, Julianowi Martinezowi-Agosto za muchom antp>GFP oraz Michaelowi O'Connorowi za muchy ptth i ptth>grim. Metody te zostały opracowane przy wsparciu Fundacji Kimmel, Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 i NIH/NCI T32CA078207.

1. Stężenie hemocytu w krążeniu
<ol>
	<li>Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.</li>
	<li>Zebrać larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, Tabela 1).</li>
	<li>Dla każdej larwy umieścić 10 μl 1x PBS w probówce do mikrowirówki na lodzie i 10 μl 1x PBS na czystej podkładce preparucyjnej. Umieść podkładkę sekcyjną na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Osusz pojedynczą larwę, umieszczając ją na chusteczce higienicznej przed przeniesieniem jej do kropli PBS na podkładce do sekcji.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie rozerwij i ostrożnie odwróć naskórek, aby uwolnić hemolimfę. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie zeskrobać ani nie dźgnąć naskórka, ponieważ może to potencjalnie uwolnić siedzące hemocyty29.</li>
	<li>Za pomocą pipety zbierz hemolimfę z podkładki preparacyjnej. Unikaj zbierania resztek larw, takich jak ciało tłuszczowe.</li>
	<li>Dodaj hemolimfę do probówki do mikrowirówki i mieszaj, pipetując w górę iw dół. 
	UWAGA: Można pobrać kilka próbek jednocześnie i przechowywać je na lodzie przez okres do godziny.</li>
	<li>Opcjonalnie: Wymieszaj błękit trypanowy z próbką hemolimfy w równych częściach, aby zabarwić i wykluczyć martwe komórki. Policz komórki w ciągu 3 minut od dodania błękitu trypanowego, ponieważ jest on toksyczny dla komórek.</li>
	<li>Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić 10 μl w komorze hemocytometru.</li>
	<li>Jeśli używasz automatycznego licznika komórek, ustaw odpowiednie parametry dla rozmiaru komórki i obiegu. Na przykład ustaw minimalny rozmiar komórki 2 μm, maksymalny rozmiar komórki 22 μm i okrągłość 75 - 80%, aby wykryć normalne, okrągłe hemocyty34. Eksperymentuj z różnymi parametrami, aby wykryć większe i wrzecionowate hemocyty, takie jak lamellocyty. Alternatywnie użyj hemocytometru do ręcznego liczenia hemocytów.</li>
</ol>
2. Immunohistochemia krążących hemocytów
<ol>
	<li>Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.</li>
	<li>Umieścić jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki 6- lub 12-dołkowej. 
	UWAGA: Kwadratowe szkiełka nakrywkowe (22 mm) pasują do płytek 6-dołkowych, a okrągłe szkiełka nakrywkowe (o średnicy 18 mm) pasują do płytek 12-dołkowych.</li>
	<li>Zbieraj larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x PBS.</li>
	<li>Umieść 5 μl 1x PBS na środku każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść płytkę na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Osusz pojedynczą larwę na chusteczce higienicznej, a następnie umieść ją w PBS na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie oderwij i ostrożnie odwróć naskórek. Przed usunięciem tuszy larwalnej należy za jej pomocą równomiernie rozprowadzić hemolimfę. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie zeskrobać ani nie dźgnąć naskórka, ponieważ może to potencjalnie uwolnić siedzące hemocyty29.</li>
	<li>Powtórz tę czynność dla wszystkich larw, zbierając hemolimfę z jednej larwy na szkiełko nakrywkowe. Pozostawić hemocyty do przylegania do szkiełek nakrywkowych przez 5 - 8 minut w temperaturze pokojowej RT. Nie przekraczać 30 minut przed utrwaleniem.</li>
	<li>Utrwal hemocyty, dodając 5 μl 7,5% formaldehydu (Tabela 1) do każdego szkiełka nakrywkowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy za pomocą 1x PBS. Przechyl płytkę i odessaj PBS po każdym praniu. Aby zapobiec spływaniu roztworu przepuszczalnego w następnym kroku, należy użyć aspiratora do usunięcia nadmiaru PBS z obwodu szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu przepuszczalnego (Tabela 1) do każdego szkiełka nakrywkowego przez 20 minut w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Przechyl i delikatnie postukaj w płytkę, aby zassać roztwór przepuszczalny.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem przeciwciała (Tabela 1) zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać co najmniej 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do szkiełek nakrywkowych na płytkach 12-dołkowych. Dodać co najmniej 1,5 ml do płytek 6-dołkowych. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć szkiełka nakrywkowe 1x PBS przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, trzy razy.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe roztworem przeciwciała zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać co najmniej 500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do szkiełek nakrywkowych na płytkach 12-dołkowych. Dodać co najmniej 1,5 ml w przypadku płytek 6-dołkowych. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i przemywać szkiełka nakrywkowe 1x PBS przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, jak w kroku 2.10, trzy razy.</li>
	<li>Podczas etapów mycia wyczyść szklane szkiełka mikroskopowe 70% etanolem (Tabela 1) za pomocą chusteczek higienicznych. Dla każdego szkiełka nakrywkowego umieścić 5 μl bufora montażowego (tabela 1) na szkiełku podstawowym. 
	UWAGA: Na jednym szkiełku mieszczą się dwa szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Zassać końcowe płukanie PBS.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z płytek i umieść je odwrócone na buforze montażowym. 
	Uwaga: Preparaty mikroskopowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności zastosowanych przeciwciał. Płytki 6- i 12-dołkowe można płukać i ponownie używać.</li>
</ol>
3. Melanizacja komórek krystalicznych in vivo
<ol>
	<li>Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2-6 godzin.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem ustaw źródło ciepła na 60 °C. 
	UWAGA: Najlepiej sprawdza się program termocyklera o temperaturze 60 °C przez 10 minut (a następnie utrzymanie w temperaturze 25 °C), ale wystarczy łaźnia wodna lub inne źródło ciepła, o ile ciepło jest równomiernie i równomiernie rozprowadzane po każdej larwie.</li>
