Name: Wykorzystanie wielofluorowanych kwasów żółciowych i rezonansu magnetycznego in vivo do pomiaru transportu kwasów żółciowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę etykietowania kwasów żółciowych fluorem i pomiaru ich stężenia w pęcherzyku żółciowym za pomocą rezonansu magnetycznego u żywych zwierząt. Technika ta pozwala na nieinwazyjną diagnostykę zaburzonego wchłaniania kwasów żółciowych bez ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (granty o numerach R21 DK093406 i T32 DK067872 dla J-P.R.) oraz nagrodę VA Merit (grant numer 1BX002129 dla J-P.R.).

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w School of Medicine Uniwersytetu w Maryland (protokół IACUC nr 0415011, zatwierdzony 18 czerwca 2015 r.).
1. Gavage myszy kwasami żółciowymi znakowanymi 19F
<ol>
	<li>Wykonaj gavage u myszy, podając 150 mg/kg masy ciała kwasów żółciowych znakowanych 19F. Napełnij strzykawkę 1-ml do wymaganej objętości roztworem stokowym kwasów żółciowych znakowanych 19F [kwas choliczny-trifluoro-acetyl lizyna (CA-lys-TFA; w mieszaninie 1:1 glikolu polietylenowego 400 i fosforanu buforowanego soli Dulbecco) lub cholylsarkozyna-trifluoro-N-metylo-acetamid (CA-sar-TFMA; w 60% glikolu polietylenowego 400 i 40% fosforanu buforowanego soli Dulbecco] i przymocuj zakrzywioną igłę do gavage żołądkowego o rozmiarze 20G, długości 1,5 cala i zaokrąglonej końcówce. Upewnij się, że igła do gavage jest wystarczająco długa, aby po wprowadzeniu do przełyku aż do nasady igły sięgać poziomu chrząstki mieczykowatej myszy</li>
	<li>Mocno chwyć zwierzę za luźną skórę na karku kciukiem i palcem wskazującym, a pozostałymi palcami chwyć skórę w dolnej części grzbietu i ogon.</li>
	<li>Trzymając mysz w pozycji pionowej, wprowadź igłę do gavage wzdłuż boku i podniebienia do przełyku, a następnie w dół do żołądka. Jeśli napotkasz opór w okolicy gardła, zmień położenie igły, aż zwierzę ją „połknie” — nie pchaj igły przeciwko oporowi.</li>
	<li>Jeśli gavage wymaga znieczulenia, umieść mysz w kloszu zawierającym 5 ml izofluranu i zamknij go. Gdy mysz upadnie na bok, odczekaj 7 sec, wyjmij mysz i wykonaj gavage. Aby chronić personel przed oparami anestetyku, używaj klosza wyłącznie w dygestorium.</li>
	<li>Obserwuj zwierzę podczas budzenia się z narkozy po izofluranie przez kilka min. 
	UWAGA: Ponieważ izofluran jest metabolizowany przez wątrobę, sygnał fluoru pochodzący z nienaruszonego leku lub jego metabolitów wydalanych do układu żółciowego i pęcherzyka żółciowego może zakłócać sygnały fluoru z kwasów żółciowych znakowanych 19F15. Alternatywą jest zastosowanie ketaminy i ksylazyny (dawki podano w sekcji 3.1).</li>
</ol>
2. Pobieranie pęcherzyka żółciowego, wątroby i krwi do pomiarów kwasów żółciowych przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas
<ol>
	<li>Aby uzyskać maksymalne napełnienie pęcherzyka żółciowego, należy głodzić myszy przez co najmniej 6 hr przed pobraniem organów. Przygotować ketaminę i ksylazynę w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (100 µl ketaminy, 62,5 µl ksylazyny, 840 µl PBS).</li>
	<li>Za pomocą sterylnej strzykawki 1-ml, na 1 hr przed pobraniem organów, wstrzyknąć myszy podskórnie 15 µl/g masy ciała roztworu ketaminy/ksylazyny (150 mg ketaminy i 18 mg ksylazyny na kg masy ciała).</li>
	<li>Godzinę po podaniu ketaminy/ksylazyny potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez uciśnięcie palca u nogi, a następnie ułożyć znieczuloną mysz na plecach.</li>
	<li>Użyć nożyczek o długości 5 lub 6 cali, aby wykonać cięcie skóry wzdłuż linii środkowej brzucha od spojenia łonowego do wyrostka xifoidalnego, oraz drobnych nożyczek (4 cale), aby przeciąć otrzewną i odsłonić narządy jamy brzusznej — należy uważać, aby nie przebić przepony.</li>
	<li>Ująć wyrostek xifoidalny zaciskiem 5-calowym i odsunąć go w stronę klatki piersiowej, aby odsłonić górną część jamy brzusznej. Za pomocą pęsety i tępym narzędziem odsunąć wątrobę, odsłaniając pęcherzyk żółciowy. 
	UWAGA: Nie wolno uszkodzić wątroby ani dotykać pęcherzyka żółciowego, ponieważ pierwsze spowoduje silne krwawienie, a drugie może pobudzić skurcz i opróżnienie pęcherzyka żółciowego.</li>
	<li>Umieścić 4-calowy zacisk na wspólnym przewodzie żółciowym (Rycina 3, przerywane strzałki). Przeciąć więzadło łączące górny biegun pęcherzyka żółciowego z przeponą i delikatnie przesunąć pęcherzyk żółciowy na prawą stronę jamy brzusznej.</li>
</ol>
<img alt="Rycina 3" src="/files/ftp_upload/54597/54597fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Widoki anatomiczne oraz obrazowanie MRI protonowe pęcherzyka żółciowego myszy. 
Panel lewy przedstawia odsłonięty pęcherzyk żółciowy myszy po lewej stronie linii środkowej po nacięciu brzucha. Zacisk obejmuje wyrostek mieczowaty. Pęcherzyk żółciowy na czczo, wypełniony żółcią, wskazany jest dużą strzałką, a zaklampowany wspólny przewód żółciowy strzałkami przerywanymi. [Wstawka: Wycięty, nienaruszony pęcherzyk żółciowy z zaklampowanym wspólnym przewodem żółciowym. Linijka jest wyskalowana w milimetrach (mm).] Panel prawy przedstawia obraz MRI o wysokiej rozdzielczości, ważony gęstością protonową, pęcherzyka żółciowego myszy na czczo (strzałka). <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54597/54597fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="7">
	<li>Przed wycięciem pęcherzyka żółciowego należy wykonać punkcję serca, pobrać krew i upuścić krew zwierzęciu, aby potwierdzić eutanazję. 
	&#8203;UWAGA: Pobranie najpierw pęcherzyka żółciowego może spowodować przerwanie wątroby, co prowadzi do zapadnięcia się układu sercowo-naczyniowego i uniemożliwia uzyskanie odpowiedniej próbki krwi (≥ 200 µl).</li>
