Name: Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj kolorymetryczną metodę wykrywania bakterii E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego z wykorzystaniem DNAzymy i ureazy. Technika umożliwia szybką, specyficzną detekcję patogenów w warunkach polowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu badawczego zostało zapewnione przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) poprzez Discovery Grant dla YL.

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+sense+and+sensibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biosensors: sense and sensibility.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).</li>
<li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li>
<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+catalytic+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nucleic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional nucleic acid sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przełożenie działania aktywności rozszczepienia RNA DNAzymu reagującego na bakterie na test lakmusowy jest możliwe dzięki zastosowaniu ureazy i separacji magnetycznej, jak pokazano na rysunku 1. Chociaż demonstracja zmodyfikowanego testu lakmusowego do wykrywania bakterii odbywa się za pomocą DNAzymu zależnego od E. coli rozszczepiającego RNA,5,19,20 projekt można ogólnie rozszerzyć dla dowolnego DNAzymu rozszczepiającego RNA. Biorąc pod uwagę dużą dostępność DNAzymów rozszczepiającyc...

Patogeny bakteryjne są jedną z głównych przyczyn globalnej zachorowalności i śmiertelności. Ogniska zakażeń szpitalnych, patogenów przenoszonych przez żywność i zanieczyszczeń bakteryjnych w środowisku stanowią poważne i ciągłe zagrożenia dla zdrowia i bezpieczeństwa publicznego. Aby zapobiec tym epidemiom, potrzebne są skuteczne narzędzia, które pozwolą na wykrywanie patogenów w odpowiednim czasie w różnych warunkach. Proste, ale nadal skuteczne testy, które są przenośne i opłacalne, są bardzo pożądane, zwłaszcza w regionach, które są podatne na wybuchy epidemii, ale nie mogą sobie pozwolić na drogie urządzenia testowe. 1-3 Chociaż istnieje wiele metod wykrywania bakterii, wiele z nich nie nadaje się jako narzędzia przesiewowe lub testowe na miejscu, ponieważ wymagają długiego czasu testowania, drogich przyrządów i skomplikowanych procedur testowych. 
Testy kolorymetryczne są szczególnie atrakcyjne dla zastosowań w miejscu opieki nad pacjentem lub w terenie, ponieważ zmiany koloru można łatwo wykryć gołym okiem. Papierek lakmusowy pH jest prosty, szybki i skuteczny. Chociaż jest to bardzo stara technologia, nadal jest szeroko stosowana ze względu na swoją prostotę i skuteczność. Co zaskakujące, ten prosty test nigdy nie był modyfikowany w celu wykrycia innych analitów, zanim niedawno opracowaliśmy podejście polegające na modyfikowaniu tego testu do testów na obecność E. coli. 4
Rozszerzony test lakmusowy dla E. coli wykorzystuje trzy dodatkowe komponenty: aktywowany przez E. coli DNAzyme rozszczepiający RNA (EC1), 5 ureazy i kulki magnetyczne. DNAzymy odnoszą się do syntetycznych jednoniciowych cząsteczek DNA o aktywności katalitycznej. 6 Można je wyizolować z pul DNA o losowej sekwencji za pomocą selekcji in vitro. 7,8 Są bardzo stabilne i mogą być wytwarzane w sposób ekonomiczny przy użyciu wysokowydajnej zautomatyzowanej syntezy DNA. 9 Z tych powodów DNAzymy, a w szczególności DNAzymy rozszczepiające RNA, były szeroko badane pod kątem zastosowań biosensorycznych. 6,10,11 Czujniki DNA rozszczepiające RNA zostały opracowane do wykrywania jonów metali, 12-16 małych cząsteczek,17,18 patogenów bakteryjnych5,19-21 i komórek rakowych. 22 Biorąc pod uwagę dużą dostępność indukowanych przez cel DNAzymów rozszczepiających RNA, każdy test wykorzystujący DNAzyme może być potencjalnie rozszerzony w celu wykrycia różnorodnego zakresu analitów.
Ureaza została wybrana ze względu na jej zdolność do hydrolizy mocznika do amoniaku,23,24 powodując wzrost pH. Ureaza jest również wysoce wydajna, stabilna i podatna na koniugację z innymi biomolekułami. Dlatego postulowaliśmy, że koniugat DNAzymu rozszczepienia RNA z ureazą pozwoliłby na użycie papierka lakmusowego do wykrywania innych celów. 5
Działanie DNAzymu rozszczepiającego RNA jest przekazywane do wzrostu pH za pośrednictwem ureazy za pomocą kulek magnetycznych, które są unieruchomione za pomocą koniugatu DNAzyme-ureaza. Ponieważ aktywność badanego DNAzymu jest ściśle zależna od E. coli, obecność tej bakterii w roztworze testowym spowoduje uwolnienie ureazy z kulek magnetycznych do roztworu, który jest następnie pobierany i wykorzystywany do hydrolizy mocznika w roztworze reporterowym zawierającym barwnik wrażliwy na pH. Końcowym wynikiem tej procedury jest zmiana koloru, którą można wygodnie zgłosić za pomocą barwnika lub bibuły pH.