	<li>Zebrać larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x PBS (Tabela 1).</li>
	<li>Pojedynczo osusz larwę na chusteczce higienicznej i umieść na dnie probówki do PCR. Umieść każdą larwę w osobnej probówce do PCR. (Patrz rysunek 3A.)</li>
	<li>Aby uzyskać spójne wyniki, należy upewnić się, że larwy pozostają na dnie probówek do PCR, schładzając larwy w probówkach w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut i/lub delikatnie stukając w probówki przed podgrzaniem.</li>
	<li>Umieść probówki PCR w termocyklerze (lub łaźni wodnej). Podgrzewać w temperaturze 60 °C przez 10 min.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij larwy z probówek PCR do dołków preparacyjnych wypełnionych świeżym 1x PBS.</li>
	<li>Wysuszyć larwy na chusteczce higienicznej i ułożyć na płaskiej powierzchni do obrazowania pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Oceniaj obrazy larw na ślepo przez wiele osobników.</li>
</ol>
4. Immunohistochemia larwalnych gruczołów chłonnych
UWAGA: Gruczoł limfatyczny znajduje się około jednej trzeciej długości od przedniego końca larwy nieco poniżej mózgu po stronie grzbietowej. (Patrz strzałka na rysunku 3B.) Gruczoł limfatyczny flankuje naczynie grzbietowe i najłatwiej go rozciąć przyczepiając do haczyków gębowych lub do mózgu. Gruczoły limfatyczne typu dzikiego w trzecim stadium chorobowym są bardzo małymi strukturami; Płaty pierwotne mają długość około 100 - 200 μm. (Patrz rysunek 4A.)
<ol>
	<li>Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.</li>
	<li>Rozwarstwienie gruczołów chłonnych
	<ol>
		<li>Dla każdego warunku doświadczalnego dodać 1 ml 1x PBS (Tabela 1) do jednego dołka na płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Dodać 1 kroplę 0,1% PBST (Tabela 1) do każdej studzienki za pomocą jednorazowej pipety transferowej. 
		UWAGA: Detergent, taki jak Tween 20, jest dodawany w celu obniżenia napięcia powierzchniowego, dzięki czemu chusteczka opada na dno studzienki.</li>
		<li>Połóż talerz płasko na lodzie.</li>
		<li>Zbieraj larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x PBS.</li>
		<li>Umieść czystą podkładkę sekcyjną na oświetlonej podstawie mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej umieść małe krople 0,01% PBST (Tabela 1) na podkładce. Przenieś jedną larwę do kropli PBST w celu rozwarstwienia.</li>
		<li>Trzymaj larwę jedną parą kleszczy około jednej czwartej długości od tylnego końca, grzbietem do góry.</li>
		<li>Użyj innej pary kleszczy, aby chwycić naskórek bezpośrednio przed kleszczami, które trzymają larwę. Delikatnie pociągnij naskórek w kierunku przedniego końca, aż haczyki do ust zostaną odsłonięte. 
		UWAGA: Celem jest złuszczenie naskórka bez naruszania jakichkolwiek struktur wewnętrznych.</li>
		<li>Zwolnij naskórek i użyj obu kleszczy, aby przeciąć larwę na pół. Usuń tylny koniec z kropli PBST. 
		UWAGA: Jeśli naskórek nie złuszcza się aż do haczyków gębowych, przetnij larwę na dwie części i usuń tylny koniec. Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać krawędź naskórka, a drugiej pary kleszczy, aby wepchnąć haczyki do ust przez otwór. Spowoduje to odwrócenie naskórka i odsłonięcie haczyków do ust. Może to być również stosowane jako alternatywna metoda sekcji.</li>
		<li>Użyj jednej pary kleszczy, aby przygwoździć naskórek (naskórek brzuszny, płat naskórka grzbietowego lub oba), aby uzyskać stabilność.</li>
		<li>Użyj innej pary kleszczy, aby chwycić odsłonięte haczyki na usta i delikatnie je wyciągnij. 
		UWAGA: Spowoduje to oddzielenie naskórka od struktur wewnętrznych. Idealnie byłoby, gdyby krążki imaginalne oka/czułka, mózg, gruczoł pierścieniowy i gruczoł limfatyczny otaczający naczynie grzbietowe pozostały przyczepione do haczyków ustnych.</li>
		<li>Trzymając haczyki do ust, ostrożnie usuń niechciane struktury, takie jak gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita. 
		UWAGA: Jeśli mózg oddzieli się od haczyków w jamie ustnej, gruczoł limfatyczny może nadal być przyczepiony do mózgu i zebrany wraz z nim. W takim przypadku trzymaj brzuszny rdzeń nerwowy zamiast haczyków ustnych.</li>
		<li>Używając haczyków ustnych lub brzusznego rdzenia nerwowego jako uchwytu, przenieś wypreparowany kompleks zawierający gruczoł limfatyczny do studni na lodzie. Nie należy przekraczać 30 minut przed utrwaleniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie i immunohistochemia
	<ol>
		<li>Umieść 24-dołkową płytkę na podstawie mikroskopu stereoskopowego.</li>
		<li>Użyj pipety p200, aby ostrożnie usunąć PBST z dołka. 
		UWAGA: Puste, sąsiednie studnie są przydatne do tymczasowego składowania odpadów.</li>
		<li>Delikatnie dodaj 200 μl 3,7% formaldehydu (Tabela 1) z boku studzienki i zakręć płytką, aby upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone.</li>
		<li>Włóż płytkę z powrotem do lodu na 30 minut. Jeśli gruczoły limfatyczne wyrażają białka fluorescencyjne, przykryj płytkę, aby zapobiec fotowybielaniu.</li>
		<li>Użyj pipety p200, aby ostrożnie usunąć utrwalacz.</li>
		<li>Przemyć, dodając 200 μl 1x PBS do studzienki i umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 5 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pipety p200, aby ostrożnie wyjąć PBS. 
		UWAGA: Stałe gruczoły limfatyczne można pozostawić na lodzie w PBS, dopóki gruczoły limfatyczne dla wszystkich warunków eksperymentalnych nie zostaną wypreparowane i naprawione.</li>
		<li>Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Dodać 200 μl roztworu przepuszczalnego (tabela 1) do studzienki. Ustaw płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 45 minut w RT. 
		UWAGA: 45 minut to "złoty standard" przepuszczalności gruczołów limfatycznych, ale autorzy odnoszą sukces już po 20 minutach.</li>