	<li>Odsłonięto dolną stronę lewej przepony i zidentyfikowano bijącą powierzchnię serca. W punkcie maksymalnych pulsacji serca należy przebić przeponę i serce igłą 23G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml.
	<ol>
		<li>Powoli wycofuj strzykawkę, aspirując. Gdy krew zacznie wypełniać strzykawkę, zaprzestań wycofywania i utrzymuj ssanie, aby zebrać 0,2 - 0,6 ml krwi. Delikatne obracanie igłą lub jej lekkie wycofanie może przywrócić przepływ, jeśli ten ustanie.</li>
		<li>Przenieś krew do 1,5-ml probówki z heparyną i wiruj przy 2,000 x g przez 15 min. Wytrąć osocze za pomocą czterech części acetonitrylu i wiruj przy 12,000 x g przez 10 min. Przeanalizuj nadsącz za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC/MS/MS)11-1312-1412-1412-14. W razie potrzeby przechowuj osocze w temperaturze -80 oC przed analizą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając tępej dyssekcji, uwolnij pęcherzyk żółciowy z wątroby. Przetnij wspólny przewód żółciowy poniżej zacisku, usuń i zważ pęcherzyk żółciowy, a następnie umieść go w 1,5-ml probówce do mikrowirówki. Pobierz wątrobę.</li>
	<li>Zhomogenizuj około 100 mg wątroby oraz cały pęcherzyk żółciowy na lodzie w szklanym homogenizatorze do tkanek rozmiaru 21. Wykonaj ekstrakcję za pomocą 75% acetonitrylu i 25% wody (800 µl dla wątroby, 300 µl dla pęcherzyka żółciowego) i wiruj przy 12,000 x g przez 10 min. Rozcieńcz ekstrakty w razie potrzeby i oznacz zawartość kwasów żółciowych metodą LC/MS/MS11-13.</li>
</ol>
3. Obrazowanie rezonansem magnetycznym protonów (1H) i fluoru (19F) in vivo
<ol>
	<li>Aby uzyskać maksymalne napełnienie pęcherzyka żółciowego, należy poddać myszy postowi przez co najmniej 6 hr przed obrazowaniem. W celu zapobiegania ruchom w skanerze MRI, myszy należy znieczulić ketaminą i ksylazyną. Przygotować roztwór zapasowy ketaminy i ksylazyny w soli fizjologicznej (PBS) (130 µl ketaminy, 42.5 µl ksylazyny, 827 µl PBS). Na godzinę przed badaniem MRI, za pomocą sterylnej strzykawki 1-ml, wstrzyknąć myszy podskórnie 5 µl/g masy ciała tego roztworu (65 mg ketaminy i 4.25 mg ksylazyny na kg masy ciała). Aby zapobiec wysychaniu oczu podczas znieczulenia, należy nanieść na oczy zwierzęcia maść weterynaryjną.</li>
	<li>Po indukcji znieczulenia ketaminą/ksylazyną, zgodnie z powyższym, należy wygolić obszar o wielkości 1.5 cm2 w lewej dolnej części brzucha myszy, używając nasadek do strzyżarki elektrycznej #40 lub drobniejszych. Po usunięciu sierści, przygotować obszar, stosując rozcieńczony roztwór chirurgicznego środka odkażającego na bazie jodu (8–12%) i wypłukać 70% alkoholem — powtórzyć oba kroki. Wprowadzić podskórnie igłę/cewnik 24G o długości 0.75 cala i przeprowadzić go do jamy brzusznej. Cofając tłok, należy upewnić się, że cewnik nie znajduje się w kątnicy ani innym narządzie jamy brzusznej — w cewniku nie powinno być krwi ani treści kałowej.</li>
	<li>Usunąć igłę, pozostawiając cewnik dostępu do jamy otrzewnowej. Umieścić mysz na termostatycznej podkładce w komorze dla zwierząt skanera MRI.</li>
	<li>Przygotować sterylną strzykawkę 1-ml zawierającą ketaminę i ksylazynę w soli fizjologicznej (PBS) (1,000 µl ketaminy, 300 µl ksylazyny, 6,700 µl PBS) i napełnić nią sterylną rurkę o odpowiedniej długości (72 cale). Połączyć cewnik dostępu do jamy otrzewnowej z napełnioną sterylną rurką i wyprowadzić ją poza skaner MRI. Aby utrzymać znieczulenie, wstrzykiwać 50 µl tego roztworu co 20 min, jeśli parametry życiowe myszy są stabilne. 
	&#8203;UWAGA: Przed rozpoczęciem obrazowania należy upewnić się, że w pobliżu skanera MRI nie znajdują się żadne elementy metalowe.</li>
	<li>Użyć liniowej cewki wolumetrycznej MRI z podwójnym dostrojeniem do 19F/1H w celu nadawania i odbierania sygnałów częstotliwości radiowej przy 300.283 MHz dla jąder 1H oraz 282.524 MHz dla jąder 19F.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić kalibrację systemu11, 13 oraz lokalizację zwierzęcia za pomocą obrazów orientacyjnych (scout) w trzech płaszczyznach (osiowej, środkowej strzałkowej i czołowej), używając sekwencji FLASH (fast low-angle shot). Aby rozpocząć eksperyment, kliknąć przycisk „traffic light” w oknie Scan Control w konsoli oprogramowania.</li>
		<li>Pozyskać wielowarstwowe obrazy MR 1H, używając sekwencji RARE (rapid acquisition with relaxation enhancement) w przekroju próbki lub ciała zwierzęcia, przy czasie repetycji 2,200 msec, czasie echa 8.9 msec, czynniku RARE 8, polu widzenia 4 x 4 cm2, grubości warstwy 1.0 mm, rozmiarze macierzy 266 x 266, rozdzielczości w płaszczyźnie 150 x 150 µm2 oraz liczbie uśrednień 6. Aby rozpocząć eksperyment, kliknąć przycisk „traffic light” w oknie Scan Control w konsoli oprogramowania.</li>
		<li>Pozyskać obrazy 19F przy użyciu sekwencji FLASH w tym samym obszarze co w badaniu MRI 1H, przy czasie repetycji 220 ms, kącie odchylenia = 30°, czasie echa 3.078 ms, rozmiarze macierzy 32 x 32, rozdzielczości w płaszczyźnie 1.25 x 1.25 mm2, grubości warstwy 4.0 mm i liczbie uśrednień 768. Aby rozpocząć eksperyment, kliknąć przycisk „GOP” (Go- On- Pipeline) w oknie Spectrometer Control Tool w konsoli oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po badaniu MRI, uśmiercić mysz poprzez wstrzyknięcie do jamy otrzewnowej roztworu ketaminy/ksylazyny w dawce 15 µl/g masy ciała (150 mg ketaminy/18 mg ksylazyny na kg masy ciała), a następnie wykonać nakłucie serca w celu upuszczenia krwi.</li>
	<li>Aby wybudzić mysz z znieczulenia, usunąć cewnik dostępu do jamy otrzewnowej, jednak nie pozostawiać zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję w leżeniu brzusznym.</li>
	<li>W celu pomiaru stężeń kwasów żółciowych znakowanych 19F11-13 z pobranych narządów, utrzymać znieczulenie ketaminą i ksylazyną zgodnie z powyższym opisem.</li>
</ol>

