Name: Znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi przy użyciu magnetycznych kulek białka A i białka G (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę znakowania przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi bezpośrednio z pożywki komórkowej przy użyciu magnetycznych kulek białka A lub G. Technika umożliwia optymalizację chemii etykietowania małych ilości przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Wychwytywanie przeciwciał na magnetycznych kulkach białka A o dużej pojemności lub magnetycznych kulek białkowych G
<ol>
	<li>Równomiernie ponownie zawiesić koraliki magnetyczne poprzez delikatne potrząsanie. Utrzymuj jednolitą zawiesinę podczas porcjowania koralików.</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny perełkowej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund. Ostrożnie wyjmij bufor pamięci masowej.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu wiążącego przeciwciała.</li>
	<li>Wymieszaj i umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund. Ostrożnie wyjmij bufor wiążący.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml próbki zawierającej 50-100 μg przeciwciała do kulek. Próbki mogą być oczyszczonymi przeciwciałami lub przeciwciałami w pożywkach komórkowych.</li>
	<li>Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end.</li>
	<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i usuń supernatant.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu wiążącego/przemłudzającego przeciwciała i wymieszać. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund i wyjmij bufor wiążący/myjący. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.</li>
	<li>Przejdź do sekcji 2, aby znakować przeciwciała przy użyciu chemii aminowej lub do sekcji 3, aby znakować przeciwciała przy użyciu chemii tiolowej.</li>
</ol>
2. Znakowanie przeciwciał za pomocą chemii aminowej
<ol>
	<li>Przeciwciało sprzężone
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl buforu koniugacyjnego amin do kulek.</li>
		<li>Rozpuścić aminowo-reagujące barwniki fluorescencyjne (AlexaFluor 532-SE) w stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 1,0 mg barwnika. Wymieszaj przez wirowanie. Przygotuj to rozwiązanie tuż przed użyciem.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl barwnika reagującego aminami na 100 μg przeciwciała. 
		Uwaga: Zazwyczaj zalecany jest 5-20 molowy nadmiar barwnika reaktywnego. Jednak ilość reaktywnego barwnika dodawanego do reakcji musi być empirycznie zoptymalizowana w zależności od pożądanego stosunku barwnika do przeciwciała i wewnętrznych właściwości przeciwciał.</li>
		<li>Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.</li>
		<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i usuń supernatant.</li>
		<li>Dodać 250 μl buforu wiążącego/przemłudzającego przeciwciała i wymieszać. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund. Usuń i wyrzuć bufor wiążący/myjący. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie przeciwciał
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl buforu elucyjnego do kulek.</li>
		<li>Mieszaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą miksera wirowego lub miksera typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.</li>
		<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń eluowaną próbkę i przenieś do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 5 μl buforu neutralizacyjnego.</li>
		<li>Powtórzyć proces jeszcze raz i połączyć eluowane próbki.</li>
		<li>Określić ilościowo stężenie przeciwciał i stosunek barwnika do przeciwciała, jak opisano w sekcji 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znakowanie przeciwciał za pomocą chemii tiolowej
<ol>
	<li>Redukcja przeciwciał
	<ol>
		<li>Dodać 250 μl tiolowego buforu koniugacyjnego i wymieszać. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń i wyrzuć bufor. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
		<li>Dodać 100 μl tiolowego buforu koniugacyjnego.</li>
		<li>Dodać ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 2,5 mM.</li>
		<li>Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.</li>
		<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i wyrzuć bufor.</li>
		<li>Dodać 250 μl tiolowego buforu koniugacyjnego i wymieszać. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń i wyrzuć bufor. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.</li>
		<li>Dodać 100 μl tiolowego buforu koniugacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciwciało sprzężone
	<ol>
		<li>Rozpuścić barwnik reagujący z tiolem w stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 μl DMSO do 1,0 mg barwnika. Wymieszaj przez wirowanie. Przygotuj to rozwiązanie tuż przed użyciem.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl barwnika reagującego z tiolem na 100 μg przeciwciała. 
		Uwaga: Zazwyczaj zalecany jest 5-20 molowy nadmiar barwnika reaktywnego. Jednak ilość reaktywnego barwnika dodawanego do reakcji musi być empirycznie zoptymalizowana w zależności od pożądanego stosunku barwnika do przeciwciała i wewnętrznych właściwości przeciwciał.</li>
		<li>Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.</li>
		<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i usuń supernatant.</li>
		<li>Dodać 250 μl tiolowego buforu koniugacyjnego i wymieszać. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund i wyjmij bufor. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciwciało Elute
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl buforu elucyjnego do kulek.</li>
		<li>Mieszaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą miksera wirowego lub miksera typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.</li>
		<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń eluowaną próbkę i przenieś do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 5 μl buforu neutralizacyjnego.</li>
		<li>Powtórzyć proces jeszcze raz i połączyć eluowane próbki.</li>
		<li>Określić ilościowo stężenie przeciwciał i stosunek barwnika do przeciwciała, jak opisano w sekcji 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oblicz stosunek barwnika do przeciwciała
<ol>
	<li>Zmierzyć absorbancję koniugatu przeciwciało-barwnik przy 280 nm (A280) i przy λmax dla barwnika (Amax).</li>
	<li>Oblicz stężenie przeciwciał: 
	Stężenie przeciwciał (mg / ml) = A280 - (Amax × CF) / 1,4 
	gdzie CF = współczynnik korekcyjny barwnika (dostarczony przez producenta).</li>
	<li>Oblicz stosunek barwnika do przeciwciał: 
	Stosunek barwnika do przeciwciał (DAR) = (Amax × 150 000)/Stężenie Ab (mg/ml) × εbarwnik 
	gdzie, εbarwnik = współczynnik ekstynkcji barwnika przy jego maksymalnej absorbancji i masie cząsteczkowej przeciwciała = 150 000 Da.</li>
</ol>

