Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie wpływu na integralność i przepuszczalność komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroimmunologii, takie jak to, w jaki sposób bezpośrednia interakcja między limfocytami T a komórkami śródbłonka wpływa na integralność i przepuszczalność bariery krew-mózg. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona zautomatyzowaną ocenę funkcji bariery w czasie rzeczywistym po ukierunkowanej modulacji interakcji komórek T i komórek śródbłonka.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię autoimmunologicznych zaburzeń OUN, ponieważ zapewnia ona wgląd w przełamanie bariery krew-mózg za pośrednictwem limfocytów T, co jest kluczowym krokiem w patogenezie takich chorób. Metoda ta koncentruje się na właściwościach morskiej bariery krew-mózg podczas EAE. Ale może być również stosowany do modeli czerwonej lub ludzkiej bariery krew-mózg, a także do badań nad innymi autoimmunologicznymi zaburzeniami OUN.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą zmagać się z możliwymi trudnościami z optymalnym czasem połączonej hodowli pierwotnych komórek śródbłonka i aktywacji limfocytów T. Po raz pierwszy opracowaliśmy tę metodę, gdy wyruszyliśmy, aby zbadać wpływ różnych poziomów aktywacji limfocytów T na właściwości bariery krew-mózg podczas EAE, zwierzęcego modelu stwardnienia rozsianego. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ ustawianie kohodowli komórek T i komórek śródbłonka jest trudne do nauczenia, ponieważ początkowe różnice w T między studzienkami mogą wymagać późniejszego błędnego przedstawienia wyników.

Aby rozpocząć tę procedurę, w piątym dniu po izolacji MBMEC, należy wstępnie pokryć przepuszczalne wkłady 80 mikrolitrami roztworu powlekającego MBMEC na wkładkę. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny. Po usunięciu roztworu powlekającego MBMEC z wkładek, umyj MBMEC, dodając dwa mililitry PBS o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i zasysając go po jednej minucie, a następnie powtórz tę procedurę jeszcze raz.

Następnie dodaj 0,05% trypsyny EDTA w ilości 300 mikrolitrów na studzienkę i inkubuj przez pięć do dziesięciu minut. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki MBMEC do każdej studzienki, aby zatrzymać trypsynizację. Następnie przenieś zebrane komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj próbkę o temperaturze 700 razy g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po ośmiu minutach wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki MBMEC bez puromycyny. Aby policzyć komórki, wymieszaj 90 mikrolitrów 0,04% błękitu trypanowego. Za pomocą 10 mikrolitrów zawiesiny komórek odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny między szklaną pokrywą a hemocytometrem.

Następnie sceduj dwa razy 10 do czwartych komórek na wkładkę. Dodaj 810 mikrolitrów pożywki MBMEC do dolnej komory każdej studzienki i umieść płytkę z wkładkami w inkubatorze, aż będzie gotowa do przystąpienia do pomiaru TEER. Aby stymulować limfocyty T CD4-dodatnie, należy wstępnie pokryć okrągłodenną 96-dołkową płytkę oczyszczonym przeciwciałem anty-mysim CD3 o pożądanym stężeniu końcowym przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po wyizolowaniu limfocytów T należy dwukrotnie przemyć wstępnie pokrytą płytkę PBS. Następnie dodaj oczyszczone przeciwciało anty-CD28 do wyizolowanych limfocytów T o pożądanym stężeniu końcowym i dobrze wymieszaj. Następnie sceduj limfocyty T i pozostaw je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwa do trzech dni.

Aby skonfigurować pomiar TEER, umieść 24-dołkowy moduł przyrządu TEER w okapie z przepływem laminarnym. Zdejmij pokrywki i umieść wkładki z MBMEC w instrumencie za pomocą kleszczy. Następnie odpipetować 810 mikrolitrów świeżej pożywki do dolnej komory studzienek modułu, dodać ostrożnie między wkładkę a ścianę studzienki modułu.

Następnie zamknij pokrywy i umieść instrument w inkubatorze. Podłącz instrument do komputera. Następnie włącz kontroler przyrządu i otwórz oprogramowanie.

