Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów
28 lutego 2017
W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i przeprogramowanie mysich komórek płynu owodniowego za pomocą systemu transpozonów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania. W warunkach terapeutycznych komórki z płodów ludzkich mogą być różnicowane w komórki będące przedmiotem zainteresowania do testowania leków lub inżynierii tkankowej, w celu przygotowania w inny sposób specyficznej terapii pacjenta przed porodem.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące programowania. System transpozonów jest wydajny w różnych typach komórek. Jest bardziej odpowiedni do podejścia klinicznego w odniesieniu do wektorów wirusowych i umożliwia produkcję komórek IPS wolnych od oksynów.
Aby rozpocząć izolację, należy oczyścić ścianę brzuszną zapory przy użyciu 70 procent etanolu. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej, nacinając długość ściany brzucha, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Użyj kleszczy, aby odsłonić macicę, a następnie wyciąć ją nożyczkami.
Przenieś macicę do 100-milimetrowego naczynia wypełnionego sterylnym 1xPBS i trzymaj na lodzie. Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym przy 10-krotnym powiększeniu i przytrzymaj macicę kleszczami, jednocześnie usuwając ścianę macicy nożyczkami, uważając, aby nie uszkodzić błon płodowych. Zbierz płody do 100-milimetrowego naczynia wypełnionego sterylnym 1XPBS i umieść na lodzie.
Chwyć łożysko jednego płodu cienkimi kleszczami i przenieś je do czystego 100-milimetrowego naczynia. Tutaj ostrożnie wyjmij worek z żółtkiem. Przerwij owodnię za pomocą kleszczy i strzykawki insulinowej, zbierz 30 mikrolitrów płynu owodniowego.
Przenieś płyn do stożkowej fiolki o pojemności 15 mililitrów. Powtórz ten proces dla każdego płodu, za każdym razem zbierając płyn do tej samej fiolki. Następnie umyj każdy płód sterylnym 1XPBS uzupełnionym jednym procentem płodowej surowicy bydlęcej i zbierz go do 15-mililitrowej stożkowej probówki wraz z płynem owodniowym.
Odwirować probówkę o stężeniu 145 razy G przez pięć minut, a następnie pod okapem z przepływem laminarnym usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulowane komórki w dwóch mililitrach pożywki do hodowli płynu owodniowego. Weź jednoprocentową płytkę sześciodołkową pokrytą żelatyną, zawierającą mysie fibroblasty embrionalne lub MEF traktowane myomycyną-C, a następnie umieść na niej dwa mililitry komórek.
Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla, zmieniając podłoże co drugi dzień. Kontynuuj hodowlę przez siedem dni, aż komórki będą gotowe do transfekcji. Aby rozpocząć transfekcję, w probówce mikrowirówki z jednym punktem i pięcioma milimetrami, wymieszaj jeden mikrogram plazmidu transpozonu z pięcioma mikrogramami plazmidu ekspresji transpozazy w punkcie zerowym i pięcioma mikrogramami w punkcie zerowym plazmidu transaktywatora transcykliny odwrotnej.
Rozcieńczyć do 100 mikrolitrów za pomocą d-man. Dodać osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji do probówki mikrowirówki zawierającej DNA. Inkubuj tę mieszankę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Biorąc sześciodołkową płytkę z mysimi komórkami AF, kroplami dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny DNA środka transfekcji na studzienkę, rozprowadzając przez delikatne wirowanie z końcową objętością dwóch mililitrów na studzienkę. Pozostaw komórki na 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach dwutlenku węgla. Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną, a następnie nakarm każdą studzienkę komórek dwoma mililitrami świeżej pożywki iPS AF uzupełnionej jednym punktem pięć mikrogramów na mililitr doksycykliny w celu wywołania ekspresji czynników Yamanaki.
Codziennie karmić komórki świeżą pożywką zawierającą doks bez przechodzenia od tego punktu. Obserwuj komórki pod mikroskopem florescencyjnym w ciągu 24 godzin od pierwszego leczenia doksycykliną, aby poszukać ekspresji mCherry i codziennie od tego momentu pod kątem tworzenia kolonii. Po zaobserwowaniu tworzenia się kolonii należy pobrać pojedyncze kolonie do 50 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych.
