Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego
17 września 2016
Opisujemy protokół kolorymetrycznego wykrywania E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego, który wykorzystuje DNA rozszczepiające RNA, ureazę i kulki magnetyczne.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest zademonstrowanie prostego, zmodyfikowanego papierka lakmusowego do wykrywania bakterii. Metoda ta opisuje, w jaki sposób enzym DNA rozszczepiający RNA aktywowany przez E. coli może być sprzężony z platformą transdukcji sygnału opartą na ureazie w celu wygenerowania zmiany koloru w odpowiedzi na E. coli. Dwie główne zalety tej techniki to prostota testu i możliwość jego zastosowania do innych enzymów DNA reagujących na analit i rozszczepiających RNA.
Procedurę zademonstrują Seperh Manchehry i Dingran Chang, doktoranci z laboratorium dr Yingfu Li na Uniwersytecie McMaster. Po przygotowaniu odczynników i zgodnie z protokołem tekstowym należy przygotować roztwór podstawowy 4-cykloheksano-1-karboksylanu sukcynimidylu lub SMCC, rozpuszczając jeden miligram SMCC w 676 mikrolitrach DMSO. Wiruj i umieść na lodzie do użycia.
Rozpuść jeden miligram ureazy w mililitrze 1x PBS, a także umieść go na lodzie do czasu użycia. Aby zsyntetyzować ureazę DNA lub UrDNA, dodaj 10 mikrolitrów 100 mikromolowych LD1 do 2,5 mililitrowej probówki do mikrofuge. Następnie dodaj 140 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i 40 mikrolitrów 10x PBS i wiruj.
Następnie dodaj 80,5 mikrolitrów bulionu SMCC i 159,5 mikrolitrów DMSO. Następnie ponownie zwiruj i użyj wirówki stołowej, aby krótko odwirować. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze lub bloku grzewczym przez 60 minut.
Po inkubacji dodaj do probówki 200 mikrolitrów 1x PBS, 60 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu i 1,5 mililitra zimnego 100% etanolu. Wymieszać przez wirowanie i inkubować reakcję w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. Odwirować roztwór w temperaturze 20 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.
Następnie usuń supernatant i wysusz osad w próżni. Do wysuszonego osadu dodać 400 mikrolitrów bulazy ureazy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Przenieść 200 mikrolitrów surowego koniugatu do wstępnie umytej odśrodkowej kolumny filtracyjnej o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej.
Odwirować kolumnę przy 14 000 g przez pięć minut. Przenieść pozostałe 200 mikrolitrów surowego koniugatu do kolumny i odwirować pod ciśnieniem 14 000 g przez pięć minut. Następnie wyjmij kolumnę i umieść ją do góry nogami w nowej dwumililitrowej probówce do zbierania mikrofugów.
Odwirować odwróconą kolumnę i probówkę o ciśnieniu 1 000 g przez dwie minuty. Po wyjęciu probówki zbiorczej dodać 30 mikrolitrów 1x PBS do kolumny odśrodkowej, aby umyć membranę w celu dodatkowego odzysku koniugatów. Ponownie odwróć kolumnę i umieść ją z powrotem w probówce zbiorczej.
Odwirować kolumnę przy ciśnieniu 1 000 g przez dwie minuty. Wyjmij i wyrzuć kolumnę. Przechowuj UrDNA w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.
Aby złożyć aktywowany przez E. coli DNAzyme lub EC1 i UrDNA na kulkach magnetycznych, dobrze wymieszaj materiał z kulek magnetycznych i przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny kulek do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofugi. Następnie umieść rurkę na magnetycznym uchwycie stojaka, aby odizolować koraliki. Usunąć supernatant przez pipetowanie i dodać 150 mikrolitrów buforu wiążącego (BB) do probówki.
Wyjmij rurkę z uchwytu i ostrożnie postukaj w rurkę, aby ponownie zawiesić koraliki w jednorodnym roztworze. Po powtórzeniu płukania BB jeszcze dwa razy z kulkami w zawiesinie z BB, dodać 10 mikrolitrów 10 mikromolowych EC1. Ostrożnie wymieszaj, stukając w rurkę.
Inkubować roztwór, delikatnie wstrząsając przez 30 minut. Aby uniknąć agregacji kulek, stukaj w rurkę co dwie do trzech minut. Następnie umieść probówkę do mikrofuge z powrotem na stojaku magnetycznym, aby odizolować kulki i usunąć supernatant przez pipetowanie.
Następnie użyj 150 mikrolitrów BB, aby trzykrotnie umyć koraliki. Po zakończeniu mycia zawiesić kulki w sumie 150 mikrolitrach BB.To tym roztworze, dodać 15 mikrolitrów UrDNA i podgrzać próbkę w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i inkubować przez dwie godziny. Umieść probówkę do mikrofuge z powrotem na stojaku magnetycznym, aby odizolować kulki i usunąć supernatant przez pipetowanie.