<ol><li>Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bile-acid+signalling+for+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 7, 678-693 (2008).</li>
<li>Vallim, T. Q., Edwards, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+have+the+gall+to+function+as+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Bile acids have the gall to function as hormones.</a> Cell Metab. 10, 162-164 (2009).</li>
<li>Dawson, P. A., Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+Review+Series%3A+Intestinal+Lipid+Metabolism%3A+New+Developments+and+Current+Insights+Intestinal+transport+and+metabolism+of+bile+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic Review Series: Intestinal Lipid Metabolism: New Developments and Current Insights Intestinal transport and metabolism of bile acids.</a> Journal of Lipid Research. 56, 1085-1099 (2015).</li>
<li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+the+ileal+bile+acid+transporter+eliminates+enterohepatic+cycling+of+bile+acids+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of the ileal bile acid transporter eliminates enterohepatic cycling of bile acids in mice.</a> J Biol Chem. 278, 33920-33927 (2003).</li>
<li>Pattni, S., Walters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+bile+acid+malabsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of bile acid malabsorption.</a> Br Med Bull. 92, 79-93 (2009).</li>
<li>Walters, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mechanism+for+bile+acid+diarrhea%3A+defective+feedback+inhibition+of+bile+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A new mechanism for bile acid diarrhea: defective feedback inhibition of bile acid biosynthesis.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1189-1194 (2009).</li>
<li>Hofmann, A. F., Mangelsdorf, D. J., Kliewer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+diarrhea+due+to+excessive+bile+acid+synthesis+and+not+defective+ileal+transport%3A+a+new+syndrome+of+defective+fibroblast+growth+factor+19+release%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Chronic diarrhea due to excessive bile acid synthesis and not defective ileal transport: a new syndrome of defective fibroblast growth factor 19 release.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1151-1154 (2009).</li>
<li>Flynn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholic+acid+promotes+the+growth+of+colonic+aberrant+crypt+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Deoxycholic acid promotes the growth of colonic aberrant crypt foci.</a> Mol Carcinog. 46, 60-70 (2007).</li>
<li>Glinghammar, B., Rafter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenesis+in+the+colon%3A+interaction+between+luminal+factors+and+genetic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer+Prev%22%5BJournal%5D)">Carcinogenesis in the colon: interaction between luminal factors and genetic factors.</a> Eur J Cancer Prev. 8, S87-S94 (1999).</li>
<li>Bernstein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+deoxycholate%2C+a+secondary+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of deoxycholate, a secondary bile acid.</a> Arch Toxicol. 85, 863-871 (2011).</li>
<li>Zheng, X., Ekins, S., Raufman, J. P., Polli, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+models+for+drug+inhibition+of+the+human+apical+sodium-dependent+bile+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Computational models for drug inhibition of the human apical sodium-dependent bile acid transporter.</a> Mol Pharm. 6, 1591-1603 (2009).</li>
<li>Vivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+a+novel+fluorinated+magnetic+resonance+imaging+agent+for+functional+analysis+of+bile+Acid+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile Acid transporter activity.</a> Pharm Res. 30, 1240-1251 (2013).</li>
<li>Vivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+a+novel+trifluorinated+imaging+agent+for+assessment+of+bile+acid+transport+using+fluorine+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of a novel trifluorinated imaging agent for assessment of bile acid transport using fluorine magnetic resonance imaging.</a> J Pharm Sci. 103, 3782-3792 (2014).</li>
<li>Vivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+a+novel+fluorinated+magnetic+resonance+imaging+agent+for+functional+analysis+of+bile+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile acid transport.</a> Mol Pharm. 11, 1575-1582 (2014).</li>
<li>Raufman, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Magnetic+Resonance+Imaging+to+Detect+Biliary+Excretion+of+19F-Labeled+Drug+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Detect Biliary Excretion of 19F-Labeled Drug in Mice.</a> Drug Metab Dispos. 39, 736-739 (2011).</li>
<li>Ridlon, J. M., Kang, D. J., Hylemon, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salt+biotransformations+by+human+intestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria.</a> J Lipid Res. 47, 241-259 (2006).</li>
<li>Frisch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-11C%5Dcholylsarcosine%2C+a+novel+bile+acid+tracer+for+PET%2FCT+of+hepatic+excretory+function%3A+radiosynthesis+and+proof-of-concept+studies+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">N-methyl-11C]cholylsarcosine, a novel bile acid tracer for PET/CT of hepatic excretory function: radiosynthesis and proof-of-concept studies in pigs.</a> J Nucl Med. 53, 772-778 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Synteza CA-lys-TFA i CA-sar-TFMA oraz analiza in vitro ich transportu przy użyciu stabilnie transfekowanych komórek nerkowych psów Madin-Darby eksprymujących ASBT i ludzkich embrionalnych komórek nerkowych eksprymujących polipeptyd kotransportujący sód / taurocholan (NTCP) są szczegółowo opisane w innym miejscu13,14. W tym przypadku nacisk kładziony jest na doustne podawanie MFBA przez zgłębnik żywym zwierzętom, a następnie pobieranie pęcherzyka żółciowego, wątroby i krwi w celu analizy zawartości MFB...