<ol><li>Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).</li>
<li>Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeled+antigens+and+antibodies%3A+the+evolution+of+magic+markers+and+magic+bullets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).</li>
<li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+antibodies+as+diagnostic+imaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).</li>
<li>Cunningham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+flow+cytometry+and+fluorescent+probes+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
<li>Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptavidin-biotin+technology%3A+improvements+and+innovations+in+chemical+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).</li>
<li>Kraeber-Bodere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoconjugates+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer.</a> Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).</li>
<li>Leal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+modality+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).</li>
<li>Drachman, J. G., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+the+chemistry+behind+empowering+antibodies+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. 380-382 (1996).</li>
<li>Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+three+different+fluorophore+antibody+conjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).</li>
<li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-labeled+antibodies%3A+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li>
<li>Isa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+system+to+identify+small+molecules+that+induce+internalization+and+degradation+of+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).</li>
<li>Liao-Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+antibody+internalization+with+novel+monoclonal+antibodies+against+Alexa+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores.</a> PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).</li>
<li>Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+for+Internalizing+Antibodies+by+Homogeneous+Fluorescence+Imaging+of+a+pH-Activated+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe.</a> J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).</li>
<li>Nath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+plate+based+antibody+internalization+assay+using+pH+sensor+fluorescent+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye.</a> J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).</li>
<li>Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+reproducible+fluorescent+labeling+of+small+amounts+of+antibodies+on+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase.</a> J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).</li>
<li>Strachan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+biotinylation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Solid-phase biotinylation of antibodies.</a> J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).</li>
<li>Dezfouli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+bead+assisted+labeling+of+antibodies+at+nanogram+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale.</a> Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).</li>
<li>Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-bead+antibody-small+molecule+conjugation+using+high-capacity+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads.</a> J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).</li>
<li>Lund, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+variation+in+binding+of+Protein+A+and+Protein+G+to+immunoglobulin+type+G+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry.</a> J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+techniques+for+the+isolation+and+purification+of+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomagn+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides.</a> Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).</li>
<li>Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer.</a> Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).</li>
<li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li>
<li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding%2C+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami korporacji Promega.

Celem tego badania było opracowanie metody znakowania przeciwciał, obecnych w pożywkach komórkowych w niskich stężeniach, różnymi małymi cząsteczkami. Taka metoda pozwoli na znakowanie dużej liczby przeciwciał na wczesnych etapach odkrywania przeciwciał małymi cząsteczkami i przeprowadzanie badań przesiewowych przy użyciu testu o znaczeniu biologicznym. Jednym z takich testów jest test internalizacji przeciwciał za pośrednictwem receptora, w którym internalizacja może się różnić między przeciwciałami, nawet przy podobnym...