Dodaj 100 mikrolitrów buforu reakcyjnego lub RB, a następnie wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ostrożnie ponownie zawieś kulki. Po przygotowaniu komórek E. coli zgodnie z protokołem tekstowym, należy wstępnie umyć 1,5-mililitrową probówkę do mikrofuge, dodając i wirując 100 mikrolitrów RB. Następnie wyrzuć bufor. Dodaj 15 mikrolitrów zmontowanego EC1 do umytej probówki, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odessaj supernatant.
Wyjmij rurkę ze stojaka, dodaj 100 mikrolitrów RB i ostrożnie ponownie zawieś koraliki magnetyczne. Po dwukrotnym umyciu kulek przez RB i usunięciu RB, dodaj 10 mikrolitrów próbki E.coli do probówki i delikatnie wymieszaj zawartość, stukając w probówkę. Następnie inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez godzinę.
Po inkubacji dodaj 90 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i umieść probówkę na stojaku magnetycznym. Po około trzech minutach separacji magnetycznej ostrożnie przenieś 85 mikrolitrów supernatantu do probówki o pojemności 0,5 mililitra. Bardzo ważne jest, aby ostrożnie pipetować roztwór, nie pobierając żadnych kulek magnetycznych.
Te koraliki są naładowane ureazą i generują fałszywie dodatni sygnał. Dodaj 15 mikrolitrów 0,04% czerwieni fenolowej i 100 mikrolitrów roztworu substratu. Następnie rób zdjęcia w określonych odstępach czasu, aby zarejestrować zmianę koloru.
Kolor początkowy papierka lakmusowego musi być żółty, odzwierciedlający pH roztworu poniżej 5,5. W razie potrzeby początkowe pH papierka lakmusowego można dostosować za pomocą słabego buforu, takiego jak jeden milimolowy bufor octanu sodu o pH pięć. Rysunek ten przedstawia wyniki bakteryjnego testu lakmusowego, w którym jako DNAzyme EC1 użyto aktywowanego przez E. coli DNAzyme EC1, a jako wskaźnika pH użyto czerwieni fenolowej.
Jak pokazuje brak zmiany koloru przy braku E. coli, EC1 jest wysoce specyficzny i wykazuje minimalną aktywność w stosunku do innych bakterii. Głębokość zmiany koloru zależy zarówno od liczby komórek E. coli użytych w etapie aktywacji DNAzyme, jak i od czasu przeznaczonego na etap hydrolizy mocznika. Większa liczba komórek E. coli powoduje silniejszą zmianę koloru, a dłuższy czas hydrolizy mocznika pozwala na wykrycie mniejszej liczby komórek.
Ten wykres przedstawia zmianę pH monitorowaną za pomocą ręcznego pH-metru. Obecność od 10 do 7 komórek E. coli powodowała stopniowy wzrost pH o trzy jednostki w ciągu 10 minut. W przeciwieństwie do tego, brak E. coli nie powodował wykrywalnych zmian pH w tych samych warunkach.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ureaza jest bardzo aktywna, a złe mycie lub zanieczyszczenie doprowadzi do fałszywego alarmu. Zgodnie z tą procedurą, metodę tę można przeprowadzić w celu zbadania na obecność E. coli w bardziej odpowiednich warunkach, takich jak badanie jakości wody w środowisku.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skorzystać z prostego papierka lakmusowego do testowania E.coli. Nie zapominaj, że ten test może być używany do wykrywania patogennej E. coli, która jest niezwykle niebezpieczna. Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek testów na obecność bakterii chorobotwórczych należy przejść szkolenie w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prosty, zmodyfikowany test lakmusowy do wykrywania bakterii E. coli. Metoda wykorzystuje specyficzny dla E. coli DNAzym przecinający RNA, sprzężony z platformą transdukcji sygnału opartą na ureazie, w celu wywołania widocznej zmiany barwy w odpowiedzi na obecność docelowej bakterii. Podejście to zostało zaprojektowane tak, aby było łatwe w obsłudze, szybkie i możliwe do zastosowania w diagnostyce przy łóżku pacjenta lub w warunkach terenowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Diagnostyka molekularna
- Mikrobiologia
- Testy w miejscu opieki (Point-of-care testing)
Wstęp
- Rośnie zapotrzebowanie na proste i skuteczne metody wykrywania patogenów, odpowiednie dla osób niebędących specjalistami oraz do zastosowań w terenie.
- Tradycyjne testy lakmusowe zapewniają prosty kolorymetryczny odczyt zmian pH.
- DNAzymy przecinające RNA mogą być projektowane w celu uzyskania wysokiej specyficzności w odniesieniu do konkretnych celów bakteryjnych.
- Ureaza katalizuje hydrolizę mocznika, wytwarzając amoniak i zwiększając pH roztworu, co można wykryć poprzez zmianę barwy.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i łatwego w użyciu testu wykrywania bakterii opartego na zmodyfikowanej próbie lakmusowej.