W wyskakującym oknie wybierz Nowy pomiar"Zaznacz pokaż TER" i pokaż Ccl"pola. Następnie naciśnij start. Po zakończeniu pierwszego pomiaru wybierz sprawdź wszystkie dołki" w zakładce Wyniki, aby zobaczyć wszystkie wartości TEER i Ccl.

Następnie zapisz plik. Następnie wybierz punkt czasowy do wspólnej hodowli MBMEC z limfocytami T, gdy Ccl jest stabilny i niższy niż jeden mikrofarad na centymetr kwadratowy, a TEER osiągnął maksymalny poziom. Dokładnie sprawdź bezwzględne wartości TEER i Ccl i wyklucz odwierty, w których MBMEC nie rozwinęły wystarczająco zlewających się monowarstw, odznaczając takie studnie.

Pogrupuj pozostałe studnie, klikając je prawym przyciskiem myszy i wybierając dodaj studnię do nowej średniej studni"Nazwij to w wyskakującym okienku i zrób to samo dla wszystkich pojedynczych studni, które mają zostać zgrupowane. Następnie sprawdź wszystkie średnie studzienki, aby potwierdzić, że wszystkie mają takie same warunki początkowe przed kokulturą. Na karcie eksperymentu naciśnij pauzę.

Odłącz instrument i wyjmij go z inkubatora. Następnie zdejmij pokrywki z okapu z przepływem laminarnym. Następnie usuń część pożywki z wkładu w górnej komorze studzienki.

Dodaj limfocyty T do MBMEC, ostrożnie pipetując 150 mikrolitrów pożywki. Następnie ponownie podłącz przyrząd i naciśnij wznów pomiar. Po 24 godzinach naciśnij stop w zakładce eksperymentu i zapisz plik.

Pokazano tutaj morfologię wrzecionowatą w barwieniu immunofluorescencyjnym PECAM-1 i Cldn-5 pięć dni po izolacji MBMEC. Oto wartości TEER i Ccl przed i po grupowaniu poszczególnych studzienek przed dodaniem limfocytów T. Niebieska krzywa nie jest używana w eksperymencie, ponieważ MBMEC w tym odwiercie nie rozwinęły TEER tak wysoko, jak w innych odwiertach.

W tym eksperymencie znacznik 35 do 55 specyficznych limfocytów T CD4-dodatnich stymulowano w sposób specyficzny dla antygenu przez pięć dni. Naiwne limfocyty T i cytokiny prozapalne, interferon gamma i TNF-alfa służyły odpowiednio jako kontrola negatywna i pozytywna. W tym przypadku limfocyty T były stymulowane przez taką samą ilość przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28, a te hodowane przez trzy dni wykazywały większą skłonność do naruszania bariery w porównaniu z limfocytami T hodowanymi tylko przez dwa dni.

Wyniki pokazują, że stymulowane limfocyty T, ale nie ich supernatanty, spowodowały znaczne uszkodzenie MBMEC, co wskazuje, że bezpośredni kontakt między limfocytami T a MBMEC ma kluczowe znaczenie dla przerwania bariery. Z drugiej strony, dodanie drugiego inhibitora granzymu b do hodowli limfocytów T przywróciło integralność MBMEC w większym stopniu, wskazując na cząsteczkę cytolityczną jako ważnego gracza w powodowaniu uszkodzenia MBMEC i późniejszym spadku TEER Po opanowaniu eksperyment ten można przeprowadzić w ciągu 12 dni, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wybraniu właściwego punktu czasowego do ustawienia kokultury limfocytów T i komórek śródbłonka.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne eseje, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, cytometria przepływowa i eseje prawdopodobieństwa. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: Jak ta interakcja wpływa na przepuszczalność ekspresji cząsteczek o ścisłym połączeniu i zakres transmigracji limfocytów T? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neuroimmunologii do badania zaburzeń autoimmunologicznych OUN u myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak ocenić bezpośrednie skutki między aktywowanymi limfocytami T a komórkami śródbłonka w odniesieniu do integralności i przepuszczalności bariery krew-mózg