Znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi przy użyciu magnetycznych kulek białka A i białka G

Ogólnym celem tej metody jest znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi z oczyszczonych próbek lub bezpośrednio z pożywki komórkowej przy użyciu magnetycznych kulek z białkiem A lub G. Metoda ta może być wykorzystana do optymalizacji chemii znakowania nawet niewielkich ilości przeciwciał znajdujących się w pożywce komórkowej, co prowadzi do lepszego zastosowania tych przeciwciał w dalszych etapach analiz.

Głównymi zaletami tej techniki są brak konieczności oczyszczania przeciwciał, możliwość zastosowania chemii aminowej lub tiolowej oraz fakt, że metoda ta może być wykonywana automatycznie lub manualnie. Rozpocznij od jednorodnego resuspendowania kulek poprzez delikatne potrząsanie. Następnie przenieś 50 µL kulek do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.

Następnie należy umieścić probówkę w statywie magnetycznym. Po 10 sekundach ostrożnie zastąpić bufor do przechowywania 250 µL buforu do wiązania przeciwciał i dokładnie wymieszać kuleczki. Po kolejnych 10 sekundach ostrożnie zastąpić bufor do wiązania 1 mL odpowiedniego przeciwciała.

Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji umieść probówki ponownie na magnesie i usuń nadsącz, gdy kuleczki przemieszczą się do ścianek probówki. Następnie przepłucz mieszaninę kuleczek i przeciwciał, wykonując dwa 10-sekundowe płukania przy użyciu 250 µl buforu do płukania wiążącego przeciwciała na każde płukanie.

Aby oznakować przeciwciała z wykorzystaniem chemii aminowej, po drugim przemyciu należy zastąpić bufor do płukania 100 µL buforu do koniugacji aminowej i dodać 2,5 µL świeżo przygotowanego barwnika reaktywnego z grupą aminową na każde 100 µg przeciwciał. Próbkę należy mieszać w wstrząsarze wierzchołkowym przez 60 minut w temperaturze pokojowej, aby utrzymać kuleczki w zawiesinie podczas znakowania. Następnie probówkę należy umieścić ponownie na magnesie na 10 sekund i usunąć nadsącz.

Przemyj kuleczki dwukrotnie buforem do przemywania wiążącym przeciwciała, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie zastąp bufor do przemywania 50 µl buforu elucyjnego i mieszaj kuleczki przez pięć minut. Umieść probówkę ponownie na magnesie na 10 sekund i przenieś eluowane przeciwciało do nowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 5 µl buforu neutralizującego.

Przeprowadź elucję przeciwciała jeszcze raz, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, pobierając eluaty. Następnie zmierz absorbancję koniugatu przeciwciało-barwnik przy 280 nanometrach oraz przy lambda max dla danego barwnika. Aby znakować przeciwciała z wykorzystaniem chemii tiolowej, po drugim przemyciu zastąp bufor do płukania 250 mikrolitrami buforu do koniugacji tiolowej i wymieszaj kuleczki, delikatnie pipetując.

Po 10 sekundach przemyj kuleczki dwukrotnie buforem do przemywania wiążącym przeciwciała. Następnie zastąp bufor do przemywania 100 µL buforu do koniugacji tiolowej i dodaj DTT do stężenia końcowego 2,5 mM. Mieszaj kuleczki przez kolejne 60 minut.

Następnie umieść kulki ponownie w magnesie na 10 sekund i odlej bufor. Dalej, dodaj do kulek 250 microliters buforu do koniugacji tiolowej, delikatnie mieszając. Po 10 sekundach przemyj kulki dwukrotnie buforem do przemywania wiążącym przeciwciała, zastępując drugą porcję buforu do przemywania 100 microliters świeżego buforu do koniugacji tiolowej.

Następnie należy dodać 2,5 µL świeżo przygotowanego barwnika reaktywnego wobec grup tiolowych na każde 100 µg przeciwciała i mieszać kulki przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji probówkę należy ponownie umieścić w magnesie na 10 sekund. Następnie supernatant należy zastąpić 250 µL świeżego buforu do koniugacji tiolowej, delikatnie mieszając.

Po 10 sekundach przemyj kulki dwukrotnie. Następnie zastąp bufor płuczący 50 µL buforu elucyjnego i przeprowadź dwukrotną elucję sprzężonego przeciwciała, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie zmierz absorbancję koniugatu przeciwciało-barwnik przy 280 nm oraz przy lambda max dla danego barwnika.

Silne powinowactwo przeciwciał do białka G, wysoka siła przyciągania magnesu do kulek oraz optymalizacja metody przed oczyszczaniem na kulkach skutkują łącznie minimalną utratą przeciwciał podczas reakcji znakowania, co potwierdza efektywne odzyskanie trzech różnych izotypów przeciwciał mysich po fluorescencyjnym podwójnym znakowaniu w porównaniu do zwykłego oczyszczania. Odzysk ten jest również widoczny na żelach barwionych Coomassie, gdzie niskie właściwości wiązania niespecyficznego magnetycznych kulek z białkiem G skutkują obecnością wysokiej czystości podwójnie znakowanych fluorescencyjnie łańcuchów ciężkich i lekkich. Znakowanie na kulkach z magnetycznym białkiem A jest również kompatybilne z wieloma barwnikami fluorescencyjnymi, co zapewnia wysoki odzysk i korzystne stosunki barwnika do przeciwciała.

Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch do trzech godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Pozwala to na ręczną obróbkę wielu próbek lub wykorzystanie platformy zautomatyzowanej w celu zwiększenia przepustowości. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o stałym utrzymywaniu kulek magnetycznych w zawiesinie.

Wybierz odpowiednią objętość kulek magnetycznych dla próbki. Następnie zoptymalizuj ilość barwnika fluorescencyjnego dla badanego przeciwciała. Po przeprowadzeniu tej procedury należy przetestować funkcjonalność znakowanych przeciwciał, wykorzystując odpowiednie testy biologiczne, takie jak ELISA, FACS lub testy komórkowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak znakować oczyszczone i nieoczyszczone przeciwciała znacznikami fluorescencyjnymi lub innymi małymi cząsteczkami, takimi jak biotyna lub leki cytotoksyczne, przy użyciu magnetycznych kulek z białkiem A lub G.