<table><tbody><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu/bisakryloamidu (29:1)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Bioshop Kanada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bioshop Kanada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xylenecyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% dodecylosiarczan sodu</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (II) sześciowodny</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenozynotrifosforan (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu trójwodny (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Alkohole etylowe</td><td></td> handlowe <td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylenowodorodiamina (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% nadsiarczan amonu (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Sukcynimidyl 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Ureaza</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04% Czerwień fenolowa</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowej</td><td>T4 Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 (5 U/&#956; l)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bulion</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 (10 U/&#956; l)</td> <td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr> o <tr><td>grubości 0,75 mm przekładki</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowy grzebień</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa płyta</td><td>CBS naukowy</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy żelowej</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Filtry odśrodkowe MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak separacyjny</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do mikrofug</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,22 i #956; m)</td> <td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml probówka hodowlana</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Myjka ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>VWR International</td><td>Numer katalogowy: 89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Rośnie zapotrzebowanie na proste, ale wciąż skuteczne metody, które mogą być używane do wykrywania określonych patogenów w miejscach opieki nad pacjentem lub w terenie. Takie metody muszą być przyjazne dla użytkownika i dawać wiarygodne wyniki, które mogą być łatwo interpretowane zarówno przez specjalistów, jak i nieprofesjonalistów. Test lakmusowy pH jest prosty, szybki i skuteczny, ponieważ informuje o pH badanej próbki poprzez prostą zmianę koloru. Opracowaliśmy podejście wykorzystujące papierek lakmusowy do wykrywania bakterii. Metoda wykorzystuje specyficzny dla bakterii DNAzyme rozszczepiający RNA w celu osiągnięcia dwóch funkcji: rozpoznania interesującej bakterii i zapewnienia mechanizmu kontroli aktywności ureazy. Dzięki zastosowaniu kulek magnetycznych unieruchomionych koniugatem DNAzyme-ureaza, obecność bakterii w badanej próbce jest przekazywana do uwalniania ureazy z kulek do roztworu. Uwolniona ureaza jest przenoszona do roztworu testowego w celu hydrolizy mocznika do amoniaku, co powoduje wzrost pH, który można zobrazować za pomocą klasycznego papierka lakmusowego.

Zasada działania bakteryjnego testu lakmusowego została wyjaśniona na Rysunku 1. W teście wykorzystuje się trzy kluczowe materiały: DNAzym przecinający RNA, który jest aktywowany przez konkretną bakterię, ureazę oraz kulki magnetyczne. DNAzym służy jako element molekularnego rozpoznawania w celu uzyskania wysoce specyficznej detekcji interesującej bakterii. Ureaza i kulki magnetyczne są wykorzystywane do transdukcji sygnału aktywności przecinania RNA przez DNAzym. Proces ...

Opisujemy protokół kolorymetrycznego wykrywania E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego, który wykorzystuje DNA rozszczepiające RNA, ureazę i kulki magnetyczne.

