Name: Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę zakażenia myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes i pomiaru odpowiedzi interferon-γ. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi komórek NK, NKT i limfocytów T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój tego protokołu był wspierany przez grant operacyjny od CIHR (MOP97807) dla SED.

<ol><li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).</li>
<li>Ranson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+V+alpha+14%2B+NKT+cells+participate+in+the+early+response+to+enteric+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).</li>
<li>Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+immunity%3A+a+T-cell-independent+pathway+of+macrophage+activation%2C+defined+in+the+scid+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse.</a> Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).</li>
<li>Soudja, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory-T-cell-derived+interferon-gamma+instructs+potent+innate+cell+activation+for+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity.</a> Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).</li>
<li>Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interferon-gamma+during+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses.</a> Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+IL-12%2F23-+and+IFN-gamma-mediated+immunity%3A+molecular%2C+cellular%2C+and+clinical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features.</a> Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).</li>
<li>Flynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Cooper, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+tuberculosis+in+interferon+gamma+gene-disrupted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice.</a> J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).</li>
<li>Dalton, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+of+immune+cell+function+in+mice+with+disrupted+interferon-gamma+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes.</a> Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).</li>
<li>Harty, J. T., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immunity+to+Listeria+monocytogenes+in+the+absence+of+IFN+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma.</a> Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+in+mice+that+lack+the+interferon-gamma+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor.</a> Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).</li>
<li>Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+effector+cells+default+to+the+Th2+pathway+in+interferon+gamma-deficient+mice+infected+with+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major.</a> J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).</li>
<li>Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+aroA-+infection+in+gene-targeted+immunodeficient+mice%3A+major+role+of+CD4%2B+TCR-alpha+beta+cells+and+IFN-gamma+in+bacterial+clearance+independent+of+intracellular+location%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location.</a> J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).</li>
<li>Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+IFN+gamma+in+protection+against+tumor+development+and+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).</li>
<li>Hodge, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+AU-rich+element+removal+promotes+chronic+IFN-gamma+expression+and+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice.</a> J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).</li>
<li>Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+autoantibodies+and+lupus+nephritis+in+transgenic+mice+expressing+interferon+gamma+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis.</a> J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).</li>
<li>Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+interferon-gamma+and+interleukin-4+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus.</a> J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).</li>
<li>Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+affects+homing+of+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells.</a> J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).</li>
<li>Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Use+of+Interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical Use of Interferon-gamma.</a> Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).</li>
<li>Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gammadelta+T+cells+in+alpha-galactosylceramide-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity.</a> J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).</li>
<li>Leonard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+single-dose+interleukin-12+exposure+on+interleukin-12-associated+toxicity+and+interferon-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production.</a> Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).</li>
<li>Zenewicz, L. A., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%3A+a+short+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview.</a> Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).</li>
<li>Viegas, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+production+by+CD27%28%2B%29+NK+cells+exacerbates+Listeria+monocytogenes+infection+in+mice+by+inhibiting+granulocyte+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization.</a> Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).</li>
<li>Selvanantham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod1+and+Nod2+enhance+TLR-mediated+invariant+NKT+cell+activation+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection.</a> J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+9B.2+Listeria+monocytogenes%3A+cultivation+and+laboratory+maintenance%2C+Chapter+31B%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2013).</li>
<li>Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+animals+for+research--issues+to+consider+for+rodents+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits.</a> ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Obernier, J. A., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+an+appropriate+period+of+acclimatization+following+transportation+of+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals.</a> ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).</li>
<li>BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf">http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf</a> (2007).</li>
<li>Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com/tutorials">http://www.flowjo.com/tutorials</a> (2016).</li>
<li>Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonizing+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+activity+enhances+Th1+immunity+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice.</a> J. Immunol. , (2015).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Amer+Stat+Assoc%22%5BJournal%5D)">Nonparametric estimation from incomplete observations.</a> J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Brown, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+CD28-mediated+signals+in+T+helper+subset+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation.</a> J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+difference+in+anti-Listeria+resistance+of+C57BL%2F6+and+A%2FJ+mice+is+not+eliminated+by+active+immunization+or+by+transfer+of+Listeria-immune+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells.</a> Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%2C++Chapter+19%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li>
<li>Mekada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+among+C57BL%2F6+substrains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Genetic differences among C57BL/6 substrains.</a> Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).</li>
<li>Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+transmission+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+via+ingestion+of+contaminated+food%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food.</a> J Vis Exp. (75), e50381(2013).</li>
<li>Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+in+E-cadherin+responsible+for+host+specificity+towards+the+human+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes.</a> Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).</li>
<li>Wollert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129 (5), 891-902 (2007).</li>
<li>Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+Listeria+monocytogenes+to+CD8%2B+T+cells+requires+secretion+of+hemolysin+and+intracellular+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth.</a> J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).</li>
<li>Muraille, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dendritic+cell+activation+by+live+versus+killed+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes.</a> Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).</li>
<li>Datta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+Listeria+induces+protective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity.</a> Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).</li>
<li>Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+of+direct+ex+vivo+epitope+mapping+identifies+dominant+and+subdominant+CD4+and+CD8+T+cell+epitopes+from+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Listeria+monocytogenes+as+a+live+vaccine+vehicle+for+the+induction+of+protective+anti-viral+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).</li>
<li>Foulds, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+CD4+and+CD8+T+cells+are+intrinsically+different+in+their+proliferative+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses.</a> J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół przeprowadzenia podstawowego eksperymentalnego zakażenia szczepem EGD L. monocytogenes25 u samców lub samic myszy C57BL/6J. Protokół ten został opracowany w celu zbadania wpływu nowej małej cząsteczki IS001 na wytwarzanie IFN-γ przez wrodzone i adaptacyjne limfocyty in vivo31. Monitorując klirens bakteryjny i przeżywalność po zakażeniu, uzyskano wgląd w to, w jaki sposób te zmiany w IFN-γ wpłynęły na zdolność gospodarza do kontrolowania infekcji.</p...

