Name: Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę izolacji i reprogramowania komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów. Technika ta umożliwia generowanie bezpiecznych iPSC bez wirusów, z zastosowaniem w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Fundację CARIPARO Grant numer 13/04 oraz Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant numer 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin i Michela Pozzobon są finansowane przez Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin jest finansowana przez Fundację CARIPARO w ramach grantu nr 13/04. Paolo De Coppi jest finansowany przez Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Wszystkie procedury były zgodne z włoskim prawem. Próbki mysiego AF pobrano od ciężarnych myszy po 13,5 dniu po stosunku (d.p.c.) od myszy C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J zwanych GFP.
1. Produkcja transpozonów
UWAGA: Wektory ekspresji transpozonów zostały wygenerowane przy użyciu standardowych procedur klonowania. Plazmidowe DNA do transfekcji mysich komórek AF przygotowano przy użyciu komercyjnych zestawów.
<ol>
	<li>Wymieszaj 10 ng plazmidowego DNA z 50 μl bakterii DH5α w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Inkubować probówkę do mikrowirówki na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 40 sek.</li>
	<li>Umieść probówkę wirówkową na lodzie na 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 250 μl podgrzanego (37 °C) bulionu lizogenicznego (LB). Wstrząsać (300 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Rozprowadzić 30 μl każdej przemiany na płytkach LB z 0,1 mg/ml ampicyliny. Pozostawić płytki do wyschnięcia i inkubować odwrócone w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia, po południu, wybierz 3 kolonie, używając sterylnych końcówek 200 μl, z każdej transformacji i przenieś na 0,1 mg/ml LB amp.</li>
	<li>Wstrząsnąć (300 obr./min) bakteriami przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Do oczyszczania plazmidu należy używać zestawów komercyjnych. Plazmidy magazynowe w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Hodowla fibroblastów embrionalnych myszy (MEF)
<ol>
	<li>Powlekanie płytek 6-dołkowych 0,1% żelatyną
	<ol>
		<li>Pokryj płytki pod maską, dodając 1 ml sterylnej 0,1% żelatyny do każdej z sześciu studzienek. Pozostawić żelatynę do polimeryzacji w inkubatorze (37 °C) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wyrzuć nadmiar i susz talerze przez 1 godzinę.</li>
		<li>Użyj parafilmu do uszczelniania i przechowywania płytek w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inaktywacja MEF za pomocą mitomycyny C
	<ol>
		<li>Rozmrozić fiolkę zawierającą 4 x 106 komórek MEF w kąpieli o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wysiewać MEF w pokrywie na szalce Petriego (150 mm) z podłożem MEF.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>(UWAGA) Dodaj mitomycynę C (5 mg / ml), gdy komórki się zlewają.</li>
		<li>Umieścić komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) na 3 godziny.</li>
		<li>Usunąć pożywkę za pomocą mitomycyny C. Umyć komórki trzykrotnie solą fizjologiczną z 1x buforem fosforanowym (PBS).</li>
		<li>Dodać 2 ml dostępnej w handlu trypsyny i umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut. Następnie dodaj 18 ml pożywki blokującej, aby zatrzymać reakcję trypsyny.</li>
		<li>Policz ogniwa za pomocą komory burkera zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 145 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Wysiewaj 60 000 komórek/cm2 inaktywowanego MEF na 0,1% płytkach pokrytych żelatyną.</li>
		<li>Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed wysiewem komórek AF i/lub iPS-AF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja komórek AF myszy
<ol>
	<li>Ustaw krycie czasowe i sprawdź zatyczki dopochwowe po 24 godzinach wspólnego trzymania.</li>
	<li>Przestrzegać do godziny 13,5 d.p.c i złożyć ciężarną matkę przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Oczyść ścianę brzucha zwierzęcia za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej, nacinając ścianę brzucha, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej.</li>
	<li>Odsłoń macicę za pomocą kleszczy. Usuń macicę za pomocą nożyczek i przenieś na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną sterylnym 1x PBS umieszczonym na lodzie.</li>
	<li>Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zebrać AF przy 10-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Przytrzymaj macicę kleszczami i usuń ścianę macicy nożyczkami. Należy uważać, aby uniknąć uszkodzenia błon płodowych i wynikającego z tego wycieku płynu owodniowego.</li>
	<li>Zebrać płody na 100 mm szalkę Petriego wypełnioną sterylnym 1x PBS i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Chwyć łożysko jednego płodu cienkimi kleszczami i umieść na czystej szalce Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Usuń woreczek żółtkowy za pomocą cienkich kleszczy</li>.