		<li>Usunąć roztwór za pomocą pipety p200.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem przeciwciała (Tabela 1) zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do studzienki i upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Użyj pipety p200, aby usunąć przeciwciało pierwotne.</li>
		<li>Przemyć, dodając 200 μl 1x PBS do studzienki i umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pipety p200, aby ostrożnie wyjąć PBS.</li>
		<li>Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe roztworem przeciwciała zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał wtórnych do studzienki i upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Użyj pipety p200, aby usunąć przeciwciało wtórne i przemyć zgodnie z opisem w krokach 4.3.12 i 4.3.13. Nie wyjmuj PBS po ostatnim praniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż gruczołów limfatycznych
	<ol>
		<li>Wyczyść szklane szkiełka mikroskopowe za pomocą 70% etanolu (Tabela 1) i chusteczek do tkanek.</li>
		<li>Dla każdego warunku doświadczalnego umieścić jedną kroplę bufora montażowego (Tabela 1) na szkiełku podstawowym. 
		UWAGA: Na jednym slajdzie mieszczą się dwa warunki. Objętość bufora montażowego zależy od liczby gruczołów limfatycznych, które mają być zamontowane. Użyj 2 μl dla około 18 - 20 gruczołów limfatycznych, 1 μl dla 10 - 12 i 0,5 μl dla 5 lub mniej.</li>
		<li>Umieść szkiełko mikroskopowe na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.</li>
		<li>W maksymalnie dwóch warunkach jednocześnie przenieś wszystkie gruczoły limfatyczne ze studzienki do bufora montażowego za pomocą kleszczy, używając haczyków ustnych lub brzusznego rdzenia nerwowego jako uchwytu.</li>
		<li>Rozmieść wypreparowane tkanki równomiernie w okrągłym lub prostokątnym kształcie, rozprowadzając przy tym bufor montażowy.</li>
		<li>Dla każdej z wypreparowanych tkanek, indywidualnie, wsuń jeden szczypiec kleszczyków pod naczynie grzbietowe i delikatnie pociągnij w kierunku obwodu bufora montażowego. 
		UWAGA: Spowoduje to wyciągnięcie gruczołu limfatycznego z reszty wypreparowanych tkanek i spłaszczenie gruczołu limfatycznego na szkle.</li>
		<li>Za pomocą jednego szczypiec kleszczowych i ruchu piłowania przeciąć naczynie grzbietowe między gruczołem limfatycznym a mózgiem.</li>
		<li>Przenieść resztę wypreparowanych tkanek na przeciwną stronę gruczołu chłonnego, na najbardziej zewnętrzną krawędź buforu. 
		UWAGA: Niechciane wypreparowane tkanki ostatecznie utworzą obwód wokół gruczołów limfatycznych i posłużą jako podpora, na której spocznie szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Powtarzaj, aż wszystkie gruczoły limfatyczne zostaną oddzielone od wypreparowanych tkanek, zachowując jedną z niechcianych wypreparowanych tkanek do umieszczenia w środku.</li>
		<li>Weź szkiełko nakrywkowe między dwoma palcami. Sprawdź, czy szkiełko nakrywkowe jest wolne od kurzu i odcisków palców. W razie potrzeby użyj chusteczki higienicznej i 70% etanolu, aby wyczyścić szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Upewniając się, że krawędź szkiełka nakrywkowego jest równoległa do krawędzi szkiełka nakrywkowego, ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na zderzak montażowy. 
		UWAGA: Szkiełka mikroskopowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności zastosowanych przeciwciał. Płytki 24-dołkowe można wypłukać i ponownie użyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obrazowanie
<ol>
	<li>Obraz utrwalonych hemocytów i zamontowanych gruczołów limfatycznych na odpowiednim standardowym mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym przy powiększeniu 20X lub większym zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Obraz całych larw na standardowym mikroskopie stereoskopowym przy 2-krotnym powiększeniu zgodnie z instrukcją obsługi producenta.</li>
	<li>W razie potrzeby postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy oprogramowania dotyczącymi dekonwolucji.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>rozwiązanie</td>
			<td>kompozycja</td>
			<td>składowanie</td>
			<td>Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">1x PBS</td>
			<td>200 mg/L chlorek potasu</td>
			<td rowspan="5">temperatura pokojowa</td>
			<td rowspan="5"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mg/L fosforan potasu jednozasadowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 000 mg/l chlorku sodu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,150 mg/L sodu fosforan dwuzasadowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utrwalacz</td>
			<td>3,7% lub 7,5% formaldehydu w 1x PBS</td>
			<td>Temperatura pokojowa w ciemności</td>
			<td>Formaldehyd jest toksyczny. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Roztwór przepuszczalny/rozcieńczalnik przeciwciał</td>
			<td>0,4% Tryton</td>
			<td rowspan="3">4 °C</td>
			<td rowspan="3">Standardowa formuła używa 0,4% Triton, ale autorzy używają 0,1% Tween 20 z powodzeniem. Służy do rozcieńczania przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zgodnie ze stężeniami zalecanymi przez dostawców.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% albumina surowicy bydlęcej, normalna surowica kozia lub normalna surowica osła</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Biblioteka PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% etanolu</td>
			<td>70% 200-procentowy etanol w dH2O</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Bufor montażowy</td>
			<td>0,5% galusan N-propylu</td>
			<td rowspan="4">4 °C w ciemności</td>
			<td rowspan="4">Galusan N-propylu jest szkodliwy. DAPI jest mutagenem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% glicerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opcjonalnie: 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Biblioteka PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,1% PBST</td>
			<td>0,1% Animacja 20 w 1x PBS</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,01% PBST</td>
			<td>Rozcieńczenie 1:10 0,1% PBST</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Rozwiązania zastosowane w niniejszym Protokole.