Przeciwciała znakowane małymi cząsteczkami są prawdopodobnie najczęściej używanymi odczynnikami w biologii1,2. Przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i biotyną są szeroko stosowane między innymi w obrazowaniu, testach immunologicznych, cytometrii przepływowej, plamach zachodnich i immunoprecypitacji3-6. Przeciwciała znakowane radioizotopowo3,7 znajdują szerokie zastosowanie w obrazowaniu i terapii, przeciwciała znakowane lekami cytotoksycznymi (ADC) oferują nowe możliwości leczenia nowotworów, a dwa ADC zostały już zatwierdzone do użytku terapeutycznego8. Pomimo ich szerokiego zastosowania, metody znakowania przeciwciał pozostały zaskakująco niezmienione i zazwyczaj obejmują wiele reakcji i etapów odsalania9-12. Metody roztworów działają bardzo dobrze w przypadkach, gdy tylko kilka przeciwciał musi być znakowanych i są dostępne w postaci wysoce oczyszczonej, w wysokim stężeniu i w wystarczających ilościach. Jednak w przypadku nowszych zastosowań, takich jak ADC, istnieje potrzeba znakowania przeciwciał na wczesnym etapie hybrydomy, aby można je było przebadać pod kątem biologicznie istotnych właściwości, na przykład internalizacji przeciwciał za pośrednictwem receptora13-16. Na etapie hybrydoma objętość próbek jest ograniczona, przeciwciała ulegają ekspresji w niskich stężeniach, a liczba próbek jest duża, dlatego metody znakowania oparte na roztworach nie są odpowiednie.
Aby uprościć i poprawić wydajność tradycyjnych metod znakowania przeciwciał, zaproponowano kilka alternatywnych podejść17,18. Jednym ze sposobów jest użycie niemagnetycznych kulek powinowactwa do białka A upakowanych w małe kolumny w celu wychwycenia przeciwciał, a następnie reakcji znakowania i elucji znakowanego i oczyszczonego białka. Metoda ta może być stosowana do znakowania przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej, jednak użycie kolumn może być pracochłonne. Niedawno doniesiono o metodzie opartej na kulkach magnetycznych19 , która eliminuje użycie kolumn i poprawia przepustowość, ale ze względu na ograniczoną zdolność wiązania przeciwciał przez kulki, można było znakować tylko nanogramy do małych mikrogramów przeciwciał.
Niedawno opracowaliśmy i użyliśmy magnetycznych kulek białka A i G o dużej pojemności (>20 mg ludzkiej IgG/ml osadzonych kulek) do oznaczania przeciwciał obecnych w pożywkach komórkowych małymi cząsteczkami>20. Duża pojemność kulek pozwala na wygodne znakowanie dziesiątek do setek mikrogramów przeciwciał, a szybka reakcja magnetyczna kulek upraszcza obsługę i przetwarzanie dużej liczby próbek równolegle. Używając barwników fluorescencyjnych jako substytutów małych cząsteczek, pokazujemy, że metoda jest kompatybilna z chemią znakowania amin i tioli oraz oferuje wysoki odzysk znakowanych i bardzo czystych przeciwciał.
Ten protokół i towarzyszący mu film opisują znakowanie na koralikach mysich przeciwciał obecnych w pożywkach komórkowych za pomocą magnetycznych kulek białka A i białka G. Protokół jest podzielony na cztery sekcje: Sekcja 1 opisuje wychwytywanie przeciwciał na kulce z próbek biologicznych. Po wychwyceniu, znakowanie przeciwciał barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii aminowej lub chemii tiolowej opisano odpowiednio w sekcjach 2 i 3. Wreszcie w sekcji 4 opisano metodę obliczania stężenia przeciwciał i stosunku barwnika do przeciwciał.

<table><tbody><tr><td>Kulki białka Magne A</td><td>Promega Corporation</td><td>&nbsp; G8781</td><td></td></tr><tr><td>Kulki białkowe Magne</td><td>G Promega Corporation&nbsp;</td><td>&nbsp; G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (ester sukcynimidylu)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimid)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina-ME (Maleimid)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi przy użyciu magnetycznych kulek białka a i białka g

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Przeciwciała oznaczone małymi cząsteczkami, takimi jak barwniki fluorescencyjne, leki cytotoksyczne i radioaktywne znaczniki, są niezbędnymi narzędziami w badaniach biomedycznych, immunodiagnostyce, a ostatnio także jako środki terapeutyczne. Tradycyjne metody znakowania przeciwciał małymi cząsteczkami wymagają oczyszczonych przeciwciał o stosunkowo wysokim stężeniu, obejmują wiele etapów dializy i mają ograniczoną przepustowość. Jednak w kilku zastosowaniach, w tym w dziedzinie koniugatów przeciwciał i leków (ADC), nowe metody, które umożliwią znakowanie przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej, skorzystają na tym fakcie. Takie metody mogą pozwolić na badanie przesiewowe przeciwciał w testach istotnych biologicznie, na przykład w teście internalizacji przeciwciał za pośrednictwem receptora w przypadku ADC. W tym miejscu opisujemy metodę (metoda na kulkach), która umożliwia znakowanie niewielkich ilości przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej. Podejście to wykorzystuje magnetyczne kulki powinowactwa do białek A i G o dużej pojemności do wychwytywania przeciwciał z pożywki komórkowej, a następnie znakowania małymi cząsteczkami przy użyciu chemii aminowej lub tiolowej, a następnie elucji znakowanych przeciwciał. Biorąc barwniki fluorescencyjne jako substytuty małych cząsteczek, demonstrujemy znakowanie na kulkach trzech różnych mysich przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej przy użyciu chemii znakowania aminowego i tiolowego. Wysokie powinowactwo wiązania przeciwciał do białka A i białka G zapewnia wysoki odzysk, a także wysoką czystość znakowanych przeciwciał. Ponadto zastosowanie kulek magnetycznych umożliwia ręczną obsługę wielu próbek, co znacznie poprawia wydajność etykietowania.