	<li>Rozbić owodnię za pomocą cienkich kleszczy punktowych i zebrać 30 μl migotania przedsionków dla każdego płodu za pomocą strzykawki insulinowej do stożkowej fiolki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Po pobraniu AF umyj każdy płód sterylnym 1x PBS uzupełnionym 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i zbierz do 15 ml stożkowej probówki zawierającej AF.</li>
	<li>Odwirować AF przy 145 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant pod maską i zasiać granulowane komórki AF.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek AF myszy
<ol>
	<li>Wysiewanie mysich komórek AF
	<ol>
		<li>Na dzień przed wysiewem należy przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą żelatyną o splocie 0,1% z MEF nasączonym mitomycyną C.</li>
		<li>Po pobraniu AF wysiewać komórki uzyskane z amniopunkcji (około 1 x 107 komórek uzyskanych z 6 płodów) na mitotycznie inaktywowany MEF za pomocą pożywki hodowlanej AF.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , zmieniając podłoże co drugi dzień.</li>
		<li>Po 7 dniach hodowli należy przetransfekować komórki AF zgodnie z procedurą opisaną poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Transfekcja, Generacja i Hodowla Komórek iPS-AF
UWAGA: Mysie komórki AF były transfekowane plazmidem transpozonu PB-tetO2-IRES-OKMS, w połączeniu z plazmidem ekspresji transpozazy (mPBazą) i plazmidem transpozonu transkryptonowej z odwrotnym transcykliną (PB-CAG-rtTA). Wszystkie plazmidy zostały dostarczone przez profesora Andrasa Nagya33.
<ol>
	<li>Zmieszać 1 μg PB-tetO2-IRES-OKMS z 0,5 μg mPBazy i 0,5 μg PB-CAG-rtTA (całkowite DNA: 2 μg) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA do 100 μl pożywką bez surowicy (Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM).</li>
	<li>Dodać 8 μl odczynnika do transfekcji (np. FUGENE) (w stosunku plazmidowego DNA:czynnika transfekcji 2 μg (DNA) do 8 μl środka do transfekcji) do 1,5 ml probówki do mikrowirówki zawierającej DNA.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę odczynnika do transfekcji/DNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać kroplami 100 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji/DNA na studzienkę do 6-dołkowej płytki z mysimi komórkami AF i rozprowadzić przez delikatne wirowanie, z końcową objętością 2 ml / basenik. Wyjazd na 24 godziny.</li>
	<li>Następnego dnia indukuj ekspresję czynników Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) poprzez karmienie komórek świeżą pożywką iPS-AF uzupełnioną 1,5 μg/ml doksycykliny (2 ml pożywki na każdą studzienkę).</li>
	<li>Karmić komórki codziennie, bez pasażu, świeżą pożywką zawierającą doks (utrzymywać komórki w pożywce uzupełnionej doksycykliną do ppkt 5.13).</li>
	<li>Obserwuj komórki w ciągu 24 godzin pod kątem ekspresji mCherry i codziennie pod kątem tworzenia kolonii (kolonie zwykle pojawiają się między 20 a 30 dniem po transfekcji).</li>
	<li>Dzień przed pobraniem kolonii należy przygotować 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z MEF potraktowanym mitomycyną C.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl należy pobrać pojedyncze kolonie o objętości 50 μl i przenieść je kolejno na 96-dołkową płytkę w osobnych dołkach.</li>
	<li>Następnego dnia należy rozdzielić każdą kolonię na pojedyncze komórki, dodając 50 μl komercyjnej trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pipetuj w górę iw dół, aby zdezagregować kolonię.</li>
	<li>Przenieść 50 μl trypsyny zawierającej zdysocjowaną kolonię do nowego dołka z inaktywowanym MEF na 0,1% pokrytej żelatyną 96-dołkowej płytce wypełnionej 100 μl świeżej pożywki iPS-AF uzupełnionej doksycykliną.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 60-70% konfluencji, podziel się na studzienkę 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 60-70% konfluencji, podziel 1:2 na dwie studzienki, jedną z doksycykliną, a drugą bez doksycykliny, aby sprawdzić, czy kolonie pojawiają się również w stanie bez doksycykliny.</li>
	<li>Kontynuuj utrzymywanie klonów iPS-AF, niezależnych od doksycykliny, na inaktywowanym MEF w pożywce iPS-AF.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , codziennie zmieniając podłoże.</li>
</ol>
6. Barwienie fosfatazą alkaliczną
<ol>
	<li>Barwienie fosfatazą alkaliczną należy wykonywać zgodnie z protokołem producenta za każdym razem, gdy pojawiają się komórki iPS-AF niezależne od doksycykliny.</li>
</ol>
7. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Za każdym razem, gdy pojawiają się komórki iPS-AF niezależne od doksycykliny, należy wysiać 150 000 komórek/cm2 na dołku 24-dołkowej płytki z inaktywowanym MEF i hodować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>(UWAGA) Utrwal komórki, dodając 300 μl na studzienkę 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 300 μl 0,1% NP-40, aby przepuszczalność komórek.</li>
	<li>Przepłukać komórki 300 μl 0,1% PBS-Tween 20.</li>
	<li>Dodać 300 μl buforu blokującego (10% surowicy końskiej w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Należy stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) i SSEA1 (1:80). Rozcieńczyć SSEA1 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 10% normalną surowicą kozią, 0,3 M glicyną w 0,1% PBS-Tween-20. Rozcieńczyć wszystkie inne przeciwciała 10% surowicą końską w 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować przeciwciała przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać 300 μl 0,1% PBS-Tween-20.</li>
	<li>Użyj przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w 10% surowicy końskiej w 1x PBS: Alexa594-sprzężone kozie anty-mysie IgG (1:200), Alexa594-sprzężone anty-kozie IgG kurczaka (1:200), Alexa594-sprzężone kurczaki anty-królicze IgG (1:200), Alexa568-sprzężone kozie anty-mysie IgM (1:200). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłucz 1x PBS.</li>
	<li>Zabarwić jądra roztworem Hoechsta (1:10 000) w 1x PBS.</li>
</ol>
8. Różnicowanie komórek in vitro
<ol>
	<li>Aby uformować ciała zarodkowe z wiszącymi kroplami (EB), hoduj pojedyncze krople (2000 komórek/20 μl) na pokrywie szalek Petriego, używając pożywki różnicującej.</li>
	<li>Inkubować szalki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 dni.</li>
	<li>Przenieść EB do 100 mm szalek klasy bakteryjnej w kulturze zawiesinowej przez 3 dni w pożywce różnicującej.</li>
	<li>Płytka EB w 24 dołkach pokrytych matrycą membrany podstawnej (rozcieńczonej w stosunku 1:10 w DMEM) przez kolejne 14 dni.</li>
	<li>Do analiz immunofluorescencyjnych należy stosować przeciwciała pierwszorzędowe: T (1:100), αfp (1:200) i Tubb3 (1:500)37.</li>
</ol>
9. Powstawanie potworniaka in vivo
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl 1x PBS zawierającego 1 x 106 komórek iPS-AF do mięśnia kończyny tylnej myszy Rag2-/-γc-/-.</li>
	<li>Ofiaruj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy 6 tygodni po wstrzyknięciu komórek.</li>
	<li>Usuń masy guza, wyróżniające się wielkością, z tylnej kończyny myszy w celu przeprowadzenia następujących analiz.</li>
	<li>Wytnij poprzeczne odcinki guza zamrożonego izopentanem o grubości 7-10 μm za pomocą kriostatu.</li>
	<li>Dla barwienia hematoksyliną i eozyną (HE):
	<ol>
		<li>Wybarwić HE w celu oceny składu tkanki nowotworowej, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla immunoperoksydazy Barwienie:
	<ol>
		<li>Utrwal skrawki potworniaka za pomocą 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepuszczalność 0,1% Triton X-100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować z następującymi przeciwciałami: Tubb3 (1:100), αfp (1:50) i αSMA (1:100) rozcieńczonymi w 1% BSA w 1x PBS. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (dla Tubb3) lub przez noc w temperaturze 4 °C (dla pozostałych przeciwciał).</li>
	<li>Zablokuj peroksydazę za pomocą 100% metanolu przez 20 min.</li>
	<li>Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z mysim HRP (1:150).</li>
	<li>Spłucz 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować z substratem peroksydazy (HRP) (patrz tabela materiałów) przez 5 minut.</li>
	<li>Płukać wodą z kranu przez 5 minut.</li>
	<li>Barwienie hematoksyliną QS przez 9 sek.</li>
	<li>Spłucz wodą z kranu.</li>
</ol>
10. Ekstrakcja RNA z komórek
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta.</li>
</ol>
11. Ekstrakcja RNA z potworniaka
<ol>
	<li>Homogenizować potworniaka za pomocą tłuczka i moździerza oraz ciekłego azotu, aby uniknąć rozmrożenia próbki.</li>
	<li>Zważyć 25 mg tkanki.</li>
	<li>Dodać 1 ml dostępnego w handlu odczynnika do ekstrakcji RNA i 200 μl chloroformu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Wirować przy 13 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 min.</li>
	<li>Przenieść oczyszczony supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Aby oczyścić RNA, użyj dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
12. Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy do odwrotnej transkrypcji (RT) - reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i oligo (dT) zgodnie z protokołem producenta, aby uzyskać 50 ng / μl cDNA. Rozcieńczyć cDNA wodą wolną od RNaz w stężeniu 10 ng/μL.</li>
	<li>Wykonaj RT-PCR przy użyciu polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta, wykorzystując 1 ng/μL cDNA.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda wybrana do uzyskania indukcji pluripotencji ma znaczenie dla klinicznego bezpieczeństwa komórek w odniesieniu do długotrwałego przeszczepiania. Obecnie istnieje kilka metod odpowiednich do przeprogramowania. Wśród metod nieintegracyjnych wektor wirusowy Sendai (SeV) jest wirusem RNA, który może wytwarzać duże ilości białka bez integracji z jądrem zakażonych komórek40 i może być strategią pozyskiwania komórek iPS. Wektory SeV mogą być atrakcyjnym kandydatem do generowania komórek iPS klasy t...

Diagnostyka prenatalna jest ważnym narzędziem klinicznym do oceny chorób genetycznych (np. aberracji chromosomowych, chorób monogenetycznych lub poligenetycznych/wieloczynnikowych) i wad wrodzonych (np. wrodzona przepuklina przeponowa, torbielowate zmiany w płucach, egzomphalo, gastroschisis). Komórki płynu owodniowego (AF) są łatwe do uzyskania dzięki rutynowo planowanym zabiegom w drugim trymestrze ciąży (tj. amniopunkcji i redukcji owodni) lub cesarskim cięciom1,2. Dostępność komórek AF od pacjentów prenatalnych lub noworodkowych daje możliwość wykorzystania tego źródła w medycynie regeneracyjnej, a kilku badaczy zbadało możliwość leczenia różnych uszkodzeń tkanek lub chorób przy użyciu populacji komórek macierzystych wyizolowanych z AF3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Możliwość łatwego pozyskania komórek migotania przedsionków od chorych pacjentów, w oknie czasowym, w którym choroba często jest stacjonarna, otwiera drogę do pomysłu wykorzystania tego źródła komórek do celów przeprogramowania. Rzeczywiście, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) pochodzące z komórek AF mogą być różnicowane w komórkach będących przedmiotem zainteresowania do testów leków in vitro lub do metod inżynierii tkankowej, w celu przygotowania odpowiedniej terapii specyficznej dla pacjenta przed porodem. Wiele badań wykazało już zdolność komórek AF do przeprogramowywania i różnicowania w szeroki zakres typów komórek13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25,26,27.
Od czasu odkrycia przez Takahashiego i Yamanakę28 przeprogramowanych komórek somatycznych poprzez wymuszoną ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych (Oct4, Sox2, cMyc i Klf4), nastąpił postęp w dziedzinie przeprogramowywania. Biorąc pod uwagę różne metody, możemy rozróżnić podejścia wirusowe i niewirusowe. Pierwsza zakłada użycie wektorów wirusowych (retrowirusów i lentiwirusów), które charakteryzują się wysoką skutecznością, ale zwykle niepełnym wyciszeniem transgenu retrowirusowego, co skutkuje zarówno częściowo przeprogramowaną linią komórkową, jak i ryzykiem mutagenezy insercyjnej29,30,31. Metoda niewirusowa wykorzystuje różne strategie: tj. plazmidy, wektory, mRNA, białka, transpozony. Wyprowadzenie komórek iPS wolnych od sekwencji transgenicznych ma na celu obejście potencjalnie szkodliwych skutków nieszczelnej ekspresji transgenu i mutagenezy insercyjnej. Spośród wszystkich wyżej wymienionych strategii niewirusowych, system transpozon/transpozaza PiggyBac (PB) wymaga jedynie odwróconych powtórzeń końcowych flankujących transgen i przejściowej ekspresji enzymu transpozazy do katalizowania zdarzeń insercji lub wycinania32. Przewagą w stosowaniu transpozonów w porównaniu z innymi metodami generowania komórek iPS jest możliwość uzyskania komórek iPS wolnych od wektorów przy użyciu podejścia wektorowego niewirusowego, które wykazuje taką samą skuteczność jak wektory retrowirusowe. Jest to możliwe dzięki bezśladowemu wycięciu zintegrowanego kodowania transpozonów dla czynników przeprogramowujących po nowej przejściowej ekspresji transpozazy w komórkach iPS33. Biorąc pod uwagę, że PB jest wydajny w różnych typach komórek34,35,36,37, jest bardziej odpowiedni do podejścia klinicznego w odniesieniu do wektorów wirusowych i pozwala na produkcję komórek iPS wolnych od kseno, w przeciwieństwie do obecnych protokołów produkcji wirusów, które wykorzystują warunki ksenobiotyczne, system ten jest używany do pozyskiwania komórek iPS z mysiego AF.
Tutaj proponujemy szczegółowy protokół na podstawie już opublikowanych prac, aby pokazać produkcję pluripotencjalnych klonów iPS z mysich komórek AF (komórki iPS-AF)38.

<table><tbody><tr><td>Bakteryjne szalki Petriego 100 mm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Do in vitro różnicowanie</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Dla mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicowej</td></tr><tr><td>Alexa568-sprzężone kozie anty-mysie IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)</td></tr><tr><td>Alexa594-sprzężone przeciwciało anty-kozie kurczaka IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)</td></tr><tr><td>Alexa594-sprzężone z kurczakiem IgG przeciwko królikowi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)</td></tr><tr><td>Alexa594-sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)</td></tr><tr><td>Zestaw fosfatazy alkalicznej&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Fosfataza alkaliczna&nbsp; barwienie</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Do selekcji bakteryjnej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, do rozwiązania blokującego. Rozcieńczony w PBS 1x</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Komórki DH5&alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bakterie do procedury</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> klonowania <tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>Do MEF, mysich komórek AF, komórek iPS-AF i pożywki</td></tr> <tr><td>różnicującejDoksycyklina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Do wyrażania czynników egzogennych</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (1,5 ml)&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.706</td><td>Do produkcji PB&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>Do mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicowej</td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>Do MEF średnie</td></tr><tr><td>Kleszcze drobnopunktowe</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>Izolacja AF</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Używana 0,1%, rozcieńczona w PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>Do roztworu blokującego. Rozcieńczony w PBS 1x</td></tr><tr><td>Hematoxylin QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Detekcja jąder</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Analiza histologiczna potworniaka</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Wykrywanie jąder</td></tr><tr><td>Serum dla koni&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Do roztworu blokującego</td></tr><tr><td>IgG myszy przeciw mysim kozom sprzężonym z HRP</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Przeciwciało drugorzędowe (immunoperoksydaza)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Podłoże peroksydazy</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z igłą (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Procedura amniopunkcji</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Królik poliklonalny IgG</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Do mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicującej</td></tr><tr><td>LB bulion (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Do wzrostu bakterii</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Do mysich komórek AF i iPS-AF średni</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Do różnicowania in vitro. Rozcieńczony w stosunku 1:10 w DMEM</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Blokowanie peroksydazy</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24-dołkowa płytka</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>Do różnicowania in vitro</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa MULTIWELL</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>Do hodowli komórek MEF, myszy AF i iPS-AF</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Królicze poliklonalne IgG</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Dla mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicującej</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>Do roztworu blokującego. Rozcieńczony w PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>Do