IFN-γ to cytokina, która jest kluczowa dla pośredniczenia w odporności przeciwko wewnątrzkomórkowym patogenom i kontrolowania wzrostu guza5. Znaczenie tej cytokiny w oporności bakterii jest widoczne w obserwacji, że ludzie z mutacjami w szlaku sygnałowym IFN-γ są bardzo podatni na zakażenie prątkami i salmonellami6. Podobnie myszy z niedoborem IFN-γ lub receptora IFN-γ wykazują defekty w odporności na prątki7-9 i inne patogeny wewnątrzkomórkowe, w tym L. monocytogenes10,11, Leishmania major12, Salmonella typhimurium13 i niektóre wirusy11. Oprócz zwalczania patogenów, IFN-γ odgrywa kluczową rolę w obronie gospodarza przed nowotworami14. Chociaż wyższa produkcja IFN-γ jest korzystna w kontekście infekcji lub raka, przedłużona produkcja tej cytokiny została powiązana z rozwojem autoimmunizacji układowej15-17 i przyspieszeniem cukrzycy typu I w nieotyłym modelu myszy z cukrzycą18.
Głównymi źródłami IFN-γ są komórki NK, komórki NKT, limfocyty T γδ, limfocyty T pomocnicze 1 (Th1) oraz cytotoksyczne limfocyty T (CTL)5,19,20. IFN-γ wzmacnia zarówno odporność wrodzoną, jak i nabytą poprzez: (1) regulację w górę ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II, (2) zwiększenie ekspresji cząsteczek kostymulujących na komórkach prezentujących antygen, (3) zwiększenie fagocytozy makrofagów oraz produkcji cytokin prozapalnych i czynników bakteriobójczych (np. tlenku azotu i reaktywnych form tlenu), (4) promowanie różnicowania naiwnych CD4+ Limfocyty T do komórek efektorowych Th1, (5) promowanie przełączania klasy przeciwciał na immunoglobulinę (Ig) 2a i IgG3 (u myszy), (6) indukowanie produkcji chemokin w celu rekrutacji komórek odpornościowych do miejsc infekcji oraz (7) wzmacnianie odpowiedzi komórek NK i CTL5,19. Biorąc pod uwagę kluczowe znaczenie IFN-γ w odpowiedzi gospodarza na patogeny i nowotwory, rekombinowany IFN-γ został przetestowany w leczeniu różnych infekcji i nowotworów złośliwych (przegląd w19). Ponieważ jednak ogólnoustrojowe podawanie IFN-γ lub interleukiny promującej Th1 (IL-12) wiąże się ze skutkami ubocznymi i toksycznością zalekomą zaleukinową19,21, istnieje zainteresowanie opracowaniem alternatywnych strategii zwiększenia produkcji IFN-γ przez komórki odpornościowe. Opracowanie nowych leków biologicznych i małych cząsteczek wymaga narzędzi do badań przesiewowych in vivo, aby sprawdzić, czy takie środki zwiększają produkcję IFN-γ podczas odpowiedzi immunologicznej i czy przekłada się to na znaczące efekty biologiczne, takie jak wzrost przeżywalności zwierząt.
Eksperymentalne zakażenie myszy bakterią Gram-dodatnią L. monocytogenes było instrumentalnym modelem do rozszyfrowania roli IFN-γ w odporności gospodarza na patogeny wewnątrzkomórkowe1,22. Zakażenie myszy patogenem dożylnie lub dootrzewnowo (i.p.) prowadzi do szybkiego rozprzestrzeniania się bakterii do śledziony i wątroby, gdzie zostają one zinternalizowane przez rezydujące makrofagi i hepatocyty, a szczytowe obciążenie bakteryjne w śledzionie występuje między 3 a 4 dniami po zakażeniu1,3,22. Wytwarzanie IFN-γ przez komórki NK jest ważne dla aktywacji makrofagów i wczesnej odporności na patogen3; jednak przy wysokich dawkach zakaźnych produkcja IFN-γ może być również szkodliwa dla usuwania patogenów23. Komórki NKT są również źródłem IFN-γ w śledzionie i wątrobie podczas wczesnej kontroli patogenów2,24 i wykazano, że produkcja ta zwiększa produkcję IFN-γ przez inne typy komórek, w tym komórki NK2. Z drugiej strony, później działające adaptacyjne limfocyty T, w szczególności limfocyty T CD8 +, są ważne dla pośredniczenia w usuwaniu patogenu i zapewniania ochrony przed ponownym zakażeniem1,4,22.
Ten model infekcji był atrakcyjny dla badaczy z wielu powodów (omówionych w1). Po pierwsze, zakażenie patogenem jest wysoce powtarzalne i indukuje silną odpowiedź immunologiczną Th1 i komórkową. Po drugie, podczas infekcji subletalnej obciążenie bakteryjne koncentruje się w wątrobie i śledzionie, gdzie można je łatwo zmierzyć. Po trzecie, patogen może być bezpiecznie obsługiwany w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Po czwarte, organizm i generowana przez niego odpowiedź immunologiczna zostały szeroko scharakteryzowane. Wreszcie, opracowano wiele zmutowanych i genetycznie zmodyfikowanych szczepów, które są dostępne do użytku.
Opisany tutaj jest podstawowy protokół inokulacji myszy C57BL/6J szczepem EGD L. monocytogenes25 oraz pomiaru odpowiedzi IFN γ przez NK, NKT i limfocyty adaptacyjne po zakażeniu. Opisano również, w jaki sposób mierzyć obciążenie bakteryjne śledziony i wątroby po zakażeniu subletalnym oraz przeprowadzać badania przeżycia po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu. Na koniec przedstawiono reprezentatywne dane dotyczące tego, w jaki sposób protokół ten może być wykorzystany do badań przesiewowych wpływu nowych metod leczenia na odpowiedzi IFN-γ i przeżywalność myszy po zakażeniu L. monocytogenes.