Schemat znakowania przeciwciał małymi cząsteczkami przy użyciu magnetycznych kulek z wysoką pojemnością białka A i białka G przedstawiono na Rysunku 1. Przeciwciała uchwycone na magnetycznych kuleczkach z białkiem G mogą być znakowane małymi cząsteczkami, na przykład barwnikami fluorescencyjnymi, z wykorzystaniem chemii aminowej, która znakuje aminy pierwszorzędowe aminokwasów lizyny, lub chemii tiolowej, która znakuje zredukowane grupy tiolowe w regionie zawiasowym przec...

Metoda znakowania przeciwciał na koralikach z małymi cząsteczkami umożliwia znakowanie niewielkiej ilości przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej. Metoda ta jest kompatybilna z chemią amin i tioli i może obsługiwać wiele próbek równolegle, ręcznie lub przy użyciu zautomatyzowanych platform.

Znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi przy użyciu magnetycznych kulek białka A i białka G

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Ogólnym celem tej metody jest znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi z oczyszczonych próbek lub bezpośrednio z pożywki komórkowej przy użyciu magnetycznych kulek z białkiem A lub G. Metoda ta może być wykorzystana do optymalizacji chemii znakowania nawet niewielkich ilości przeciwciał znajdujących się w pożywce komórkowej, co prowadzi do lepszego zastosowania tych przeciwciał w dalszych etapach analiz.Głównymi zaletami tej techniki są brak konieczności oczyszczania przeciwciał, możliwość zastosowania chemii aminowej lub tiolowej oraz fakt, że metoda ta może być wykonywana automatycznie lub manualnie. Rozpocznij od jednorodnego resuspendowania kulek poprzez delikatne potrząsanie. Następnie przenieś 50 µL kulek do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.Następnie należy umieścić probówkę w statywie magnetycznym. Po 10 sekundach ostrożnie zastąpić bufor do przechowywania 250 µL buforu do wiązania przeciwciał i dokładnie wymieszać kuleczki. Po kolejnych 10 sekundach ostrożnie zastąpić bufor do wiązania 1 mL odpowiedniego przeciwciała.Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji umieść probówki ponownie na magnesie i usuń nadsącz, gdy kuleczki przemieszczą się do ścianek probówki. Następnie przepłucz mieszaninę kuleczek i przeciwciał, wykonując dwa 10-sekundowe płukania przy użyciu 250 µl buforu do płukania wiążącego przeciwciała na każde płukanie.Aby oznakować przeciwciała z wykorzystaniem chemii aminowej, po drugim przemyciu należy zastąpić bufor do płukania 100 µL buforu do koniugacji aminowej i dodać 2,5 µL świeżo przygotowanego barwnika reaktywnego z grupą aminową na każde 100 µg przeciwciał. Próbkę należy mieszać w wstrząsarze wierzchołkowym przez 60 minut w temperaturze pokojowej, aby utrzymać kuleczki w zawiesinie podczas znakowania. Następnie probówkę należy umieścić ponownie na magnesie na 10 sekund i usunąć nadsącz.Przemyj kuleczki dwukrotnie buforem do przemywania wiążącym przeciwciała, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie zastąp bufor do przemywania 50 µl buforu elucyjnego i mieszaj kuleczki przez pięć minut. Umieść probówkę ponownie na magnesie na 10 sekund i przenieś eluowane przeciwciało do nowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 5 µl buforu neutralizującego.Przeprowadź elucję przeciwciała jeszcze raz, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, pobierając eluaty. Następnie zmierz absorbancję koniugatu przeciwciało-barwnik przy 280 nanometrach oraz przy lambda max dla danego barwnika. Aby znakować przeciwciała z wykorzystaniem chemii tiolowej, po drugim przemyciu zastąp bufor do płukania 250 mikrolitrami buforu do koniugacji tiolowej i wymieszaj kuleczki, delikatnie pipetując.Po 10 sekundach przemyj kuleczki dwukrotnie buforem do przemywania wiążącym przeciwciała. Następnie zastąp bufor do przemywania 100 µL buforu do koniugacji tiolowej i dodaj DTT do stężenia końcowego 2,5 mM. Mieszaj kuleczki przez kolejne 60 minut.Następnie umieść kulki ponownie w magnesie na 10 sekund i odlej