Kwasom żółciowym, obok ich klasycznej roli detergentów ułatwiających wchłanianie tłuszczów z jelit, przypisuje się funkcję silnych cząsteczek sygnałowych wpływających na wiele organów, poza tymi powiązanymi z ich krążeniem wątrobowo-jelitowym1,2. Oprócz kontrolowania własnego metabolizmu, kwasy żółciowe modulują kilka aspektów fizjologii przewodu pokarmowego (np. motorykę jelit i produkcję hormonów inkretynowych, fizjologię okrężnicy oraz podatność na nowotwory) i wywierają systemowy wpływ na napięcie naczyniowe, metabolizm glukozy i lipidów oraz wykorzystanie energii. Podczas gdy niektóre z tych efektów są zapośredniczone w jelitach, inne wynikają z poposiłkowych zmian systemowych poziomów kwasów żółciowych, co zauważono u pacjentów z otyłością lub po operacji pominięcia żołądka (gastric by-pass). Aby wyjaśnić złożone działania metaboliczne kwasów żółciowych, wymagana jest nowa technologia umożliwiająca jednoczesne monitorowanie poziomów kwasów żółciowych w różnych przedziałach anatomicznych, w przewodzie pokarmowym i tkankach metabolicznych (wątrobie, trzustce, mięśniach szkieletowych i tkance tłuszczowej). Uzyskanie takich informacji czasowych i przestrzennych wymaga innowacyjnej technologii – obrazowanie in vivo z wykorzystaniem nowych znaczników kwasów żółciowych, opisane w niniejszym materiale, stanowi właśnie takie nowatorskie podejście.
Skład i rozkład kwasów żółciowych w przedziałach anatomicznych są regulowane przez czynniki modulujące ich syntezę wątrobową i wchłanianie w jelicie krętym, w tym dietę, zabiegi chirurgiczne, stosowanie antybiotyków oraz zmiany w florze jelitowej. Kluczowym regulatorem wchłaniania kwasów żółciowych w jelitach w celu ich krążenia wątrobowo-jelitowego3 (Rysunek 1) jest apikalny transporter kwasów żółciowych zależny od sodu w jelicie krętym (ASBT; SLC10A2). Chociaż pasywne wchłanianie zachodzi w całym jelicie, ASBT pośredniczy w pobieraniu 95% jelitowych kwasów żółciowych, dzięki czemu w warunkach prawidłowych do kału przedostaje się niewielka ilość kwasów żółciowych. Myszy z niedoborem Asbt (Slc10a2-/-) wykazują zwiększoną zawartość kwasów żółciowych w kale oraz zmniejszoną pulę kwasów żółciowych4.
<img alt="Rycina 1" src="/files/ftp_upload/54597/54597fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Krążenie wątrobowo-jelitowe kwasów żółciowych. 
Ilustracja krążenia wątrobowo-jelitowego, w którym kwasy żółciowe są syntetyzowane w wątrobie, wydzielane do dróg żółciowych, magazynowane w pęcherzyku żółciowym, uwalniane do proksymalnego odcinka jelita cienkiego podczas posiłków i aktywnie pobierane poprzez ASBT w końcowym odcinku jelita krętego. Podczas gdy niewielkie ilości kwasów żółciowych są wchłaniane pasywnie w całym przewodzie pokarmowym, około 95% jelitowych kwasów żółciowych jest transportowanych aktywnie przez ASBT, co skutkuje minimalną (około 5%) utratą z kałem, która jest rekompensowana syntezą podobnej ilości nowych kwasów żółciowych w wątrobie, co pozwala na utrzymanie stałej puli kwasów żółciowych. Strzałki po prawej stronie wskazują czynniki, które mogą wpływać na stabilność natywnych i znakowanych fluorem kwasów żółciowych, w tym kwas żołądkowy, enzymy trzustkowe i błonówki jelitowej oraz, co najważniejsze, enzymy hydrolityczne uwalniane przez gatunki Clostridial kolonizujące dystalny odcinek jelita cienkiego i jelito grube. (Zmodyfikowano za zgodą16) <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54597/54597fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Złe wchłanianie kwasów żółciowych można podzielić na trzy typy, z których każdy zwiększa ilość dihydroksylowych kwasów żółciowych w kale, powodując tym samym przerywaną lub przewlekłą biegunkę. Typ 1 wynika z rozległych zmian patologicznych w jelicie krętym (np. resekcja, choroba Crohna)5. Typ 3 jest następstwem cholecystektomii, wagotomii, celiakii, przerostu bakteryjnego oraz niewydolności trzustki. Z kolei osoby z „pierwotnym” (typ 2) złym wchłanianiem kwasów żółciowych stanowią ogromne wyzwanie diagnostyczne, ponieważ nie występują u nich takie stany poprzedzające ani nie ma dowodów na patologię w jelicie krętym. W związku z tym pierwotne złe wchłanianie kwasów żółciowych jest często błędnie diagnozowane jako zespół jelita drażliwego z przewagą biegunek (IBS-D), który jest prawdopodobnie najczęstszym powodem wizyt ambulatoryjnych w gabinetach gastroenterologicznych. Szacuje się, że jedna trzecia pacjentów z IBS-D cierpi na pierwotne złe wchłanianie kwasów żółciowych; w USA może to dotyczyć kilku milionów osób5. Niedawne odkrycia wskazują, że pierwotne BAM wynika z upośledzonego hamowania zwrotnego syntezy kwasów żółciowych w wątrobie przez jelitowy czynnik wzrostu fibroblastów-19 (FGF19), a nie ze zmniejszonej ekspresji lub funkcji ASBT.
W pierwotnym zaburzeniu wchłaniania kwasów żółciowych niskie stężenie FGF19 w osoczu nie hamuje syntezy kwasów żółciowych w wątrobie – wynikający z tego wzrost poziomu kwasów żółciowych w jelitach nasyca transportery kwasów żółciowych, w tym ASBT, a zwiększone wydalanie kwasów żółciowych z kałem powoduje biegunkę6 (Rycina 2). Myszy z niedoborem Fgf15 (mysi odpowiednik FGF19) charakteryzują się powiększoną pulą kwasów żółciowych oraz zwiększoną ilością kwasów żółciowych w kale7.
<img alt="Rysunek 2" src="/files/ftp_upload/54597/54597fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Mechanizmy złego wchłaniania kwasów żółciowych w jelitach. 
W warunkach prawidłowych, jak pokazano na panelu A, około 95% kwasów żółciowych w jelitach jest wchłaniane poprzez transport aktywny w końcowym odcinku jelita krętego za pośrednictwem ASBT. Gdy ekspresja lub aktywność ASBT jest obniżona (panel B), upośledzone pobieranie kwasów żółciowych w jelitach prowadzi do przedostania się kwasów żółciowych do jelita grubego. W przypadku upośledzenia sygnalizacji FGF19 (panel C), brak hamowania zwrotnego syntezy kwasów żółciowych w wątrobie skutkuje zwiększeniem stężeń kwasów żółciowych w jelitach, co przekracza pojemność transportową ASBT i prowadzi do przedostania się kwasów żółciowych do jelita grubego. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54597/54597fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Długotrwałe, przewlekłe podwyższenie poziomu kwasów żółciowych w kale może sprzyjać powstawaniu nowotworów jelita grubego. Nowotwory jelita grubego rozwijają się w wyniku postępującej dysplazji błony śluzowej związanej z somatycznymi mutacjami genów, jednak czynniki środowiskowe zwiększające ilość kwasów żółciowych w kale mogą przyspieszać i potęgować ten proces. U gryzoni zwiększona ilość kwasów żółciowych w kale, wynikająca z podaży egzogennej lub niedoboru Asbt, sprzyja dysplazji jelita grubego oraz tworzeniu się guzów8-10.
Warto zauważyć, że prowokacyjne wyniki badań wskazują, iż powszechnie stosowane leki zatwierdzone przez Food and Drug Administration (FDA) silnie hamują transport kwasów żółciowych przez ASBT in vitro11. Jeśli leki te ograniczają transport kwasów żółciowych w jelicie cienkim in vivo i zwiększają ich poziom w kale, potencjalny wpływ na patologię jelita grubego byłby niepokojący. Nawet niewielki wzrost patologii jelita grubego przypisywany stosowaniu takiego leku mógłby mieć istotny wpływ na zdrowie publiczne. Zestaw narzędzi umożliwiający ocenę prawdopodobieństwa tych wyników in vitro oraz obserwacji epidemiologicznych mógłby stymulować dalsze badania, w tym badania bezpieczeństwa po wprowadzeniu produktu do obrotu.
Mimo zapotrzebowania, brakuje praktycznych testów pozwalających zidentyfikować osoby z zespołem złego wchłaniania kwasów żółciowych. Bezpośredni pomiar kwasów żółciowych w kale został odrzucony lata temu jako uciążliwy, niepraktyczny i niewiarygodny5. Alternatywne podejścia obejmują pomiar retencji pochodnej kwasu cholewego znakowanej radioaktywnym selenem (75SeHCAT) i poziomu 7α-hydroksy-4-cholesten-3-onu (C4) w osoczu, lub próbę terapeutyczną z zastosowaniem adsorbentów kwasów żółciowych. Test 75SeHCAT ma ograniczoną dostępność w Europie i nie jest zatwierdzony przez FDA ani dostępny do użytku w USA. Ponadto nawet niewielka ekspozycja na promieniowanie (0,26 mSv/test 75SeHCAT) podczas diagnostyki budzi obawy, a przerost bakteryjny i zaawansowana choroba wątroby mogą zafałszować wyniki 75SeHCAT. Badanie C4 jest potencjalnie atrakcyjne, ponieważ wymagany jest jedynie materiał z osocza, jednak charakteryzuje się niską wartością predykcyjną dodatnią i nie jest powszechnie dostępne. Pomiar poziomu FGF19 w surowicy wiąże się z podobnymi ograniczeniami. Klinicyści często decydują się na próbę terapeutyczną z sekwestrantami kwasów żółciowych, lecz podejście to nie pozwala na postawienie definitywnej diagnozy zespołu złego wchłaniania kwasów żółciowych5.
Z tych powodów opracowano nowatorskie podejście MRI w celu pomiaru transportu i dystrybucji kwasów żółciowych in vivo z wykorzystaniem innowacyjnych wielofluorowanych kwasów żółciowych (MFBA-MRI). MFBA zawierające trzy atomy fluoru (19F), stabilny izotop o 100% naturalnej obfitości, są transportowane podobnie jak rodzime kwasy żółciowe12 i mogą być wykorzystane do wizualizacji transportu kwasów żółciowych przy użyciu kombinacji MRI protonowego (1H) i fluorowego (19F), co stanowi czułą i bezpieczną metodę bez narażenia na promieniowanie jonizujące13,14.