<ol><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thicker+than+blood%3A+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).</li>
<li>Crozatier, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila haematopoiesis.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+a+model+for+studying+genetic+and+molecular+aspects+of+haematopoiesis+and+associated+leukaemias%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias.</a> Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).</li>
<li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li>
<li>Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+hematopoietic+hubs+in+Drosophila+adults+generate+hemocytes+and+contribute+to+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response.</a> Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li>
<li>Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+response+to+parasitization+in+Drosophila+requires+the+EBF+orthologue+collier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier.</a> PLoS Biol. 2 (8), 196(2004).</li>
<li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li>
<li>Minakhina, S., Steward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanotic+mutants+in+Drosophila%3A+pathways+and+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes.</a> Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).</li>
<li>Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+targets+of+Drosophila+JAK%2FSTAT+pathway+signalling+as+effectors+of+haematopoietic+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation.</a> EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).</li>
<li>Avet-Rochex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+RNA+interference+screen+identifies+gene+networks+controlling+Drosophila+melanogaster+blood+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis.</a> BMC Dev Biol. 10, 65(2010).</li>
<li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+immune+system+and+response+genes%2C+and+novel+mutations+causing+melanotic+tumor+formation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).</li>
<li>Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+fruit+fly+hemangioblast+and+similarities+between+lymph-gland+hematopoiesis+in+fruit+fly+and+mammal+aorta-gonadal-mesonephros+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm.</a> Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).</li>
<li>Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+convergence+of+Notch+and+MAPK+signaling+specifies+the+blood+progenitor+fate+in+the+Drosophila+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm.</a> Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).</li>
<li>Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Serrate-expressing+signaling+center+controls+Drosophila+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis.</a> Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).</li>
<li>Krzemien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+blood+cell+homeostasis+in+Drosophila+larvae+by+the+posterior+signalling+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre.</a> Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).</li>
<li>Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hedgehog-+and+Antennapedia-dependent+niche+maintains+Drosophila+haematopoietic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors.</a> Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).</li>
<li>Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EBF+transcription+factor+Collier+directly+promotes+Drosophila+blood+cell+progenitor+maintenance+independently+of+the+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).</li>
<li>Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+wingless+signaling+in+stem-like+hematopoietic+precursor+maintenance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).</li>
<li>Pennetier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+the+Drosophila+hematopoietic+niche+by+bone+morphogenetic+protein+signaling+reveals+parallels+with+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).</li>
<li>Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-modulated+Heartless+signaling+in+Drosophila+blood+progenitors+regulates+their+differentiation+via+a+Ras%2FETS%2FFOG+pathway+and+target+of+rapamycin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function.</a> Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).</li>
<li>Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yorkie+and+Scalloped+signaling+regulates+Notch-dependent+lineage+specification+during+Drosophila+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis.</a> Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).</li>
<li>Milton, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+regulates+hematopoiesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster.</a> Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).</li>
<li>Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+hematopoiesis%3A+Markers+and+methods+for+molecular+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis.</a> Methods. 68 (1), 242-251 (2014).</li>
<li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+Drosophila+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li>
<li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J Vis Exp. (63), e3347(2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+crystal+cells+in+the+larva+of+Drosophila+mekmogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Drosophila+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biol+Hung%22%5BJournal%5D)">Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).</li>
<li>Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+lymph+gland+as+a+developmental+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis.</a> Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).</li>
<li>Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+Drosophila+larval+hematopoietic+organ%2C+hemocyte+homeostasis+and+the+dedicated+cellular+immune+response+to+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism.</a> Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).</li>
<li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Larval+Hemocytes+of+Drosophila-Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster.</a> Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).</li>
<li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).</li>
<li>McBrayer, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothoracicotropic+hormone+regulates+developmental+timing+and+body+size+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila.</a> Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).</li>
<li>Reimels, T. A., Pfleger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rabex-5+restricts+Notch+activity+in+hematopoietic+cells+and+maintains+hematopoietic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis.</a> J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów ani interesów finansowych.