bufor. Dalej, dodaj do kulek 250 microliters buforu do koniugacji tiolowej, delikatnie mieszając. Po 10 sekundach przemyj kulki dwukrotnie buforem do przemywania wiążącym przeciwciała, zastępując drugą porcję buforu do przemywania 100 microliters świeżego buforu do koniugacji tiolowej.Następnie należy dodać 2,5 µL świeżo przygotowanego barwnika reaktywnego wobec grup tiolowych na każde 100 µg przeciwciała i mieszać kulki przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji probówkę należy ponownie umieścić w magnesie na 10 sekund. Następnie supernatant należy zastąpić 250 µL świeżego buforu do koniugacji tiolowej, delikatnie mieszając.Po 10 sekundach przemyj kulki dwukrotnie. Następnie zastąp bufor płuczący 50 µL buforu elucyjnego i przeprowadź dwukrotną elucję sprzężonego przeciwciała, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie zmierz absorbancję koniugatu przeciwciało-barwnik przy 280 nm oraz przy lambda max dla danego barwnika.Silne powinowactwo przeciwciał do białka G, wysoka siła przyciągania magnesu do kulek oraz optymalizacja metody przed oczyszczaniem na kulkach skutkują łącznie minimalną utratą przeciwciał podczas reakcji znakowania, co potwierdza efektywne odzyskanie trzech różnych izotypów przeciwciał mysich po fluorescencyjnym podwójnym znakowaniu w porównaniu do zwykłego oczyszczania. Odzysk ten jest również widoczny na żelach barwionych Coomassie, gdzie niskie właściwości wiązania niespecyficznego magnetycznych kulek z białkiem G skutkują obecnością wysokiej czystości podwójnie znakowanych fluorescencyjnie łańcuchów ciężkich i lekkich. Znakowanie na kulkach z magnetycznym białkiem A jest również kompatybilne z wieloma barwnikami fluorescencyjnymi, co zapewnia wysoki odzysk i korzystne stosunki barwnika do przeciwciała.Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch do trzech godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Pozwala to na ręczną obróbkę wielu próbek lub wykorzystanie platformy zautomatyzowanej w celu zwiększenia przepustowości. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o stałym utrzymywaniu kulek magnetycznych w zawiesinie.Wybierz odpowiednią objętość kulek magnetycznych dla próbki. Następnie zoptymalizuj ilość barwnika fluorescencyjnego dla badanego przeciwciała. Po przeprowadzeniu tej procedury należy przetestować funkcjonalność znakowanych przeciwciał, wykorzystując odpowiednie testy biologiczne, takie jak ELISA, FACS lub testy komórkowe.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak znakować oczyszczone i nieoczyszczone przeciwciała znacznikami fluorescencyjnymi lub innymi małymi cząsteczkami, takimi jak biotyna lub leki cytotoksyczne, przy użyciu magnetycznych kulek z białkiem A lub G.

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Ten film demonstruje metodę wykrywania szczepów cyjanobakterii w próbce środowiskowej za pomocą mikromatrycy przeciwciał. Próbki zawierające różne bakterie wchodzą w interakcje z wydrukowanymi przeciwciałami, a barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-cyjanobakterii znakowanymi fluoroforem ujawnia obecność specyficznych szczepów cyjanobakterii poprzez fluorescencję w różnych miejscach.

Technika wykrywania szczepów sinic za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Zgłaszamy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, aby bezpośrednio zobrazować i określić ilościowo ruch fluorescencyjnie znakowanej, w pełni zrekonstytuowanej helikazy Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) na liniowych cząsteczkach DNA utrzymywanych w miejscu w pułapce optycznej.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj metodę znakowania przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi bezpośrednio z pożywki komórkowej przy użyciu magnetycznych kulek białka A lub G. Technika umożliwia optymalizację chemii etykietowania małych ilości przeciwciał.

Znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi przy użyciu magnetycznych kulek białka A i białka G

Przeglądaj więcej filmów