<table><tbody><tr><td>Młynek do tkanek szklanych Duall rozmiar-21</td><td>Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ</td><td>885351-0022</td><td></td></tr><tr><td>Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T z otworem poziomym Skaner MR</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH, Niemcy</td><td></td><td>Użyj towarzyszącego oprogramowania Paravision w wersji 5.1 (patrz krok 3.5)</td></tr><tr><td>Bruker 40 mm 19F/1H podwójnie dostrojona cewka objętościowa linerar</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH, Niemcy</td><td></td><td>Użyj towarzyszącego oprogramowania Paravision w wersji 5.1 (patrz krok 3.5)</td></tr><tr><td>System Waters Acquity UPLC z detektorem kwadrupolowym</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC hybrydowy mostek etylenowy C8 1.7 i mu; m kolumna 2,1 x 50 mm</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła do gavage Braintree</td><td>Scientific, INC.</td><td>N-010</td><td>20 G-1,5" zakrzywiona kula 2,25 mm</td></tr><tr><td>2 hemostatyki ze stali nierdzewnej&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10755-018</td><td>4 i 5 cali, prosta</td></tr><tr><td>ketamina</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>501090</td><td>Ketamin zetamin 100 mg / ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn, Inc.</td><td></td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Cewnik dootrzewnowy</td><td>Abbott</td><td>AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42</td><td>24-G x 0,75"</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie wielofluorowanych kwasów żółciowych i rezonansu magnetycznego in vivo do pomiaru transportu kwasów żółciowych