<table><tbody><tr><td>Rosół z naparu serca mózgu, modyfikowany</td><td>BD</td><td>299070</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH3Cl)</td><td></td><td></td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td></td><td></td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td></td><td></td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22400089</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12483</td><td>Przed użyciem inaktywować termicznie w temperaturze 56 & C przez 30 min</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>każda marka powinna być</td></tr><tr><td>odpowiednia Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Inhibitor transportu białek GolgiStop (zawierający Monenzynę)</td> <td>BD</td><td>554724</td><td>Użyj 4 &mu; l w 6 ml hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehye</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć do 4% PFA w ddH2O lub 1x PBS</td></tr><tr><td>10x bufor do trwałej ondulacji/prania</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Rozcieńczyć 1x w bloku ddH2O</td></tr><tr><td>Fc, Anti-Mouse CD16/CD32 Oczyszczony</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Rozcieńczony 1:50</td></tr><tr><td>Możliwy do utrwalenia barwnik żywotności eFluor 506</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>Rozcieńczyć 1:1,000 (użyliśmy również barwników żywotności z sond molekularnych)</td></tr><tr><td>anty-mysz CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>15-0041</td><td>Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak należy ją miareczkować przed użyciem.</td></tr><tr><td>anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081</td><td>Producent zaleca pewną wielkość testu, jednak przed użyciem należy go miareczkować.</td></tr><tr><td>PBS57/mCD1d tetramer-APC</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td>N/A</td><td>Otrzymany w prezencie od placówki</td></tr><tr><td>anty-Mouse TCR&beta;-PE-Cy7 (H56-597)</td><td>eBioscience</td><td>25-5961</td><td>Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak należy ją miareczkować przed użyciem.</td></tr><tr><td>anty-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td><td>eBioscience</td><td>47-3351</td><td>Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak przed użyciem należy ją miareczkować.</td></tr><tr><td>anty-mysz CD45 PE-Cyjanina7 (30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0451</td><td>Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak przed użyciem należy go miareczkować.</td></tr><tr><td>anty-mysz IFN gamma-PE (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>12-7311</td><td>Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak przed użyciem należy ją miareczkować.</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td>Użyj jednej kropli na plamę</td></tr><tr><td>Mysz IFN gamma Zestaw ELISA</td><td>eBioscience</td><td>88-7314</td><td>Służy do pomiaru interferonu gamma w hodowli Supernatant</td></tr><tr><td>50 ml wentylowane probówki do hodowli</td><td></td><td></td><td>Używany do hodowli bakterii, każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr>Probówki <td></td><td></td> do<td>mikrowirówek 1,5 ml</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>bakteryjne szalki</td><td></td><td></td> Petriego <td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>2 ml cyrovials każda marka</td><td></td><td></td><td>powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>spektrometr</td><td></td><td></td> UV <td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>bezpieczne igły</td><td></td><td></td> inżynieryjne <td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson laboratories</td><td>Stock#000664</td><td>Zamów dla przyjazd za 7 tygodni</td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td></td><td></td><td>Do odkażania</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td>Do odkażania</td></tr><tr><td>Koraliki</td><td></td><td></td> szklane <td>dowolnej marki powinny być odpowiednie</td></tr><tr><td>Wirnik wirówki</td><td></td><td></td><td>, wiadra, pokrywy wiader.</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td>dowolnej marki powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Sterylny glicerol</td><td></td><td></td><td>dowolnej marki powinien być odpowiedni</td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td> do pipet <td>dowolnej marki powinny być odpowiednie</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td>dowolnej marki powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Narzędzia</td><td></td><td></td> chirurgiczne <td>dowolnej marki powinny być odpowiednie</td></tr><tr><td>70 mikronów sitka</td><td></td><td></td><td>dowolnej marki powinny być odpowiednie</td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml Każda marka</td><td></td><td></td><td>powinna być odpowiednia</td></tr><tr>Pistolet <td></td><td></td><td>do pipet</td><td>Każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Jednostki</td><td></td><td></td> filtrujące <td>Każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Błękit</td><td></td><td></td> trypanowy <td>Rozcieńczyć od 1 do 9 w ddH2O, każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td>dowolnej marki powinien być odpowiedni</td></tr><tr>Płytki <td></td><td></td><td>z okrągłym dnem</td><td>każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>Rurki FAC</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>Do akwizycji można użyć dowolnego cytometru przepływowego, który ma odpowiednią konfigurację lasera i zestaw filtrów do rozróżniania fluorochormów</td></tr><tr><td>Flowjo oprogramowanie</td><td>Treestar</td><td></td><td>Służy do analizy danych. Inne rodzaje oprogramowania do analizy danych również będą odpowiednie</td></tr><tr><td>Pipetor wielokanałowy (0 - 300 &mikro; l)</td> <td>Eppendorf</td><td></td><td>Służy do mycia komórek i dodawania przeciwciał podczas barwienia cytometrią przepływową</td></tr><tr><td>Kwas</td><td></td><td></td> octowy <td>Używany do mycia szklanych kulek, każda marka powinna być odpowiednia</td></tr><tr><td>System ochrony bakterii w mikrobanku</td><td>Diagnostyka</td><td></td> Pro-lab <td>Stosowany jako alternatywa dla zapasów glicerolu do długotrwałego przechowywania bakterii</td></tr></tbody></table>