- Wykazanie swoistości i czułości DNAzymu tnącego RNA aktywowanego przez E. coli w ramach tej platformy.
- Przedstawienie metody, która może zostać dostosowana do innych DNAzymów reagujących na obecność konkretnego anality.
Stosowane metody
- Synteza koniugatu DNAzymu z ureazą (UrDNA) przy użyciu sieciowania chemicznego oraz etapów oczyszczania.
- Immobilizacja koniugatu DNAzymu z ureazą oraz DNAzymu specyficznego dla E. coli (EC1) na kulkach magnetycznych.
- Inkubacja kompleksu kulek z próbkami testowymi zawierającymi E. coli w celu aktywacji DNAzymu i uwolnienia ureazy.
- Przeniesienie uwolnionej ureazy do roztworu testowego zawierającego mocznik i wskaźnik pH (czerwień fenolową), a następnie monitorowanie zmiany barwy i przesunięcia pH.
Główne wyniki
- Test powoduje widoczną zmianę barwy (z żółtej na czerwoną) w obecności E. coli, co odpowiada wzrostowi pH.
- Brak zmiany barwy obserwuje się w przypadku braku E. coli lub w obecności bakterii niebędących celem, co wykazuje wysoką swoistość.
- Stopień zmiany barwy koreluje z liczbą komórek E. coli oraz czasem trwania etapu hydrolizy mocznika.
- Wykrycie zaledwie 107 komórek E. coli jest możliwe w ciągu 10 minut, przy wzroście pH o maksymalnie trzy jednostki.
Wnioski
- Ten zmodyfikowany test lakmusowy zapewnia prostą, szybką i specyficzną metodę wykrywania E. coli.
- Platforma ta może zostać dostosowana do innych biosensorów opartych na DNAzymach, celujących w różne patogeny.
- Właściwe płukanie i obchodzenie się z próbkami są krytyczne, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniem ureazą.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Szybka i intuicyjna detekcja patogenów jest krytyczną potrzebą w badaniach translacyjnych oraz w przepływach pracy biofarmaceutycznych prowadzonych w terenie. Kolorymetryczny test lakmusowy wykorzystujący DNAzymy przecinające RNA oraz transdukcję sygnału za pomocą ureazy umożliwia specyficzną, wizualną detekcję bakterii, takich jak E.coli, wspierając wczesne etapy przesiewu i monitoring środowiskowy. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną oraz efektywność operacyjną w kluczowych punktach procesu odkrywania i rozwoju leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią weryfikację obecności bakterii przy użyciu DNAzymów reagujących na anality, co pozwala na funkcjonalną walidację celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie wysokiej specyficzności wobec E.coli w porównaniu z bakteriami niebędącymi celem.
- Ułatwia szybkie podejmowanie decyzji go/no-go podczas przesiewowego badania próbek środowiskowych i przedklinicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, ilościowe testy kolorymetryczne do późniejszej oceny związków lub próbek.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki dzięki widocznej, zależnej od pH zmianie barwy.
- Umożliwia tworzenie skalowalnych, mobilnych platform przesiewowych do wykrywania patogenów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodne z potrzebami w zakresie wykrywania czynników chorobotwórczych istotnych dla jakości wody i biosurwilerancji środowiskowej.
- Zapewnia ciągłość od fazy odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając szybką, miejscową ocenę obecności patogenów.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia niejednoznaczności biologicznych na późnych etapach dzięki zastosowaniu odpornych i specyficznych mechanizmów detekcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając detekcję patogenów w oparciu o postawione hipotezy oraz wspierając przygotowanie analiz do zastosowań w terenie i w laboratorium.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez specyficzność DNAzymów względem celów bakteryjnych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki kolorymetryczne do szybkiej segregacji próbek.
- Analityka: Dostarcza mierzalne zmiany pH i odczyty wizualne w celu porównania warunków próbek.
- Badania translacyjne: Łączy przepływy pracy laboratoryjne i terenowe w celu testowania próbek środowiskowych i klinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową platformę możliwą do dostosowania do innych potrzeb wykrywania patogenów w oparciu o DNAzymy.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w wykrywaniu patogenów.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i szybkiemu wdrażaniu w zróżnicowanych warunkach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia efektywne podejmowanie decyzji typu go/no-go i redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój platform detekcyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu chemii kwasów nukleinowych oraz przygotowywania testów enzymatycznych.
- Niezbędny jest dostęp do podstawowej aparatury biologii molekularnej oraz narzędzi do odczytu kolorymetrycznego.
- Wymagane są rygorystyczne protokoły płukania i obchodzenia się z próbkami, aby zapobiec wynikom fałszywie dodatnim spowodowanym kontaminacją ureazą.
- Metoda jest adaptowalna dla różnych celów DNAzym w zależności od gatunku bakterii.
- Ograniczenia praktyczne obejmują progi czułości oraz konieczność przejścia szkolenia z zakresu bezpieczeństwa biologicznego przy pracy z próbkami patogennymi.
