Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie wpływu interakcji z aktywowanymi limfocytami T na integralność i przepuszczalność komórek śródbłonka. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuroimmunologii, takie jak wpływ bezpośredniej interakcji między limfocytami T a komórkami śródbłonka na integralność i przepuszczalność bariery krew-mózg. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zautomatyzowanej oceny funkcji bariery w czasie rzeczywistym podczas ukierunkowanej modulacji interakcji między limfocytami T a komórkami śródbłonka.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię autoimmunologicznych schorzeń OUN, ponieważ dostarcza ona wglądu w zależny od limfocytów T rozpad bariery krew-mózg, który jest kluczowym etapem w patogenezie takich chorób. Metoda ta koncentruje się na właściwościach bariery krew-mózg u myszy podczas EAE, ale może zostać zastosowana również do modeli bariery krew-mózg szczura lub człowieka, a także do badań nad innymi autoimmunologicznymi schorzeniami OUN.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności wynikające z możliwych problemów z optymalnym zgraniem czasu trwania połączonej hodowli pierwotnych komórek śródbłonka i aktywacji limfocytów T. Metodę tę opracowaliśmy pierwotnie podczas badania wpływu różnych poziomów aktywacji limfocytów T na właściwości bariery krew-mózg w przebiegu EAE, zwierzęcym modelu stwardnienia rozsianego. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ nauka przygotowywania kokultur limfocytów T i komórek śródbłonka jest trudna, gdyż początkowe różnice w liczbie limfocytów T między dołkami mogą prowadzić do późniejszych błędnych interpretacji wyników.

Aby rozpocząć tę procedurę, w piątym dniu po izolacji MBMEC, należy pokryć wkładki przepuszczalne 80 µL roztworu do powlekania MBMEC na każdą wkładkę. Inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez trzy godziny. Po usunięciu roztworu do powlekania MBMEC z wkładek, należy przemyć MBMEC, dodając 2 mL PBS o temperaturze pokojowej do każdego dołka i odsysając go po jednej minucie, a następnie powtórzyć tę procedurę jeszcze raz.

Następnie dodać 0,05% Trypsin EDTA w ilości 300 µL na dołek i inkubować przez pięć do dziesięciu minut. Następnie do każdego dołka dodać 2 mL pożywki MBMEC, aby zatrzymać proces trypsynizacji. Potem przenieść zebrane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wirować próbkę z prędkością 700 ×g przez osiem minut w temperaturze 4 °C.

Po ośmiu minutach odlać nadsącz i resuspenderć komórki w 1 mL pożywki MBMEC bez puromycyny. W celu policzenia komórek zmieszać 90 µL 0,04% błękitu trypanu. Pobrawszy 10 µL zawiesiny komórkowej, nanieść 10 µL mieszaniny pomiędzy szkiełko nakrywkowe a komorę hemocytometryczną.

Następnie zasiać 2 × 10⁴ komórek na każdy insert. Do dolnej komory każdej studni dodać 810 µL pożywki MBMEC i umieścić płytkę z insertami w inkubatorze do momentu przystąpienia do pomiaru TEER. Aby stymulować limfocyty T CD4+, okrągłodenna płytkę 96-dołkową pokryć uprzednio oczyszczonym przeciwciałem anty-mysim CD3 w pożądanym stężeniu końcowym i inkubować przez trzy godziny w temperaturze 37 °C.

Po wyizolowaniu limfocytów T, przemyj dwa razy wcześniej powleczoną płytkę roztworem PBS. Następnie dodaj oczyszczone przeciwciało anty-CD28 do wyizolowanych limfocytów T w pożądanym stężeniu końcowym i dokładnie wymieszaj. Następnie inkubuj limfocyty T w temperaturze 37 °C przez dwa do trzech dni.

Aby przygotować pomiar TEER, należy umieścić moduł 24-dołkowy urządzenia TEER w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pęsety należy zdjąć pokrywki i umieścić inserty z MBMECs w urządzeniu. Następnie do dolnej komory dołków modułu należy nalać pipetą 810 µL świeżej pożywki, dodając ją ostrożnie w przestrzeń między insertem a ścianką dołka modułu.

Następnie zamknij pokrywy i umieść urządzenie w inkubatorze. Podłącz urządzenie do komputera. Następnie włącz kontroler urządzenia i uruchom oprogramowanie.