W przypadku zmian genetycznych lub środowiskowych cztery opisane tutaj metody mogą być stosowane pojedynczo lub w połączeniu do analizy różnych procesów podczas hematopoezy, takich jak sygnalizacja, przeżycie, proliferacja i różnicowanie. Hematopoeza Drosophila jest procesem dynamicznym; Liczba hemocytów na zwierzę wzrasta35, a struktura i ekspresja genów gruczołu limfatycznego zmienia się32 podczas rozwoju. Dlatego przed wykonaniem tych testów bardzo ważne jest, aby ograniczyć pobieranie ...

Skomplikowane mechanizmy regulujące czynniki transkrypcyjne i szlaki sygnałowe, które koordynują rozwój układu krwiotwórczego i które powodują nieprawidłowe działanie chorób hematologicznych, pozostają słabo poznane. Te czynniki transkrypcyjne i szlaki sygnałowe, a także ich regulacja, są wysoce konserwatywne między Drosophila a hematopoezą ssaków1-5. Tak więc układ krwiotwórczy Drosophila stanowi doskonały model genetyczny do zdefiniowania mechanizmów molekularnych kontrolujących hematopoezę i leżące u jej podstaw choroby hematologiczne.
Podobnie jak ssaki, Drosophila wytwarzają komórki krwi, zwane hemocytami, w przestrzennie i czasowo odrębnych fazach hematopoezy. Tradycyjnie uważano, że hematopoeza Drosophila jest ograniczona do faz w mezodermie embrionalnej i w larwalnym gruczole limfatycznym. Ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że hematopoeza występuje również w skupiskach larw siedzących i w dorosłym brzuchu6-8. Wszystkie fazy krwiotwórcze wytwarzają dwa rodzaje dojrzałych hemocytów: plazmatocyty i komórki krystaliczne. Plazmatocyty to komórki podobne do makrofagów biorące udział w fagocytozie, wrodzonej odporności i gojeniu się ran. Komórki krystaliczne zawierają pro-fenolooksydazy wymagane do melanizacji, reakcji stosowanej w odpowiedziach immunologicznych owadów i gojeniu się ran. Hematopoeza larw może generować trzeci dojrzały typ hemocytu, zwany blaszkocytem, w odpowiedzi na pewne wyzwania immunologiczne, takie jak zakażenie pasożytniczą osą9,10. Blaszocyty to duże, przylegające komórki, które działają w połączeniu z plazmatocytami i komórkami krystalicznymi w celu kapsułkowania i neutralizacji jaj os składanych w larwach Drosophila. W przypadku braku pasożytowania lamellocyty nie występują w larwach typu dzikiego. Masy melanotyczne przypominają melanizowane, zamknięte w kapsułkach jaja os; wiele zmutowanych szczepów Drosophila rozwija masy melanotyczne przy braku pasożytowania. Obecność blaszek i/lub mas melanotycznych może wskazywać na nieprawidłowości krwiotwórcze. W rzeczywistości fenotyp masy melanotycznej został wykorzystany do identyfikacji genów i szlaków zaangażowanych w hematopoezę11-14.
Larwalny układ krwiotwórczy jest najobszerniej zbadany do tej pory. Składa się z hemocytów krążących w hemolimfie, siedzących klastrów hemocytów wzorowanych pod naskórkiem i hemocytów znajdujących się w gruczole limfatycznym. Gruczoł limfatyczny to szereg obustronnych płatów przyczepionych do naczynia grzbietowego. Każdy płat pierwotny gruczołu limfatycznego jest podzielony na trzy główne strefy. Najbardziej zewnętrzna strefa jest znana jako strefa korowa i zawiera dojrzewające hemocyty. Najbardziej wewnętrzna strefa nazywana jest strefą rdzeniastą i składa się ze spoczynkowych prekursorów hemocytu. Trzecia strefa, tylne centrum sygnalizacyjne, to niewielka grupa komórek u podstawy gruczołu limfatycznego, które działają jak nisza przypominająca komórki macierzyste. Wczesne prace ustaliły krytyczne funkcje aktywności Notch15-18, Hedgehog19,20, JAK-STAT18 i Wingless21 w celu regulacji rozwoju larw gruczołów chłonnych. Nowsze badania wykazały, że sygnalizacja BMP22, FGF-Ras23 i Hippo24,25 działa również w gruczole limfatycznym larw.
Cztery opisane tutaj testy hematopoetyczne larw opisują: 1) pomiar stężenia krążących hemocytów, zdefiniowanego jako liczba komórek na jednostkę objętości, 2) izolowanie i utrwalanie krążących hemocytów do immunohistochemii, 3) wizualizację komórek krystalicznych in vivo, oraz 4) preparowanie, naprawianie i montowanie gruczołów limfatycznych do immunohistochemii. Testy te mogą być wykorzystywane jako odczyty hematopoetyczne do oceny funkcji i regulacji szlaków sygnałowych w układzie krwiotwórczym larw. Chociaż metody te były już wcześniej stosowane w tej dziedzinie, dokumentacja wizualna tych testów rozpoczęła się dopieroniedawno 8,26-30. Kilka cytowanych tu publikacji jest pomocnymi źródłami opisującymi podobne metody i markery krwiotwórcze26,31-33. Dodatkowo Trol i Viking są użytecznymi markerami błony podstawnej gruczołów limfatycznych.