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zademonstrowanie prostej, zmodyfikowanej próby lakmusowej do wykrywania bakterii. Metoda ta opisuje, w jaki sposób aktywowany przez E.coli DNA-enzym tnący RNA może zostać sprzężony z platformą transdukcji sygnału opartą na ureazie, aby wywołać zmianę barwy w odpowiedzi na obecność E.coli. Dwiema głównymi zaletami tej techniki są prostota testu oraz jego możliwość zastosowania w przypadku innych DNA-enzymów tnących RNA, które reagują na konkretne anality.Procedurę zaprezentują Seperh Manchehry oraz Dingran Chang, doktoranci z laboratorium dr. Yingfu Li na Uniwersytecie McMaster. Po przygotowaniu odczynników i buforów zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować roztwór zapasowy 4-(N-sukcynylo)cykloheksano-1-karboksylianu N-hydroksysukcynimidy, czyli SMCC, rozpuszczając 1 mg SMCC w 676 µL DMSO. Roztwór należy wymieszać na wirówce typu vortex i przechowywać w lodzie do momentu użycia.Rozpuścić 1 mg ureazy w 1 ml 1x PBS i przechowywać na lodzie do momentu użycia. Aby zsyntetyzować DNA ureazy (UrDNA), dodać 10 µL 100 µM LD1 do probówki do wirówki o pojemności 2,5 ml. Następnie dodać 140 µL wody dwukrotnie destylowanej oraz 40 µL 10x PBS i wymieszać w wortexie.Następnie dodaj 80.5 µL roztworu stokowego SMCC oraz 159.5 µL DMSO. Następnie ponownie wymieszaj na wirówce vorex i krótko odwiruj w wirówce laboratoryjnej. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub bloku grzejnym przez 60 minut.Po inkubacji do probówki należy dodać 200 µL 1x PBS, 60 µL octanu sodu o stężeniu 3 M oraz 1,5 mL zimnego 100% etanolu. Wymieszać za pomocą wortexa, a następnie inkubować reakcję w temperaturze -20 °C przez 30 minut. Odwirować roztwór z prędkością 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.Następnie usunąć nadsącz i wysuszyć osad w próżni. Do wysuszonego osadu dodać 400 µL roztwoku ureazy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Przenieść 200 µL surowego koniugatu do uprzednio wypłukanej kolumny filtra odwirowującego z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 100 000 Da.Wiruj kolumnę przy 14,000 ×g przez pięć minut. Przenieś pozostałe 200 µL surowego koniugatu do kolumny i wiruj przy 14,000 ×g przez pięć minut. Następnie wyjmij kolumnę i umieść ją dnem do góry w nowej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 mL.Odwiruj odwróconą kolumnę i probówkę z prędkością 1 000 ×g przez dwie minuty. Po wyjęciu probówki zbiorczej dodaj 30 µL 1x PBS do kolumny wirowej, aby wypłukać membranę w celu dodatkowego odzyskania koniugatów. Ponownie odwróć kolumnę i umieść ją z powrotem w probówce zbiorczej.Wiruj kolumnę z prędkością 1 000 ×g przez dwie minuty. Wyjmij kolumnę i ją zutylizuj. Przechowuj UrDNA w temperaturze czterech stopni Celsiusza do momentu użycia.Aby unieruchomić na kulkach magnetycznych DNAzym przecinający RNA aktywowany przez E.coli (EC1) oraz UrDNA, należy dobrze wymieszać zapas kulek magnetycznych i przenieść 100 µL zawiesiny kulek do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml. Następnie probówkę należy umieścić w statywie z magnesem w celu odizolowania kulek. Nadosad zniesie się za pomocą pipety, a do probówki należy dodać 150 µL buforu wiążącego (BB).Wyjmij probówkę z uchwytu i ostrożnie opukaj ją, aby ponownie zawiesić kuleczki w jednorodnym roztworze. Po powtórzeniu płukania w BB jeszcze dwa razy, przy kuleczkach zawieszonych w BB, dodaj 10 µL 10 µM EC1. Ostrożnie wymieszaj, opukując probówkę.Inkubować roztwór przy delikatnym wstrząsaniu przez 30 minut. Aby uniknąć agregacji kulek, należy opukiwać probówkę co dwie do trzech minut. Następnie umieścić probówkę do mikrowirówki z powrotem na statywie magnetycznym w celu wyizolowania kulek i usunąć nadsącz za pomocą pipety.Następnie użyj 150 µL BB, aby trzykrotnie przemyć kuleczki. Po zakończeniu płukania zawieś kuleczki w łącznej objętości 150 µL BB. Do tego roztworu dodaj 15 µL UrDNA i podgrzej próbkę w temperaturze 45 °C przez dwie minuty, a następnie schłódź roztwór do temperatury pokojowej i inkubuj przez dwie godziny. Umieść probówkę do mikrowirówki z powrotem na statywie magnetycznym, aby wyizolować kuleczki, a nadsącz usuń za pomocą pipety.Dodaj 100 µl buforu reakcyjnego (RB), następnie wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego i ostrożnie resuspenduj kuleczki. Po przygotowaniu komórek E.coli zgodnie z protokołem tekstowym, wstępnie przemyj probówkę do wirówki o pojemności 1,5 ml, dodając 100 µl RB i mieszając na wortexie. Następnie odlej bufor. Do przemytej probówki dodaj 15 µl przygotowanego EC1, następnie umieść probówkę na statywie magnetycznym i odessaj nadsącz.Wyjmij probówkę ze statywu, dodaj 100 µL buforu RB i ostrożnie resuspenduj kuleczki magnetyczne. Po dwukrotnym przemyciu kuleczek buforem RB i usunięciu RB, dodaj do probówki 10 µL próbki E.coli i delikatnie wymieszaj zawartość, opukując probówkę. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Po inkubacji dodać 90 µL wody dwukrotnie destylowanej i umieścić probówkę na statywie magnetycznym. Po około trzech minutach separacji magnetycznej ostrożnie przenieść 85 µL supernatantu do probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Bardzo ważne jest, aby ostrożnie pipetować roztwór, unikając pobrania kulek magnetycznych.Kuleczki te są obciążone ureazą i będą generować fałszywie dodatni sygnał. Należy dodać 15 µL 0,04% czerwieni fenolowej oraz 100 µL roztworu substratu. Następnie należy wykonać zdjęcia w określonych odstępach czasu, aby zarejestrować zmianę barwy.Kolor początkowy testu lakmusowego musi być żółty, co odzwierciedla pH roztworu poniżej 5,5. W razie potrzeby początkowe pH testu lakmusowego można skorygować za pomocą słabego buforu, np. jeden milimolowego buforu octanu sodu o pH pięciu. Na tej rycinie przedstawiono wyniki bakteryjnego testu lakmusowego, w którym jako DNAzym wykorzystano aktywowany przez E.coli RNA-cleaving DNAzyme EC1, a jako wskaźnik pH zastosowano czerwień fenolową.Jak wykazuje brak zmiany barwy w przypadku braku E.coli, EC1 jest wysoce specyficzny i wykazuje minimalną aktywność wobec innych bakterii. Intensywność zmiany barwy zależy zarówno od liczby komórek E.coli użytych w etapie aktywacji DNAzymu, jak i od czasu przeznaczonego na etap hydrolizy mocznika. Większa liczba komórek E.coli prowadzi do silniejszej zmiany barwy, a dłuższy czas hydrolizy mocznika pozwala na wykrycie mniejszej liczby komórek.Wykres ten przedstawia zmianę pH monitorowaną za pomocą przenośnego pH-metru. Obecność 10⁷ komórek E.coli spowodowała stopniowy wzrost pH o trzy jednostki w ciągu 10 minut. W przeciwieństwie do tego, brak E.coli nie wywołał wykrywalnych zmian pH w tych samych warunkach.Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin, jeśli jest prowadzona prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że ureaza jest bardzo aktywna, a niewłaściwe przemywanie lub zanieczyszczenie doprowadzą do wyniku fałszywie dodatniego. Po zastosowaniu tej procedury metodę tę można wykorzystać do badania obecności E.coli w bardziej rzeczywistych warunkach, takich jak testowanie jakości wody w środowisku.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę pozwalającą na wykorzystanie prostego testu lakmusowego do wykrywania E.coli. Należy pamiętać, że test ten może być stosowany do wykrywania patogennych szczepów E.coli, które są niezwykle niebezpieczne. Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek testów w kierunku bakterii patogennych konieczne jest przejście szkolenia z zakresu bezpieczeństwa biologicznego.