eksperymentalne zakażenie listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes to bakteria Gram-dodatnia, która jest przyczyną chorób przenoszonych przez żywność u ludzi. Eksperymentalne zakażenie myszy tym patogenem dostarczyło wielu informacji na temat roli wrodzonych i nabytych komórek odpornościowych oraz specyficznych cytokin w odporności gospodarza przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym. Wytwarzanie IFN-γ przez komórki wrodzone podczas subletalnego zakażenia L. monocytogenes jest ważne dla aktywacji makrofagów i wczesnej kontroli patogenu1-3. Ponadto wytwarzanie IFN-γ przez adaptacyjne limfocyty pamięci jest ważne dla pobudzania aktywacji komórek wrodzonych po ponownym zakażeniu4. Model zakażenia L. monocytogenes służy zatem jako doskonałe narzędzie do zbadania, czy nowe terapie, które mają na celu zwiększenie produkcji IFN-γ, mają wpływ na odpowiedzi IFN-γ in vivo i mają produktywne efekty biologiczne, takie jak zwiększenie klirensu bakteryjnego lub poprawa przeżywalności myszy po zakażeniu. Opisano tutaj podstawowy protokół przeprowadzania zakażeń wewnątrzotrzewnowych myszy C57BL / 6J szczepem EGD L. monocytogenes oraz pomiaru produkcji IFN-γ przez komórki NK, komórki NKT i limfocyty adaptacyjne za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto opisano procedury mające na celu: (1) wyhodowanie i przygotowanie bakterii do zaszczepienia, (2) pomiar obciążenia bakteryjnego w śledzionie i wątrobie oraz (3) pomiar przeżywalności zwierząt do punktów końcowych. Przedstawiono również reprezentatywne dane w celu zilustrowania, w jaki sposób ten model infekcji może być wykorzystany do testowania wpływu określonych czynników na odpowiedzi IFN-γ na L. monocytogenes i przeżywalność myszy z tej infekcji.