<table><tbody><tr><td>Tabletki PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>naczynie preparacyjne</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówek</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>silikonowa podkładka preparacyjna, wykonana z zestawu Sylgard 184</td><td>Krayden (dystrybuowany przez Fisher)</td><td>NC9644388 (numer katalogowy Fisher)</td><td>Wykonany na szalce Petriego poprzez zmieszanie składników zestawu elastomeru Sylgard zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr>mikroskop <tr><td>stereoskopowy</td><td>Morrell Instruments (dystrybutor firmy Nikon)</td><td>mna42000, mma36300</td><td>Modele Nikon SMZ1000 i SMZ645</td></tr><tr><td>chusteczki do tkanek</td><td>Kleszcze VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72700-DZ</td><td></td></tr><tr><td>pipeta p200</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory zliczania komórek hrabiny</td><td>Hemocytometr Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientific</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>trypanowa niebieska plama</td> Life <td>Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Rocky Mountain Biologicals</td><td>BSA-BSH-01K</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica osła</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>200 proof etanol</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>galusan N-propylu</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>VWR</td><td>EM-4750</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)</td><td>Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa Szkło</td><td></td> pokrywowe mikroskopu <td>Corning</td> 351143<td></td></tr><tr><td>, kwadrat 22 mm</td><td>Szkło</td> nakrywkowe mikroskopu Fisher <td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>, okrągłe 18 mm</td><td>Fisher</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>szklane szkiełka mikroskopowe</td><td>Termocykler Fisher</td><td>22-034-980</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>E950010037</td><td>Mastercycler EP Gradient S</td></tr><tr><td>probówki PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowa pipeta transferowa</td><td>Fisher</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencja mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager.Z1</td></tr></tbody></table>

metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw drosophila

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Istnieje wiele podobieństw między Drosophila a układami krwiotwórczymi ssaków, mimo że Drosophila nie posiada linii limfoidalnej, która charakteryzuje adaptacyjną odporność ssaków. Drosophila i hematopoeza ssaków występują w przestrzennie i czasowo odrębnych fazach, tworząc kilka linii komórek krwi. Oba systemy utrzymują rezerwuary komórek progenitorowych krwi, którymi można się rozwijać lub zastępować dojrzałe linie. Układ krwiotwórczy pozwala Drosophila i ssakom reagować i przystosowywać się do wyzwań immunologicznych. Co ważne, regulatory transkrypcji i szlaki sygnałowe, które kontrolują wytwarzanie, utrzymanie i funkcję układu krwiotwórczego, są zachowane od much do ssaków. Te podobieństwa pozwalają na wykorzystanie Drosophila do genetycznego modelowania rozwoju i chorób układu krwiotwórczego.
Tutaj szczegółowo opisujemy testy do badania układu krwiotwórczego larw Drosophila. W szczególności przedstawiamy metody pomiaru liczby i stężenia krwinek, wizualizacji określonej dojrzałej linii in vivo oraz przeprowadzania immunohistochemii na komórkach krwi w krążeniu i w narządzie krwiotwórczym. Testy te mogą ujawnić zmiany w ekspresji genów i procesach komórkowych, w tym sygnalizacji, przeżyciu, proliferacji i różnicowaniu, i mogą być wykorzystane do zbadania różnych pytań dotyczących hematopoezy. W połączeniu z narzędziami genetycznymi dostępnymi w Drosophila, testy te mogą być wykorzystywane do oceny układu krwiotwórczego po określonych zmianach genetycznych. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo opisane, testy te można również wykorzystać do zbadania wpływu zmian środowiskowych, takich jak infekcja lub dieta, na układ krwiotwórczy.