Następnie przenieś je kolejno do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z MEF traktowanym mytomycyną c. Następnego dnia dodaj 50 mikrolitrów trypsyny do każdej studzienki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdysocjować kolonie na pojedyncze komórki. Po inkubacji odpipetować ciecz w górę iw dół, aby jeszcze bardziej zdezagregować kolonie.
Przenieś 50 mikrolitrów mieszanki komórek trypsyny do nowej studzienki zawierającej inaktywowany MEF, a następnie zwróć komórki do inkubatora. Gdy komórki osiągną 60 do 70 procent konfluencji, podziel je na nową studzienkę z 24-dołkową płytką, a następnie kontynuuj inkubację w temperaturze pokojowej. Gdy komórki te osiągną 60 do 70 procent konfluencji, przerzuć komórki od jednej do dwóch studzienek, jednej zawierającej doksycyklinę, a drugiej bez, aby sprawdzić, czy kolonie będą również rosły przy braku doksycykliny.
Kontynuuj utrzymywanie kolonii IPS AF i pożywki niezależnej od doksycykliny na inaktywowanym MEF w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki będą gotowe do barwienia, obrazowania i ekstrakcji RNA. W tym przypadku stabilne, niezależne od doksycykliny indukowane owodniowe komórkowe GFP myszy wykazują ekspresję markerów opłucnej wymaganych do potwierdzenia pomyślnego przeprogramowania.
Analiza RTPCR z użyciem komórek R1 ES jako kontroli wykazała ekspresję indukowanych markerów opłucnej w obecności lub braku doksycykliny. Ekspresję genu porządkowego, mikroglobuliny beta dw, zaobserwowano również we wszystkich trzech typach komórek. Potworniaki wyizolowane od myszy, którym wstrzyknięto indukowane komórki pleuropotencjalne, wybarwiono immunologicznie.
Wykrycie białka alfa płodu, aktyny mięśni gładkich alfa i tubuliny beta trzy w masach potwierdza różnicowanie komórek we wszystkich trzech listkach zarodkowych, ektodermie, mezodermie i endodermie. Ponadto analiza RTPCR ciał zarodkowych in vitro i komórek potworniaka in vivo potwierdza ekspresję genów markerowych specyficznych dla listka rozrodczego dla mezodermy, endodermy i ektodermy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i przeprogramowywać mysie komórki płynu owodniowego.
Jest to prosta, bezpieczna procedura, którą można zastosować również do komórek ludzkiego płynu owodniowego z próbki uzyskanej z rutynowej diagnostyki lub cesarskiego cięcia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na generowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy z wykorzystaniem niewirusowego systemu transpozonowego. Technika ta jest korzystna ze względu na łatwość użycia oraz potencjalne zastosowania terapeutyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
- Technologia transpozonów
Wstęp
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) mogą być pochodzić z różnych typów komórek.
- Komórki z płynu owodniowego stanowią nieinwazyjne źródło do generowania iPSCs.
- Systemy transpozonowe oferują bezpieczniejszą alternatywę dla wektorów wirusowych.
- Ta metoda może ułatwić wdrażanie terapii specyficznych dla pacjenta jeszcze przed narodzinami.
Cel badania
- Izolacja i przeprogramowanie komórek z płynu owodniowego myszy.
- Zbadanie wydajności systemu transpozonowego w generowaniu iPSC.
- Ocena potencjału zastosowań terapeutycznych w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Izolacja komórek z płynu owodniowego myszy.
- Zastosowanie niewirusowego systemu transposonowego do reprogramowania.
- Charakterystyka wygenerowanych iPSC.
- Ocena potencjału różnicowania pod kątem zastosowań terapeutycznych.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie iPSC z komórek płynu owodniowego myszy.
- Wykazana wydajność systemu transpozonowego w różnych typach komórek.
- Potencjał do zastosowań klinicznych w terapiach specyficznych dla pacjenta.
- Produkcja iPSC wolnych od eksonu, co zwiększa bezpieczeństwo w zastosowaniach terapeutycznych.
Wnioski
- System transpozonowy jest skuteczną metodą generowania iPSC.