Rysunek 3 przedstawia typowe wyniki barwienia cytometrycznego IFN-γ w komórkach NK i NKT śledziony 24 h po zakażeniu dawką 105 CFU patogenu. Rysunek ten ilustruje również strategię bramkowania dla panelu barwień opisanego w Tabeli 2. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne dane uzyskane w jednym doświadczeniu, w którym samce myszy otrzymywały antagonistę PPARα IS001 lub kontrolę nośnikiem, zostały zakażone dawką 105 CF...

Ten protokół opisuje, jak zaszczepić myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i zmierzyć odpowiedzi interferonu γ (IFN-γ) przez komórki NK (natural killer), limfocyty T (NKT) i adaptacyjne limfocyty T po zakażeniu. Protokół ten opisuje również, w jaki sposób przeprowadzać badania przeżycia u myszy po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu.

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest hodowla i zakażanie myszy C57 blacksix szczepem EGG bakterii listeria monocytogenes oraz pomiar ładunku bakteryjnego, odpowiedzi interferon gamma, przeżywalności i reakcji na zakażenie tym patogenem. Protokół ten może pomóc badaczom w przesiewaniu czynników lub genów, które wpływają na odpowiedzi interferon gamma oraz na przeżywalność zwierząt po zakażeniu bakteryjnym. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że jest ona stosunkowo prosta do wdrożenia w warunkach laboratoryjnych.Nawet dla osób z niewielkim doświadczeniem w hodowli bakterii. Procedurę zaprezentuje również Jennifer Ahn, studentka studiów magisterskich z mojego laboratorium. Rozpocznij od zanurzenia sterylnej końcówki pipety w rozmrożonym w temperaturze pokojowej zapasie glicerolowym szczepu L monocytogenes EGG.Następnie natychmiast wykonaj posiew przez przeciąganie końcówki pipety w przód i w tył na fragmencie płytki z pożywką BHI (brain heart infusion). Jest to posiew pierwotny. Obróć płytkę o 90 stopni i przeciągnij nową końcówkę pipety przez pierwszy obszar posiewu, rozprzestrzeniając materiał wyjściowy na kolejną ćwiartkę płytki.Jest to posiew wtórny. Następnie obrócić płytkę i rozprowadzić posiew wtórny w trzeciej ćwiartce płyty, aby wykonać posiew trzeciorzędowy. Teraz odwrócić płytkę do góry dnem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.Pojedyncze, jednorodne kolonie powinny być widoczne w ostatnim zestawie kresek po upływie od 16 do 24 godzin. Po pojawieniu się kolonii należy nalać 10 mililitrów sterylnego bulionu BHI do sterylnej, wentylowanej probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie za pomocą sterylnego końcówki pipety przenieść jedną kolonię L. monocytogenes z płytki do bulionu. Zaszczepiony bulion należy inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przez noc w temperaturze 37 stopni celsius i przy 225 obrotach na minutę, aż OD600 osiągnie wartość jeden.W celu przygotowania inokulum do eksperymentalnej infekcji L. monocytogenes, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zaszczep probówkę z pożywką BHI 100 µL kultury nocnej. Po kolejnej inkubacji w temperaturze 37 °C, przy potrząsaniu aż do osiągnięcia pożądanej wartości OD600, przenieś zawartość kultury do sterylnej probówki do wirowania w celu odwirowania. Następnie użyj pompy próżniowej