W oknie wyskakującym zaznacz pole „New Measurement”, pole „Check show TER” oraz pole „show Ccl”. Następnie naciśnij start. Po zakończeniu pierwszego pomiaru, w zakładce Results zaznacz „check all wells”, aby wyświetlić wszystkie wartości TEER i Ccl.

Następnie zapisz plik. W kolejnym kroku wybierz punkt czasowy do kokultury MBMECs z limfocytami T, w którym Ccl jest stabilne i niższe niż 1 µF/cm², a TEER osiągnęło swój maksymalny poziom. Dokładnie sprawdź bezwzględne wartości TEER oraz Ccl i wyklucz studzienki, w których MBMECs nie utworzyły wystarczająco konfluentnych monowarstw, odznaczając odpowiednie pola.

Pogrupuj pozostałe studzienki, klikając prawym przyciskiem myszy na studzienki i wybierając opcję „dodaj studzienkę do nowej średniej studzienki”. Nadaj jej nazwę w wyskakującym oknie i powtórz tę czynność dla wszystkich pojedynczych studzienek, które mają zostać pogrupowane. Następnie sprawdź wszystkie średnie studzienki, aby potwierdzić, że wszystkie mają takie same warunki początkowe przed kokulturą. W zakładce eksperymentu naciśnij pauzę.

Odłącz urządzenie i wyjmij je z inkubatora. Następnie zdejmij pokrywy w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Po tym usuń część pożywki z insertu w górnej komorze studzienki.

Dodaj limfocyty T do MBMECs, ostrożnie pipetując 150 µL medium. Następnie ponownie podłącz instrument i naciśnij przycisk wznowienia pomiaru. Po 24 godzinach naciśnij stop w zakładce eksperymentu i zapisz plik.

Przedstawiono tutaj wrzecionowatą morfologię w barwieniu immunofluorescencyjnym na PECAM-1 i Cldn-5 pięć dni po izolacji MBMEC. Poniżej znajdują się wartości TEER i Ccl przed i po grupowaniu poszczególnych studzienek przed dodaniem limfocytów T. Krzywa niebieska nie została wykorzystana w eksperymencie, ponieważ MBMEC w tej studni nie rozwinęły tak wysokiej wartości TEER jak w pozostałych studzienkach.

W tym eksperymencie od 35 do 55 specyficznych komórek T CD4+ stymulowano w sposób antygenowo-specyficzny przez pięć dni. Naiwne komórki T oraz cytokiny prozapalne, interferon gamma i TNF-alfa, służyły odpowiednio jako kontrola ujemna i dodatnia. Tutaj komórki T stymulowano taką samą ilością przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28, a te hodowane przez trzy dni wykazały większą skłonność do naruszania bariery w porównaniu z komórkami T hodowanymi tylko przez dwa dni.

Wyniki przedstawione w tym miejscu pokazują, że stymulowane limfocyty T, a nie ich nadsączniki, spowodowały znaczne uszkodzenie MBMEC, co wskazuje na to, że bezpośredni kontakt między limfocytami T a MBMEC ma kluczowe znaczenie dla naruszenia bariery. Z drugiej strony, dodanie inhibitora granzymu b do hodowli limfocytów T przywróciło integralność MBMEC w większym stopniu, co wskazuje na tę cząsteczkę cytolityczną jako istotny czynnik powodujący uszkodzenie MBMEC i następujący spadek TEER. Po opanowaniu metody eksperyment ten może zostać przeprowadzony w ciągu 12 dni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby wybrać odpowiedni punkt czasowy dla ustanowienia kokultury limfocytów T i komórek śródbłonka.

Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne analizy, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, cytometria przepływowa oraz analizy prawdopodobieństwa. Pozwala to na odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. w jaki sposób ta interakcja wpływa na ekspresję cząsteczek połączeń ścisłych, przepuszczalność oraz zakres transmigracji limfocytów T? Po opracowaniu ta technika utorowała badaczom z zakresu neuroimmunologii drogę do badania autoimmunologicznych zaburzeń OUN u myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak oceniać bezpośrednie oddziaływania między aktywowanymi limfocytami T a komórkami śródbłonka w kontekście integralności i przepuszczalności bariery krew-mózg.