przepuszczalności komórek. Rozcieńczony w PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Mysi monoklonalny IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>Do RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (roztwór)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, utrwalacz, rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, wolny od Ca2+/Mg2+. Rozcieńczony sterylną wodą w celu uzyskania PBS 1x</td></tr><tr><td>Penicylina - Streptomycyna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Do MEF, mysich komórek AF, komórek iPS-AF i pożywki różnicującej</td></tr><tr><td>Szalka Petriego (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Do hodowli MEF, hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>PiggyBac ekspresja transpozazy plazmid&nbsp;</td><td>Dostarczone przez profesora Andrasa Nagya</td><td></td> <td>laboratory-mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transpozonowy plazmid</td><td>Dostarczone przez profesora Andrasa Nagya</td><td></td> <td>laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>Do oczyszczania plazmidów</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Do oczyszczania</td></tr> <tr><td>plazmidówOdwrócony transaktywator tetracykliny transpozonowy plazmid&nbsp;</td><td>Dostarczone przez profesora Andrasa Nagya</td><td></td> <td>laboratory-rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>Kozia poliklonalna IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Mysz monoklonalna IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>Do RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Poliklonalna</td></tr><tr><td>polimeraza DNA</td> królika <td>IgG Taq Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Pasażowanie kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>Do przepuszczalności komórek, rozcieńczony w PBS 1x</td></tr><tr><td>odczynnik TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>Do ekstrakcji</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> RNA <tr><td>Tubb3&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G712A</td><td>Mysi monoklonalny IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Do przenikania komórek, rozcieńczony w PBS 1x</td></tr><tr><td>&alpha; FP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1368</td><td>mysi monoklonalny IgG1</td></tr><tr><td>&alpha;SMA&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Mysi monoklonalny</td></tr> odczynnik do transfekcji IgG2a <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>Do transfekcji komórek AF</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>Do wykonywania amniopunkcji&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu; l końcówki</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td><td>Do zbierania kolonii bakterii</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 nierdzewne 25U</td><td>Do wykonywania amniopunkcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>Do czyszczenia ściany brzucha ciężarnej matki</td></tr><tr><td>Szalka Petriego do hodowli tkankowych (150 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Do ekspansji MEF</td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>Do inaktywacji MEF</td></tr><tr><td>Płytka MULTIWELL 96 dołków</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>Do hodowli iPS-AF</td></tr></tbody></table>

produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są generowane z mysich i ludzkich komórek somatycznych poprzez wymuszoną ekspresję zdefiniowanych czynników transkrypcyjnych przy użyciu różnych metod. W tym przypadku wyprodukowaliśmy komórki iPS z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach. Wszystkie uzyskane linie komórkowe iPS wykazywały cechy komórek pluripotencjalnych, w tym zdolność do różnicowania się w kierunku pochodnych wszystkich trzech listków rozrodczych in vitro i in vivo. Strategia ta otwiera możliwość wykorzystania komórek z chorych płodów do opracowania nowych terapii wad wrodzonych.

Aby ocenić zdolność do przeprogramowania, komórki AF myszy pobrano z płodów myszy GFP. Komórki przetransfekowano kolistym plazmidem transposonowym PB-tetO2-IRES-OKMS, który w sposób indukowany doksycykliną wykazuje ekspresję czynników Yamanaki (Oct4, Sox2, cMyc i Klf4) połączonych z białkiem fluorescencyjnym mCherry, oraz plazmidami odwrotnym transaktywatoru tetracykliny (PB-CAG-rtTA) wraz z plazmidem ekspresyjnym transpozazy (mPBase). Komórki AF myszy przetransfekowano czynnikami Oct4, K...

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i przeprogramowanie mysich komórek płynu owodniowego za pomocą systemu transpozonów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania. W warunkach terapeutycznych komórki z płodów ludzkich mogą być różnicowane w komórki będące przedmiotem zainteresowania do testowania leków lub inżynierii tkankowej, w celu przygotowania w inny sposób specyficznej terapii pacjenta przed porodem.Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące programowania. System transpozonów jest wydajny w różnych typach komórek. Jest bardziej odpowiedni do podejścia klinicznego w odniesieniu do wektorów wirusowych i umożliwia produkcję komórek IPS wolnych od oksynów.Aby rozpocząć izolację, należy oczyścić ścianę brzuszną zapory przy użyciu 70 procent etanolu. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej, nacinając długość ściany brzucha, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Użyj kleszczy, aby odsłonić macicę, a następnie wyciąć ją nożyczkami.Przenieś macicę do 100-milimetrowego naczynia wypełnionego sterylnym 1xPBS i trzymaj na lodzie. Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym przy 10-krotnym powiększeniu i przytrzymaj ma

the-production-pluripotent-stem-cells-from-mouse-amniotic-fluid-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej.  Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej.  Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Poznaj metodę izolacji i reprogramowania komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów. Technika ta umożliwia generowanie bezpiecznych iPSC bez wirusów, z zastosowaniem w medycynie regeneracyjnej.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Przeglądaj więcej filmów