Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zademonstrowanie prostej, zmodyfikowanej próby lakmusowej do wykrywania bakterii. Metoda ta opisuje, w jaki sposób aktywowany przez E.coli DNA-enzym tnący RNA może zostać sprzężony z platformą transdukcji sygnału opartą na ureazie, aby wywołać zmianę barwy w odpowiedzi na obecność E.coli. Dwiema głównymi zaletami tej techniki są prostota testu oraz jego możliwość zastosowania w przypadku innych DNA-enzymów tnących RNA, które reagują na konkretne anality.

Procedurę zaprezentują Seperh Manchehry oraz Dingran Chang, doktoranci z laboratorium dr. Yingfu Li na Uniwersytecie McMaster. Po przygotowaniu odczynników i buforów zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować roztwór zapasowy 4-(N-sukcynylo)cykloheksano-1-karboksylianu N-hydroksysukcynimidy, czyli SMCC, rozpuszczając 1 mg SMCC w 676 µL DMSO. Roztwór należy wymieszać na wirówce typu vortex i przechowywać w lodzie do momentu użycia.

Rozpuścić 1 mg ureazy w 1 ml 1x PBS i przechowywać na lodzie do momentu użycia. Aby zsyntetyzować DNA ureazy (UrDNA), dodać 10 µL 100 µM LD1 do probówki do wirówki o pojemności 2,5 ml. Następnie dodać 140 µL wody dwukrotnie destylowanej oraz 40 µL 10x PBS i wymieszać w wortexie.

Następnie dodaj 80.5 µL roztworu stokowego SMCC oraz 159.5 µL DMSO. Następnie ponownie wymieszaj na wirówce vorex i krótko odwiruj w wirówce laboratoryjnej. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub bloku grzejnym przez 60 minut.

Po inkubacji do probówki należy dodać 200 µL 1x PBS, 60 µL octanu sodu o stężeniu 3 M oraz 1,5 mL zimnego 100% etanolu. Wymieszać za pomocą wortexa, a następnie inkubować reakcję w temperaturze -20 °C przez 30 minut. Odwirować roztwór z prędkością 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.

Następnie usunąć nadsącz i wysuszyć osad w próżni. Do wysuszonego osadu dodać 400 µL roztwoku ureazy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Przenieść 200 µL surowego koniugatu do uprzednio wypłukanej kolumny filtra odwirowującego z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 100 000 Da.

Wiruj kolumnę przy 14,000 ×g przez pięć minut. Przenieś pozostałe 200 µL surowego koniugatu do kolumny i wiruj przy 14,000 ×g przez pięć minut. Następnie wyjmij kolumnę i umieść ją dnem do góry w nowej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 mL.

Odwiruj odwróconą kolumnę i probówkę z prędkością 1 000 ×g przez dwie minuty. Po wyjęciu probówki zbiorczej dodaj 30 µL 1x PBS do kolumny wirowej, aby wypłukać membranę w celu dodatkowego odzyskania koniugatów. Ponownie odwróć kolumnę i umieść ją z powrotem w probówce zbiorczej.

Wiruj kolumnę z prędkością 1 000 ×g przez dwie minuty. Wyjmij kolumnę i ją zutylizuj. Przechowuj UrDNA w temperaturze czterech stopni Celsiusza do momentu użycia.

Aby unieruchomić na kulkach magnetycznych DNAzym przecinający RNA aktywowany przez E.coli (EC1) oraz UrDNA, należy dobrze wymieszać zapas kulek magnetycznych i przenieść 100 µL zawiesiny kulek do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml. Następnie probówkę należy umieścić w statywie z magnesem w celu odizolowania kulek. Nadosad zniesie się za pomocą pipety, a do probówki należy dodać 150 µL buforu wiążącego (BB).

Wyjmij probówkę z uchwytu i ostrożnie opukaj ją, aby ponownie zawiesić kuleczki w jednorodnym roztworze. Po powtórzeniu płukania w BB jeszcze dwa razy, przy kuleczkach zawieszonych w BB, dodaj 10 µL 10 µM EC1. Ostrożnie wymieszaj, opukując probówkę.

Inkubować roztwór przy delikatnym wstrząsaniu przez 30 minut. Aby uniknąć agregacji kulek, należy opukiwać probówkę co dwie do trzech minut. Następnie umieścić probówkę do mikrowirówki z powrotem na statywie magnetycznym w celu wyizolowania kulek i usunąć nadsącz za pomocą pipety.