podłączonej do kolby pułapki z wybielaczem, aby odessać nadsącz.Przemyj osad dwukrotnie buforem PBS, stosując te same parametry wirowania. Po drugim przemyciu resuspenduj bakterie w PBS i rozcieńcz do odpowiedniego stężenia, aby podać pożądaną liczbę CFU każdemu myszy w objętości 200 µL.Następnie dokładnie wymieszaj zawiesinę za pomocą sterylnego końcówki pipety, aby zapewnić jednorodne rozłożenie bakterii. Potem pobierz 200 µL inokulum do bezpiecznej strzykawki o objętości 1 mL wyposażonej w igłę 25 G. Teraz, chwyć mysz za luźną skórę w okolicy barków niedominującą ręką.Następnie wstrzyknij całe 200 µL inokulum w dolną ćwiartkę brzucha, nieco bocznie od linii środkowej, aby uniknąć pęcherza, używając nowej igły i strzykawki dla każdego zwierzęcia. Aby zmierzyć szczytowe obciążenie bakteryjne w przebiegu infekcji, w trzeciej dobie po zakażeniu unieruchom kończyny zwierzęcia doświadczalnego w pozycji grzbietowej na stole sekcyjnym. Następnie zdezynfekuj skórę 70% etanolem.Używając sterylnych nożyczek do twardych tkanek, wykonaj nacięcie od klatki piersiowej do pachwiny. Następnie wykonaj nacięcia od środka pachwiny w kierunku każdego kolana oraz od środka klatki piersiowej w kierunku każdego łokcia. Rozszerz tępo, odseparuj i odchyl skórę, mocując ją w pozycji otwartej za pomocą igieł 25G.Zdezynfekuj warstwę mięśniową kolejną porcją 70% etanolu. Następnie za pomocą sterylnych cienkich nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej ściany otrzewnej. Użyj pęsety, aby uchwycić wyrostek mieczowaty.Wykonaj nacięcia w ścianie otrzewnej, zaczynając od wyrostka mieczykowatego i przesuwając się bocznie po każdej stronie, wzdłuż klatki piersiowej aż do miejsca tuż poniżej przepony. W ten sposób odsłonięta zostanie wątroba.Następnie za pomocą sterylnych nożyczek odetnij fragment o masie około 100 mg z jednego płata. Umieść tkankę w wcześniej zważonej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej od 0,2 do 0,3 g sterylnych szklanych kuleczek o średnicy od 1,5 do 2 mm, płukanych kwasem. Używając pęsety, ostrożnie odsuń organy znajdujące się po lewej stronie jamy otrzewnowej, aby uwidocznić śledzionę.Używając pęsety, delikatnie chwyć śledzionę, odcinając otaczającą ją tkankę łączną, aby uwolnić narząd z jamy otrzewnej. Umieść śledzionę w innej probówce niż wątrobę, a następnie przetransportuj tkanki do laboratorium w szczelnym pojemniku z lodem. Potrząsaj probówkami, korzystając z homogenizatora kulkowego przez trzy minuty przy częstotliwości 30 Hz.Następnie przygotuj dziesięciokrotny szereg rozcieńczeń homogenatów w 0,1% Triton X 100 w PBS. Dalej, za pomocą sterylnego rozprowadzacza, nanieś 100 µL każdego rozcieńczonego homogenatu na płytkę z agarem BHI. Następnie przenieś płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C na inkubację nocną.Zachowaj płytki, które zawierają do 300 kolonii na płytkę. Policz kolonie na każdej płytce. Aby zmierzyć CD4 w odpowiedziach limfocytów T CT8 na interferon gamma, pobierz śledziony od myszy zainfekowanych dwiema dziesiątymi mianownika czwartego CFU patogenu, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Przetworzyć śledziony do postaci jednorodnej zawiesiny erytrocytów. Osad