Stężenie krążących hemocytów
Liczba hemocytów wzrasta w miarę rozwoju larwalnego35. Aby zilustrować, że metoda ta wykrywa różnice w liczbie i stężeniu hemocytów, niezależnie od przyczyny biologicznej, zmierzono stężenia hemocytów u larw z opóźnionym i prawidłowym rozwojem. Utrata hormonu protorakikotropowego (ptth) poprzez genetyczną ablację neuronów produkujących ptth (ptth&gt;grim) powoduje opóźnienie rozwoju larwalneg...

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Ogólnym celem tych procedur jest analiza różnych komponentów układu krwiotwórczego Drosophila, ze szczególnym uwzględnieniem wypreparowania gruczołu limfy i jego montażu do immunohistochemii. Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hematopoezy Drosophila, w tym w zakresie wpływu zmian genetycznych lub środowiskowych na procesy takie jak przeżywalność, proliferacja, różnicowanie oraz sygnalizacja komórkowa linii krwiotwórczych.Główną zaletą tych technik jest to, że stosowane łącznie pomagają odróżnić specyficzne efekty, jakie poszczególne zmiany wywierają na złożone procesy podczas hematopoezy. Rozpocznij pobieranie hemolimfy, dodając 10 µL 1x PBS do probówki do mikrocentryfugi i umieszczając probówkę na lodzie. Następnie nanieś kroplę 10 µL 1x PBS na czystą podkładkę sekcyjną.Wybierz pojedynczą larwę i osusz ją, kładąc na chusteczce higienicznej, a następnie przenieś ją do kropli PBS na podkładce do sekcji. Za pomocą pęsety ostrożnie rozdarj i wywiń kutykulę, aby uwolnić hemolimfę, a następnie usuń pozostałości ciała. Za pomocą pipety pobierz hemolimfę z podkładki do sekcji.Dodaj hemolimfę do schłodzonej probówki do mikrowirówki z PBS i wymiesz

methods-to-examine-the-lymph-gland-and-hemocytes-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Osy pasożytnicze stanowią główną grupę naturalnych wrogów wielu owadów, w tym Drosophila melanogaster. Przedstawimy techniki rozmnażania tych pasożytów w gatunkach Drosophila spp. oraz zademonstrujemy sposób analizy ich wpływu na tkanki odpornościowe larw Drosophila.

Wprowadzenie do os w pasożytach Drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej

Ten film opisuje gruczoł limfatyczny Drosophila - główne miejsce hematopoezy u larw muchy - i pokazuje przykładowy protokół do preparowania i montowania narządu do immunohistochemii i obrazowania fluorescencyjnego.

Rozwarstwienie gruczołów limfatycznych larw: izolowanie narządu wytwarzającego hemocyty Drosophila

Molimimfa Drosophila służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, krążąc po całym ciele podczas stadium larwy i dorosłego osobnika. Ten film opisuje protokół pobierania larw hemolimfy w celu ilościowego określenia krążących komórek.

Przerwanie naskórka: metoda zbierania hemolimfy z larw Drosophila

Ten film demonstruje test zaburzeń hemocytów, oceniając ponowne przyleganie hemocytów do kieszeni krwiotwórczych larw Drosophila. Zakłócenia mechaniczne uwalniają rezydujące hemocyty, podnosząc liczbę krążących hemocytów. Po wyzdrowieniu potwierdza się ponowne przyleganie rezydentnych hemocytów, co ilustruje odwracalność.

Test zaburzeń hemocytów w celu oceny readhezji hemocytów do kieszonek krwiotwórczych

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Krwinki Drosophila, czyli hemocyty, krążą między miejscami rezydentnymi a krążeniem.  U larwy hemocyty rezydentne (siedzące) lokalizują się w mikrośrodowiskach indukcyjnych, kieszeniach krwiotwórczych, podczas gdy krążące hemocyty poruszają się swobodnie w hemolimfie. Celem tego protokołu jest standaryzowana izolacja i kwantyfikacja tych dwóch, behawioralnie odrębnych, ale wymiennych populacji hemocytów.

Oznaczanie populacji krwinek larwy Drosophila melanogaster

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

Poznaj metody analizy układu krwiotwórczego Drosophila z naciskiem na preparowanie gruczołów limfatycznych i immunohistochemię. Techniki te pozwalają badać wpływ czynników genetycznych i środowiskowych na hematopoezę.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów