Wykorzystanie wielofluorowanych kwasów żółciowych i rezonansu magnetycznego in vivo do pomiaru transportu kwasów żółciowych

Ogólnym celem tej procedury jest znakowanie kwasów żółciowych naturalnie występującym, nieradioaktywnym fluorem w celu pomiaru ich stężenia w pęcherzyku żółciowym za pomocą MRI, aby ocenić transport kwasów żółciowych u żywych zwierząt. Podejście to stwarza możliwość identyfikacji osób z przewlekłą biegunką, które powinny być leczone z powodu zespołu złego wchłaniania kwasów żółciowych. Głównymi zaletami tej metody są brak konieczności narażania na promieniowanie jonizujące oraz duży potencjał translacyjny zarówno w badaniach klinicznych, jak i w praktyce lekarskiej.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że w Stanach Zjednoczonych nie istnieją praktyczne testy kliniczne pozwalające wykryć zaburzenia transportu kwasów żółciowych w jelitach. Należy rozpocząć od napełnienia strzykawki o pojemności 1 ml odpowiednią objętością roztworu zapasowego kwasów żółciowych znakowanych fluorem, a następnie podłączyć zakrzywioną igłę do zgłębnikowania żołądka o rozmiarze 20G i długości 1,5 cala z zaokrąglonym końcem. Następnie kciukiem i palcem wskazującym należy mocno chwycić mysz za luźną skórę na karku, a pozostałymi palcami chwycić skórę w dolnej części grzbietu oraz ogon.

Trzymając zwierzę w pozycji pionowej, wprowadź igłę do zgłębnikowania wzdłuż boku i podniebienia do przełyku, a następnie w dół do żołądka. W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu wykonaj cięcie skóry brzucha po linii środkowej od kości łonowej do wyrostka xifoidego, a następnie wykonaj odpowiadające mu cięcie przez wyściółkę otrzewnej, aby odsłonić narządy jamy brzusznej, nie przebijając przepony. Następnie użyj pięciocalowego zacisku, aby unieść wyrostek xifoideus, odsłaniając górną część jamy brzusznej.

Używając pęsety i tępego narzędzia, przeprowadź dyssekcję i odsunie wątrobę, aby odsłonić woreczek żółciowy. Następnie załóż zacisk czterocalowy na wspólny przewód żółciowy i przetnij więzadło łączące biegun górny woreczka żółciowego z przeponą, umożliwiając przesunięcie woreczka żółciowego na prawą stronę jamy brzusznej. Należy pamiętać o jak najszybszym założeniu zacisku na wspólny przewód żółciowy po wykonaniu laparotomii, aby uniknąć przerwania ciągłości tkanki wątroby lub przypadkowego opróżnienia woreczka żółciowego.

Po upuszczeniu krwi przenieś pobraną krew do 1,5-mililitrowej probówki z heparyną w celu odwirowania. Wytrącenie białek z osocza przeprowadź, dodając cztery części acetonitrylu, a następnie ponownie odwiruj próbkę krwi. Następnie przeanalizuj nadsącz za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Aby uwolnić pęcherzyk żółciowy, należy przeprowadzić tępe rozwarstwienie otaczających tkanek, a następnie przeciąć wspólny przewód żółciowy poniżej zacisku. Zważony pęcherzyk żółciowy należy umieścić w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie usunąć wątrobę. W celu ekstrakcji tkanek należy dodać 75% acetonitrylu i 25% wody, a następnie zhomogenizować około 100 mg wątroby oraz cały pęcherzyk żółciowy w osobnych szklanych homogenizatorach tkankowych o rozmiarze 21 na lodzie.

Przenieś próbki do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml i odwiruj. Następnie rozcieńcz ekstrakty w odpowiedni sposób i oznacz zawartość kwasów żółciowych za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu oczyść wewnętrzną stronę lewego uda znieczawionej myszy i wprowadź podskórnie przez udo do jamy brzusznej kaniulę igłową o rozmiarze 24G i długości 0,75 cala.

Wyjmij igłę, pozostawiając cewnik w jamie otrzewnowej. Przenieś mysz na podkładkę dla zwierząt w skanerze MRI i przymocuj termostatowaną podkładkę grzewczą. Podłącz cewnik do 72-calowego odcinka sterylnego przewodu, a przewód do sterylnej strzykawki o pojemności 1 mililitra w celu podtrzymania znieczulenia przez cały czas trwania procedury.

Po upewnieniu się, że w pobliżu skanera nie znajdują się żadne metalowe przedmioty, należy użyć liniowej cewki wolumetrycznej MRI z podwójnym dostrojeniem do protonów fluoru do nadawania i odbierania sygnałów częstotliwości radiowej. Następnie należy zastosować sekwencję fast low angle shot w celu uzyskania obrazów skóry głowy w trzech przekrojach, aby skalibrować system i zweryfikować pozycję zwierzęcia. Aby rozpocząć eksperyment, należy kliknąć przycisk sygnalizacji świetlnej, aby pozyskać wieloprzekrojowe obrazy rezonansu magnetycznego protonów, wykorzystując sekwencję rapid acquisition with relaxation and enhancement w widoku poprzecznym próbki.

Na koniec kliknij przycisk GOP w oknie narzędzia sterującego spektrometrem, aby uzyskać obrazy fluoru, wykorzystując drugą szybką sekwencję ujęć pod niskim kątem w tym samym obszarze. Stosując tę metodę, w pęcherzyku żółciowym można zmierzyć wysoce selektywne stężenie wielofluorowanych kwasów żółciowych (MFBA), które jest o trzy rzędy wielkości wyższe niż poziomy obserwowane w wątrobie lub osoczu, co jest niezgodne z fizjologicznymi poziomami kwasów żółciowych. Zgodnie z oczekiwaniami dotyczącymi fizjologicznej kinetyki krążenia jelitowo-wątrobowego kwasów żółciowych, szczytowe stężenia MFBA w pęcherzyku żółciowym są widoczne od czterech do siedmiu godzin po podaniu doustnym.

Rzeczywiście, od dwóch i pół do czterech godzin po podaniu MFBA drogą doustną obserwuje się sygnały fluoru pochodzące z obszaru, który wydaje się być wspólnym przewodem żółciowym, oraz silniejszy sygnał pochodzący z pęcherzyka żółciowego. Po siedmiu do ośmiu i pół godzinach sygnał ze wspólnego przewodu żółciowego nie jest już wykrywalny, a sygnał fluoru z pęcherzyka żółciowego wzrasta do tej samej intensywności, co sygnał pochodzący z sąsiedniego fantomu MFBA. U myszy z deficytem apikalnego sodowo-zależnego transportera kwasów żółciowych, które wykazują zmniejszone wchłanianie kwasów żółciowych w jelitach, następuje około 22-krotny spadek stężenia MFBA w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami typu dzikiego.

Rzeczywiście, podczas gdy silny sygnał fluoru jest wykrywany w pęcherzykach żółciowych myszy typu dzikiego, nie występuje odpowiadający mu sygnał fluoru u zwierząt z deficytem apikalnego sodowo-zależnego transportera kwasów żółciowych, co potwierdza zarówno to, że MFBA są metabolizowane w sposób podobny do fizjologicznych kwasów żółciowych, jak i to, że MRI z użyciem MFBA może być stosowane do wykrywania zaburzeń wchłaniania kwasów żółciowych w jelitach. Po opanowaniu techniki i prawidłowym przeprowadzeniu, laparotomia, pobranie krwi oraz nacięcie pęcherzyka żółciowego i wątroby mogą zostać wykonane w ciągu 20 minut. Akwizycja sygnału podczas MRI trwa od półtorej do dwóch godzin.

Po opracowaniu i komercjalizacji technika ta może utorować drogę do badania roli transportu kwasów żółciowych w jelitach w fizjologii i patologii zarówno u małych zwierząt, jak i u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu podawania kwasów żółciowych znakowanych izotopami obcymi u małych zwierząt oraz metody pomiaru ich wychwytu w wątrobie i pęcherzyku żółciowym za pomocą MRI lub poprzez nacięcie organów.