Następnie użyj 150 µL BB, aby trzykrotnie przemyć kuleczki. Po zakończeniu płukania zawieś kuleczki w łącznej objętości 150 µL BB. Do tego roztworu dodaj 15 µL UrDNA i podgrzej próbkę w temperaturze 45 °C przez dwie minuty, a następnie schłódź roztwór do temperatury pokojowej i inkubuj przez dwie godziny. Umieść probówkę do mikrowirówki z powrotem na statywie magnetycznym, aby wyizolować kuleczki, a nadsącz usuń za pomocą pipety.

Dodaj 100 µl buforu reakcyjnego (RB), następnie wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego i ostrożnie resuspenduj kuleczki. Po przygotowaniu komórek E.coli zgodnie z protokołem tekstowym, wstępnie przemyj probówkę do wirówki o pojemności 1,5 ml, dodając 100 µl RB i mieszając na wortexie. Następnie odlej bufor. Do przemytej probówki dodaj 15 µl przygotowanego EC1, następnie umieść probówkę na statywie magnetycznym i odessaj nadsącz.

Wyjmij probówkę ze statywu, dodaj 100 µL buforu RB i ostrożnie resuspenduj kuleczki magnetyczne. Po dwukrotnym przemyciu kuleczek buforem RB i usunięciu RB, dodaj do probówki 10 µL próbki E.coli i delikatnie wymieszaj zawartość, opukując probówkę. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po inkubacji dodać 90 µL wody dwukrotnie destylowanej i umieścić probówkę na statywie magnetycznym. Po około trzech minutach separacji magnetycznej ostrożnie przenieść 85 µL supernatantu do probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Bardzo ważne jest, aby ostrożnie pipetować roztwór, unikając pobrania kulek magnetycznych.

Kuleczki te są obciążone ureazą i będą generować fałszywie dodatni sygnał. Należy dodać 15 µL 0,04% czerwieni fenolowej oraz 100 µL roztworu substratu. Następnie należy wykonać zdjęcia w określonych odstępach czasu, aby zarejestrować zmianę barwy.

Kolor początkowy testu lakmusowego musi być żółty, co odzwierciedla pH roztworu poniżej 5,5. W razie potrzeby początkowe pH testu lakmusowego można skorygować za pomocą słabego buforu, np. jeden milimolowego buforu octanu sodu o pH pięciu. Na tej rycinie przedstawiono wyniki bakteryjnego testu lakmusowego, w którym jako DNAzym wykorzystano aktywowany przez E.coli RNA-cleaving DNAzyme EC1, a jako wskaźnik pH zastosowano czerwień fenolową.

Jak wykazuje brak zmiany barwy w przypadku braku E.coli, EC1 jest wysoce specyficzny i wykazuje minimalną aktywność wobec innych bakterii. Intensywność zmiany barwy zależy zarówno od liczby komórek E.coli użytych w etapie aktywacji DNAzymu, jak i od czasu przeznaczonego na etap hydrolizy mocznika. Większa liczba komórek E.coli prowadzi do silniejszej zmiany barwy, a dłuższy czas hydrolizy mocznika pozwala na wykrycie mniejszej liczby komórek.

Wykres ten przedstawia zmianę pH monitorowaną za pomocą przenośnego pH-metru. Obecność 10⁷ komórek E.coli spowodowała stopniowy wzrost pH o trzy jednostki w ciągu 10 minut. W przeciwieństwie do tego, brak E.coli nie wywołał wykrywalnych zmian pH w tych samych warunkach.

Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin, jeśli jest prowadzona prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że ureaza jest bardzo aktywna, a niewłaściwe przemywanie lub zanieczyszczenie doprowadzą do wyniku fałszywie dodatniego. Po zastosowaniu tej procedury metodę tę można wykorzystać do badania obecności E.coli w bardziej rzeczywistych warunkach, takich jak testowanie jakości wody w środowisku.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę pozwalającą na wykorzystanie prostego testu lakmusowego do wykrywania E.coli. Należy pamiętać, że test ten może być stosowany do wykrywania patogennych szczepów E.coli, które są niezwykle niebezpieczne. Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek testów w kierunku bakterii patogennych konieczne jest przejście szkolenia z zakresu bezpieczeństwa biologicznego.