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Wraz z ich tradycyjną rolą jako detergentów ułatwiających wchłanianie tłuszczu, pojawiająca się literatura wskazuje, że kwasy żółciowe są silnymi cząsteczkami sygnałowymi, które wpływają na wiele narządów; modulują one motorykę jelit i produkcję hormonów, a także zmieniają napięcie naczyń krwionośnych, metabolizm glukozy, metabolizm lipidów i wykorzystanie energii. Zmiany w kwasach żółciowych w kale mogą zmieniać mikrobiom jelitowy i sprzyjać patologii jelita grubego, w tym biegunce cholerycznej i rakowi jelita grubego. Kluczowymi regulatorami składu kwasów żółciowych w kale są transporter kwasów żółciowych zależny od sodu wierzchołkowego jelita cienkiego (ASBT) i czynnik wzrostu fibroblastów-19 (FGF19). Zmniejszona ekspresja i funkcja ASBT zmniejsza wchłanianie kwasów żółciowych przez jelita. Co więcej, dane z badań in vitro sugerują, że niektóre leki zatwierdzone przez FDA hamują funkcję ASBT. Niedostateczne uwalnianie FGF19 zwiększa syntezę kwasów żółciowych w wątrobie i uwalnianie ich do jelit do poziomów, które przytłaczają ASBT. Dysfunkcja ASBT lub niedobór FGF19 zwiększa poziom kwasów żółciowych w kale i może powodować przewlekłą biegunkę i sprzyjać nowotworowi jelita grubego. Niestety, narzędzia do pomiaru złego wchłaniania kwasów żółciowych oraz wpływu leków na transport kwasów żółciowych in vivo są ograniczone. Aby zrozumieć złożone działanie kwasów żółciowych, potrzebne są techniki, które umożliwiają jednoczesne monitorowanie kwasów żółciowych w jelitach i tkankach metabolicznych. To skłoniło nas do opracowania innowacyjnej metody pomiaru transportu kwasów żółciowych u żywych zwierząt przy użyciu kombinacji rezonansu magnetycznego (MRI) protonów (1H) i fluoru (19F). Stworzono i przetestowano nowe znaczniki do rezonansu magnetycznego żywych zwierząt na bazie fluoru (19F), zarówno in vitro, jak i in vivo. Mocne strony tego podejścia to brak ekspozycji na promieniowanie jonizujące i potencjał translacyjny dla badań klinicznych i praktyki.

Zastosowanie MFBA do in vivo Obrazowanie MRI w celu „obserwacji” transportu kwasów żółciowych w czasie rzeczywistym ma ogromny potencjał zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych. Co więcej, opisane tutaj metody resekcji pęcherzyka żółciowego oraz analizy biochemicznej jego zawartości przy użyciu chromatografii cieczowej i spektrometrii mas stanowią sposób na potwierdzenie wyników obrazowania. Jednak wiarygodność tych metod wymaga precyzyjnego dawkowania, odpowiednie...