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prostą metodą identyfikacji priorytetowych patogenów bakteryjnych jest zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych fagów reporterowych. Fagi reporterowe te, specyficzne dla konkretnych gatunków gospodarzy, są zdolne do szybkiej transdukcji sygnału bioluminescencyjnego w komórkach gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie fagów reporterowych do detekcji Yersinia pestis.

„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Ten film opisuje test kolorymetryczny do pomiaru mleczanu w lizatach komórkowych przy użyciu enzymu dehydrogenazy mleczanowej. Enzym ten przekształca mleczan w pirogronian, wraz z konwersją NAD do NADH, który reaguje z barwnikami tetrazolowymi i daje kolorowy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie w celu ilościowego określenia mleczanu.

Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego mleczanu w próbkach badanych

Ten film demonstruje kolorymetryczną metodę wykrywania E. coli, polegającą na tym, że biomarker E. coli aktywuje DNAzyme, prowadząc do rozszczepienia wiązania RNA i odłączenia koniugatu DNAzyme-ureaza. Kolejny test kolorymetryczny wykrywa biomarker E. coli poprzez zmiany pH wywołane amoniakiem.

Kolorymetryczne wykrywanie biomarkera bakteryjnego za pomocą zmodyfikowanego papierka lakmusowego

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne.  W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

W przeciwieństwie do tego, co obserwuje się u eukariontów, istnieje niedostatek badań, które szczegółowo opisują depolaryzację błony i zmiany stężenia jonów u bakterii, przede wszystkim dlatego, że ich mały rozmiar utrudnia konwencjonalne metody pomiaru. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokoły monitorowania takich zdarzeń w znaczącym patogenie Gram-dodatnim Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych.

Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Protokół obejmujący zintegrowane zagęszczenie, wzbogacenie i kolorymetryczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność w dużych ilościach wody rolniczej jest tutaj przedstawiony.  Woda jest filtrowana przez zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), wzbogacone o selektywne lub nieselektywne media, a detekcja odbywa się za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w bakteryjno-orientacyjnych podłożach kolorymetrycznych.

Kolorymetryczne wykrywanie Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes na papierze w dużych ilościach wody rolniczej

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest łatwa do oceny i dokładniejsza oraz nie wymaga specjalistycznego sprzętu.

Wizualizacja ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej

Poznaj kolorymetryczną metodę wykrywania bakterii E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego z wykorzystaniem DNAzymy i ureazy. Technika umożliwia szybką, specyficzną detekcję patogenów w warunkach polowych.

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Przeglądaj więcej filmów