zawiesić w całkowitym medium RPMI z dodatkiem FCS do uzyskania stężenia 4 × 10⁶ komórek/ml. Następnie do każdej studni płytki 24-dołkowej nanieść 1 ml komórek oraz równą objętościowo ilość rozmrożonych, zabitych termicznie bakterii L. monocytogenes, a następnie umieścić zimne hodowle w inkubatorze w temperaturze 37 °C.Po 20 godzinach do studni należy dodać 0,66 µL na ml inhibitora transportu białek, a następnie ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Po czterech godzinach, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zebrać 500 µL supernatantu hodowli i zamrozić próbki w temperaturze -80 °C w celu późniejszego oznaczenia interferonu gamma metodą ELISA.Następnie przenieś komórki do jednej sterylnej probówki o pojemności 15 ml, płucząc studzienki PBS i łącząc płuczkę z zebranymi komórkami w celu przeprowadzenia barwienia i analizy cytometrycznej. Szczyt obciążenia bakteryjnego w śledzionie występuje od dwóch do trzech dni po zakażeniu i jest gwałtownie redukowany poprzez dodanie antagonisty PPAR Alpha przed zakażeniem.Siedem dni po zakażeniu ponowna stymulacja ex vivo limfocytów T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich z śledziony za pomocą zabitego ciepłem patogenu wywołuje pozytywną odpowiedź interferon gamma ze strony komórek CD4-dodatnich i CD8-dodatnich, co wykryto za pomocą cytometrii przepływowej. Leczenie antagonistą PPAR alfa przed zakażeniem nasila odpowiedzi interferon gamma komórek CD4 i CD8. Ponadto leczenie antagonistą PPAR alfa zwiększa przeżywalność po zakażeniu dawką LD50 patogenu, co obrazuje przydatność tego modelu do badania wpływu nowych leków modulujących odpowiedzi interferon gamma na przeżywalność zwierząt po zakażeniu.Po opanowaniu wszystkich procedur zawartych w niniejszym protokole, prawidłowe ich wykonanie pozwoli na uzyskanie pożądanych danych w ciągu kilku tygodni. Technikę tę można dalej dostosować poprzez zakażenie myszy szczepami listeria monocytogenes wykazującymi ekspresję antygenów modelowych i zastosowanie tetramerów MHC klasy I i II specyficznych dla tych antygenów. Pozwoli to na pomiar ekspansji limfocytów T po zakażeniu.Po opracowaniu technika ta stała się kluczowym modelem do rozszyfrowania roli interferonu gamma w odporności gospodarza na patogeny wewnątrzkomórkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować i zarażać myszy C57 blacksix bakterią listeria monocytogenes, a także jak mierzyć miano bakterii w organizmie oraz odpowiedź interferonu gamma na zakażenie.Należy pamiętać, że praca z Listeria monocytogenes może być niebezpieczna dla osób z obniżoną odpornością, takich jak kobiety w ciąży, osoby bardzo młode lub starsze. W związku z tym patogen ten powinien być obsługiwany wyłącznie przez osoby immunokompetentne w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Listeria monocytogenes jest organizmem modelowym do badania odpowiedzi immunologicznych i genetycznej podatności myszy na bakterie wewnątrzkomórkowe. Metoda ta umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz przygotowanie jednokomórkowych zawiesin wątroby i śledziony myszy do analizy FACS w celu określenia zmian w komórkach odpornościowych wywołanych zakażeniem Listeria.

Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes

Źródło: Seman, B. G. i in. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Film prezentuje model noworodkowej myszy do badania infekcji ogólnoustrojowej z użyciem zamkniętych bakterii bioluminescencyjnych. Noworodki są wstrzykiwane wysokodawkowymi lub niskodawkowymi zawiesinami bakteryjnymi i zwracane matce na opiekę poporodową. Otoczone bakterie unikają wczesnego wykrywania odpornościowego, rozprzestrzeniają się systemowo i są wizualizowane w czasie za pomocą...

Modelowanie infekcji u noworodkowych myszy z użyciem kapsulowanych bioluminescencyjnych bakterii

Źródło: Radulovic, K. i in. Wstrzykiwanie lipopolisacharydu u myszy w celu naśladowania wejścia produktów pochodzących od mikroorganizmów po przełamaniu bariery jelitowej. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje krok po kroku procedurę wstrzykiwania lipopolisacharydu (LPS) myszom wewnątrzotrzewnowkowo, aby wywołać stany ogólnoustrojowe.

Iniekcja do otrzewnewki bakteryjnego lipopolisacharydu u myszy w celu badania ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Ten film demonstruje metodę obrazowania do wizualizacji in situ wydzielania interferonu gamma (IFN-γ) w śledzionie myszy. Po zakażeniu bakteryjnym i indukcji akumulacji IFN-γ w limfocytach T i komórkach NK pobiera się śledzionę od myszy. Po uzyskaniu skrawków tkanek wykonuje się barwienie immunologiczne w celu uwidocznienia IFN-γ wewnątrz komórek.

Test do identyfikacji wydzielania interferonu gamma w mysich narządach limfatycznych

Ten film pokazuje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego z perfundowanego mózgu myszy zakażonego Listeria monocytogenes.

Ocena kolonizacji bakteryjnej w mózgu myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę doustnego zakażenia myszy za pomocą żywności skażonej Listeria monocytogenes. Protokół można łatwo dostosować do stosowania z innymi patogenami bakteryjnymi przenoszonymi przez żywność.

Przenoszenie Listeria monocytogenes drogą pokarmową drogą pokarmową u myszy

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni patogen bakteryjny, często używany jako główny model do badania pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego. Obrazowanie późnych etapów infekcji L. monocytogenes w kontekście małych interferujących badań przesiewowych RNA pozwala na globalne badanie szlaków komórkowych wymaganych do infekcji bakteryjnej docelowych komórek gospodarza.

Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Tutaj opisujemy prostą metodę obrazowania konfokalnego, aby zobrazować lokalizację in situ komórek wydzielających cytokinę Interferon gamma w mysich wtórnych narządach limfatycznych. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację innych cytokin w różnych tkankach.

Obrazowanie wytwarzania interferonu gamma in situ w śledzionie myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Poznaj metodę zakażenia myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes i pomiaru odpowiedzi interferon-γ. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi komórek NK, NKT i limfocytów T.

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

Przeglądaj więcej filmów