Narzędzia do diagnozowania zaburzeń wchłaniania kwasów żółciowych i pomiaru transportu kwasów żółciowych in vivo są ograniczone. Opisano innowacyjne podejście na żywych zwierzętach, które wykorzystuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego protonem (1H) i fluorem (19F); Ta nowatorska metodologia ma potencjał translacyjny w badaniach przesiewowych w kierunku złego wchłaniania kwasów żółciowych w praktyce klinicznej.

Wykorzystanie wielofluorowanych kwasów żółciowych i rezonansu magnetycznego in vivo do pomiaru transportu kwasów żółciowych

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Ogólnym celem tej procedury jest znakowanie kwasów żółciowych naturalnie występującym, nieradioaktywnym fluorem w celu pomiaru ich stężenia w pęcherzyku żółciowym za pomocą MRI, aby ocenić transport kwasów żółciowych u żywych zwierząt. Podejście to stwarza możliwość identyfikacji osób z przewlekłą biegunką, które powinny być leczone z powodu zespołu złego wchłaniania kwasów żółciowych. Głównymi zaletami tej metody są brak konieczności narażania na promieniowanie jonizujące oraz duży potencjał translacyjny zarówno w badaniach klinicznych, jak i w praktyce lekarskiej.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że w Stanach Zjednoczonych nie istnieją praktyczne testy kliniczne pozwalające wykryć zaburzenia transportu kwasów żółciowych w jelitach. Należy rozpocząć od napełnienia strzykawki o pojemności 1 ml odpowiednią objętością roztworu zapasowego kwasów żółciowych znakowanych fluorem, a następnie podłączyć zakrzywioną igłę do zgłębnikowania żołądka o rozmiarze 20G i długości 1,5 cala z zaokrąglonym końcem. Następnie kciukiem i palcem wskazującym należy mocno chwycić mysz za luźną skórę na karku, a pozostałymi palcami chwycić skórę w dolnej części grzbietu oraz ogon.Trzymając zwierzę w pozycji pionowej, wprowadź igłę do zgłębnikowania wzdłuż boku i podniebienia do przełyku, a następnie w dół do żołądka. W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu wykonaj cięcie skóry brzucha po linii środkowej od kości łonowej do wyrostka xifoidego, a następnie wykonaj odpowiadające mu cięcie przez wyściółkę otrzewnej, aby odsłonić narządy jamy brzusznej, nie przebijając przepony. Następnie użyj pięciocalowego zacisku, aby unieść wyrostek xifoideus, odsłaniając górną część jamy brzusznej.Używając pęsety i tępego narzędzia, przeprowadź dyssekcję i odsunie wątrobę, aby odsłonić woreczek żółciowy. Następnie załóż zacisk czterocalowy na wspólny przewód żółciowy i przetnij więzadło łączące biegun górny woreczka żółciowego z przeponą, umożliwiając przesunięcie woreczka żółciowego na prawą stronę jamy brzusznej. Należy pamiętać o jak najszybszym założeniu zacisku na wspólny przewód żółciowy po wykonaniu laparotomii, aby uniknąć przerwania ciągłości tkanki wątroby lub przypadkowego opróżnienia woreczka żółciowego.Po upuszczeniu krwi przenieś pobraną krew do 1,5-mililitrowej probówki z heparyną w celu odwirowania. Wytrącenie białek z osocza przeprowadź, dodając cztery części acetonitrylu, a następnie ponownie odwiruj próbkę krwi. Następnie przeanalizuj nadsącz za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.Aby uwolnić pęcherzyk żółciowy, należy przeprowadzić tępe rozwarstwienie otaczających tkanek, a następnie przeciąć wspólny przewód żółciowy poniżej zacisku. Zważony pęcherzyk żółciowy należy umieścić w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie usunąć wątrobę. W celu ekstrakcji tkanek należy dodać 75% acetonitrylu i 25% wody, a następnie zhomogenizować około 100 mg wątroby oraz cały pęcherzyk żółciowy w osobnych szklanych homogenizatorach tkankowych o rozmiarze 21 na lodzie.Przenieś próbki do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml i odwiruj. Następnie rozcieńcz ekstrakty w odpowiedni sposób i oznacz zawartość kwasów żółciowych za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu oczyść wewnętrzną stronę lewego uda znieczawionej myszy i wprowadź podskórnie przez udo do jamy brzusznej kaniulę igłową o rozmiarze 24G i długości 0,75 cala.Wyjmij igłę, pozostawiając cewnik w jamie otrzewnowej. Przenieś mysz na podkładkę dla zwierząt w skanerze MRI i przymocuj termostatowaną podkładkę grzewczą. Podłącz cewnik do 72-calowego odcinka sterylnego przewodu, a przewód do sterylnej strzykawki o pojemności 1 mililitra w celu podtrzymania znieczulenia przez cały czas trwania procedury.Po upewnieniu się, że w pobliżu skanera nie znajdują się żadne metalowe przedmioty, należy użyć liniowej cewki wolumetrycznej MRI z podwójnym dostrojeniem do protonów fluoru do nadawania i odbierania sygnałów częstotliwości radiowej. Następnie należy zastosować sekwencję fast low angle shot w celu uzyskania obrazów skóry głowy w trzech przekrojach, aby skalibrować system i zweryfikować pozycję zwierzęcia. Aby rozpocząć eksperyment, należy kliknąć przycisk sygnalizacji świetlnej, aby pozyskać wieloprzekrojowe obrazy rezonansu magnetycznego protonów, wykorzystując sekwencję rapid acquisition with relaxation and enhancement w widoku poprzecznym próbki.Na koniec kliknij przycisk GOP w oknie narzędzia sterującego spektrometrem, aby uzyskać obrazy fluoru, wykorzystując drugą szybką sekwencję ujęć pod niskim kątem w tym samym obszarze. Stosując tę metodę, w pęcherzyku żółciowym można zmierzyć wysoce selektywne stężenie wielofluorowanych kwasów żółciowych (MFBA), które jest o trzy rzędy wielkości wyższe niż poziomy obserwowane w wątrobie lub osoczu, co jest niezgodne z fizjologicznymi poziomami kwasów żółciowych. Zgodnie z oczekiwaniami dotyczącymi fizjologicznej kinetyki krążenia jelitowo-wątrobowego kwasów żółciowych, szczytowe stężenia MFBA w pęcherzyku żółciowym są widoczne od czterech do siedmiu godzin po podaniu doustnym.Rzeczywiście, od dwóch i pół do czterech godzin po podaniu MFBA drogą doustną obserwuje się sygnały fluoru pochodzące z obszaru, który wydaje się być wspólnym przewodem żółciowym, oraz silniejszy sygnał pochodzący z pęcherzyka żółciowego. Po siedmiu do ośmiu i pół godzinach sygnał ze wspólnego przewodu żółciowego nie jest już wykrywalny, a sygnał fluoru z pęcherzyka żółciowego wzrasta do tej samej intensywności, co sygnał pochodzący z sąsiedniego fantomu MFBA. U myszy z deficytem apikalnego sodowo-zależnego transportera kwasów żółciowych, które wykazują zmniejszone wchłanianie kwasów żółciowych w jelitach, następuje około 22-krotny spadek stężenia MFBA w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami typu dzikiego.Rzeczywiście, podczas gdy silny sygnał fluoru jest wykrywany w pęcherzykach żółciowych myszy typu dzikiego, nie występuje odpowiadający mu sygnał fluoru u zwierząt z deficytem apikalnego sodowo-zależnego transportera kwasów żółciowych, co potwierdza zarówno to, że MFBA są metabolizowane w sposób podobny do fizjologicznych kwasów żółciowych, jak i to, że MRI z użyciem MFBA może być stosowane do wykrywania zaburzeń wchłaniania kwasów żółciowych w jelitach. Po opanowaniu techniki i prawidłowym przeprowadzeniu, laparotomia, pobranie krwi oraz nacięcie pęcherzyka żółciowego i wątroby mogą zostać wykonane w ciągu 20 minut. Akwizycja sygnału podczas MRI trwa od półtorej do dwóch godzin.Po opracowaniu i komercjalizacji technika ta może utorować drogę do badania roli transportu kwasów żółciowych w jelitach w fizjologii i patologii zarówno u małych zwierząt, jak i u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu podawania kwasów żółciowych znakowanych izotopami obcymi u małych zwierząt oraz metody pomiaru ich wychwytu w wątrobie i pęcherzyku żółciowym za pomocą MRI lub poprzez nacięcie organów.