- Podejście to może prowadzić do postępów w medycynie regeneracyjnej.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania pełnego potencjału terapeutycznego tej metody.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda przeprogramowania oparta na transpozonach umożliwia generowanie specyficznych dla pacjenta iPSC z płynu owodniowego, oferując niewirusowe, możliwe do zastosowania klinicznie podejście do prenatalnego modelowania chorób i przesiewu terapeutycznego. Poprzez wytwarzanie iPSC wolnych od ekzyn, zdolnych do różnicowania trójliniowego, technika ta wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach medycyny regeneracyjnej. Jej prostota i skalowalność sprawiają, że stanowi ona wielokrotnie wykorzystywalną platformę dla przepływów pracy na etapie odkryć, skoncentrowanych na terapiach wad wrodzonych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów chorobowych z wykorzystaniem genetycznie dopasowanych ludzkich komórek płodowych w celu testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odnawialny system komórkowy pochodzący od pacjenta do walidacji oddziaływania na cel w kontekście istotnym dla danej choroby.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w fazie przedklinicznej poprzez generowanie kontroli izogenicznych z iPSC pochodzących z płynu owodniowego do analizy szlaków sygnalizacyjnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Umożliwia wytwarzanie zestandaryzowanych linii iPSC odpowiednich do wysokoprzepustowego przesiewania związków celujących w szlaki rozwojowe.
- Wyniki ilościowe: Pozwala na mierzalne odczyty różnicowania we wszystkich trzech listkach zarodkowych w celu określenia odpowiedzi na dawkę oraz profilowania fenotypowego.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Tworzy skalowalny, niewirusowy system reprogramowania, który można zaadaptować do wielu modeli chorób i kampanii przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: Ułatwia tworzenie modeli potworniaków in vitro i in vivo w celu oceny potencjału różnicowania oraz profili bezpieczeństwa.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki spójnej ekspresji markerów warstw zarodkowych w ciałach embrionalnych i potworniakach.
- Minimalizacja ryzyka: Redukuje zmienność biologiczną poprzez wykorzystanie klonalnych linii iPSC niezależnych od doksycykliny w celu zapewnienia powtarzalności badań przedklinicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, wspierając walidację celów terapeutycznych poprzez wykorzystanie modeli komórkowych istotnych dla danej choroby oraz umożliwiając identyfikację związków wiodących za pomocą testów opartych na różnicowaniu. Wspiera ona badania przedkliniczne, dostarczając skalowalnych i scharakteryzowanych źródeł iPSC do badań mechanistycznych oraz oceny bezpieczeństwa. Jako niewirusowa platforma reprogramowania oferuje ona możliwość ponownego wykorzystania na poziomie przedsiębiorstwa w wielu projektach wymagających pluripotencjalnych komórek specyficznych dla pacjenta.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych przy użyciu iPSC pochodzących z płynu owodniowego, które odzwierciedlają genetyczne tło płodu.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne źródła komórek z mierzalną różnicowaniem w kierunku listków zarodkowych do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki, w tym ekspresję markerów specyficznych dla listków zarodkowych oraz tworzenie potworniaków do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od ciał embrionoidalnych in vitro do modeli potworniaków in vivo, potwierdzając zdolność do różnicowania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako standaryzowana, niewirusowa metoda reprogramowania, którą można zastosować w różnych modelach chorób wrodzonych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu dzięki modelom iPSC dopasowanym genetycznie i istotnym dla danej choroby, z udowodnioną pluripotencją.
- Wartość operacyjna: Oferuje prosty, niewirusowy proces roboczy o wysokiej powtarzalności i minimalnych ograniczeniach w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnej biologicznej redukcji ryzyka celów terapeutycznych w kontekście chorób prenatalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów dotyczących wad wrodzonych z uwzględnieniem ryzyka, z wykorzystaniem przedklinicznych modeli pochodzących od pacjentów.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, transfekcji oraz charakteryzacji pluripotencji.
- Zależne od dostępu do próbek płynu owodniowego i odpowiednich systemów komórek karmicielek (MEF).
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów indukcji i odstawienia doksycykliny w celu walidacji linii klonalnych.
- Obejmuje tworzenie teratomów i barwienie warstw zarodkowych w celu potwierdzenia funkcjonalnej pluripotencji.
- Ograniczone dostępnością próbek z okresu ciąży oraz kwestiami etycznymi związanymi z wykorzystaniem tkanek płodowych.