using-multi-fluorinated-bile-acids-vivo-magnetic-resonance-imaging-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Tutaj opisujemy technikę kannuacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów, która umożliwia ilościowe określenie transportu lipidów i leków przez układ limfatyczny po porodzie jelitowym. Technika ta może być dostosowana do oceny stężenia limfy krezkowej i/lub transportu płynu, komórek odpornościowych, peptydów, białek i cząsteczek lipofilowych.

Model szczura kaniulowanego kaniulowanego w krezkowym przewodzie chłonnym: zastosowanie do oceny transportu leków limfatycznych w jelitach

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania dynamiki kwasów żółciowych w żywych komórkach za pomocą genetycznie kodowanego czujnika BAS FRET. Ten czujnik kwasu żółciowego stanowi unikalne narzędzie do badania (regulacji) transportu kwasów żółciowych i aktywacji FXR w szerokim zakresie typów komórek.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowej dynamiki kwasów żółciowych za pomocą genetycznie kodowanego czujnika kwasów żółciowych opartego na FRET

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Dostęp składników odżywczych, metabolitów mikrobioty i leków do krążenia jest kontrolowany przez barierę jelitowo-krwionośną (GBB). Opisujemy bezpośrednią metodę pomiaru przepuszczalności GBB in vivo, na którą, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod pośrednich, praktycznie nie ma wpływu na funkcje wątroby i nerek.

Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

Ten protokół ma na celu monitorowanie in vivo zmian mielinowych (demielinizacja i remielinizacja) za pomocą obrazowania metodą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w zwierzęcym modelu stwardnienia rozsianego.

Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej do pomiaru in vivo zawartości mieliny w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

Protokół ten wykorzystuje wielokomorowe łóżko do równoległego rezonansu magnetycznego (MRI) do czterech zwierząt do wykrywania guzów gruczolakoraka trzustki w genetycznie modyfikowanych modelach myszy. Ten protokół MRI wielozwierzęcy jest szybki i opłacalny w wykrywaniu i pomiarze guzów, ułatwiając selekcję zwierząt do badań przedklinicznych oraz podłużne monitorowanie wzrostu guzów.

Wielozwierzęce obrazowanie rezonansu magnetycznego do pomiarów guza w myszych modelach raka trzustki

Dokładna i praktyczna metoda pomiaru parametrów takich jak odkształcenie (strain) w tkance mięśnia sercowego ma dużą wartość kliniczną, ponieważ wykazano, że odkształcenie jest czulszym i wcześniejszym markerem dysfunkcji kurczliwości niż często stosowany parametr EF.

Ocena odkształcenia mięśnia sercowego w rezonansie magnetycznym z wykorzystaniem śledzenia cech (feature tracking)

Poznaj metodę etykietowania kwasów żółciowych fluorem i pomiaru ich stężenia w pęcherzyku żółciowym za pomocą rezonansu magnetycznego u żywych zwierząt. Technika ta pozwala na nieinwazyjną diagnostykę zaburzonego wchłaniania kwasów żółciowych bez ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

Wykorzystanie wielofluorowanych kwasów żółciowych i rezonansu magnetycznego in vivo do pomiaru transportu kwasów żółciowych

Przeglądaj więcej filmów