Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo
6 października 2016
Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.
Ogólnym celem tej metody jest długoterminowe obrazowanie pojedynczych komórek w nienaruszonym płucach z wysoką rozdzielczością przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazującego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad rakiem, takie jak rodzaje oddziaływań zachodzących między zwouleniem a komórkami nowotworowymi podczas najwcześniejszych etapów przerzutowania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość teoretycznej wizualizacji żywego, nienaruszonego płuca z rozdzielczością pojedynczych komórek przez okres do 12 godzin.
Zacznij od przywiązania 7,6 cm długiego szwu 2-0 do cewnika tchawiczego, 6,35 mm powyżej tulei, za pomocą podwójnego węzła. Następnie nałóż maść do oczu znieczulonej myszy i użyj kremu depilacyjnego, aby usunąć sierść z lewej strony zwierzęcia, od linii środkowej klatki piersiowej do jednej czwartej pleców oraz od pachy do obszaru tuż pod klatką piersiową. Usuń nadmiar preparatu i wysterylizuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.
Następnie wykonaj intubację zwierzęcia. Obwiąż pysk szwem 2-0, pod przednimi zębami. Przenieś zwierzę do obszaru chirurgicznego, uważając, aby nie przesunąć cewników, i włącz respirator.
Podłącz respirator do cewnika tchawiczego. Następnie przymocuj taśmą cewnik do pyska oraz lewą przednią kończynę do cewnika. Po potwierdzeniu braku reakcji na ucisk palca, za pomocą ostrych nożyczek usuń jeden centymetr kwadratowy skóry nad lewą ścianą klatki piersiowej.
Unieś podskórną tkankę tłuszczową gruczołu mlekowego i przypal wszystkie odsłonięte naczynia krwionośne. Następnie wypreparuj tkankę tłuszczową i usuń warstwę mięśniową aż do klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć żyły pachowej u podstawy przedniej kończyny. Użyj pęsety, aby unieść szóste żebro.
Następnie, trzymając ostre nożyczki pod płytkim kątem pięciu stopni, przetnij żebro w pobliżu krawędzi otworu w skórze. Usuń cztery kolejne żebra, aby poszerzyć otwór w klatce piersiowej i odsłonić cały płat płuca. Następnie ostrożnie przenieś mysz na stół obrazujący mikroskopu.
Przy wyłączonej próżni należy napełnić wewnętrzną komorę okna próżniowego roztworem PBS. Odwrócić mysz i umieścić odsłonięte płuco nad okienkiem z szkiełka nakrywowego do obrazowania próżniowego. Powoli włączyć próżnię.
Załóż szelek stabilizujący, wykonany z papieru chłonnego złożonego na pół, dwa razy na klatce piersiowej myszy i przyklej go taśmą do płyty stolika. Następnie przymocuj pulsoksymetr do łapy zwierzęcia. Potem umieść komorę środowiskową na stoliku i włącz ogrzewanie, aby utrzymać mysz w temperaturze fizjologicznej.
Gdy zwierzę znajdzie się w odpowiedniej pozycji, zbliż obiektyw z aperturą numeryczną 25 by 95 do szkiełka nakrywki. W trybie epifluorescencji wyświetl kanał fitzy i ustaw ostrość na tkankę płucną. Następnie napełnij sterylną strzykawkę 100 µL zawiesiny komórek nowotworowych, odłącz strzykawkę z PBS z cewnika żyły ogonowej i podłącz strzykawkę z komórkami nowotworowymi.
Powoli wstrzyknij komórki nowotworowe do żyły ogonowej. Następnie podłącz strzykawkę z PBS do cewnika żyły ogonowej i zlokalizuj komórki nowotworowe w tkance płuc za pomocą okularu mikroskopu. Teraz zastąp strzykawkę z PBS strzykawką zawierającą 100 µL dekstranu z rodamyną i powoli wstrzyknij dekstran myszy poprzez cewnik ogonowy.
Po podaniu dekstranu przeprowadź przemycie 50 µL sterylnego PBS. Następnie wykonaj obrazy w każdym z wcześniej zlokalizowanych miejsc występowania komórek nowotworowych, aby zwizualizować przepływ i integralność naczyń krwionośnych. Dwadzieścia cztery godziny po wstrzyknięciu można zaobserwować pojedyncze komórki nowotworowe wchodzące w interakcje z makrofagami i monocytami w obrębie naczyń.
Stabilność obrazowania jest na tyle wysoka, że możliwe jest pozyskiwanie sekwencyjnych stosów Z (Z-stacks) danego pola i generowanie rekonstrukcji trójwymiarowej. Tutaj przedstawiono mozaikę pól obrazowania o rozmiarze pięć na pięć, obejmującą pole widzenia o szerokości 890 micron, zarejestrowaną w ciągu 205 minut, na głębokości 15 micron poniżej powierzchni płuca pojedynczego ogniska przerzutowego, 12 dni po wtryśnięciu. Pomimo dużego pola widzenia, wysoka rozdzielczość klatek tworzących mozaikę umożliwia uchwycenie zdarzeń podkomórkowych, takich jak mitoza pojedynczej komórki, o czym świadczy rozdzielenie chromosomów.
Dożylne wstrzyknięcie wysokocząsteczkowego dekstranu znakowanego fluorescencyjnie prowadzi do oznakowania światła naczyń krwionośnych; jednak nieoznakowane krążące erytrocyty i leukocyty mogą blokować dekstran. W małych naczyniach włosowatych płuc blokada ta powoduje migotanie sygnału dekstranu oraz utratę ostrości granic naczyniowych. Wysoka stabilność przestrzenna, zapewniona przez ten protokół, umożliwia uśrednianie czasowe kanału krwi bez rozmycia, co pozwala na przywrócenie miejscowych blokad.
Pozostałe kanały sygnałowe można następnie nałożyć na obraz naczyń krwionośnych, aby uzyskać wyraźny widok granic naczyń. Po opanowaniu tej techniki, procedura ta może zająć około godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu ostrożności, by nie przeciąć żadnych dużych naczyń krwionośnych przed ich koagulacją oraz aby całkowicie unikać dotykania tkanki płucnej.
Po zastosowaniu tej procedury można zwizualizować najwcześniejsze etapy dysseminacji i proliferacji komórek nowotworowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania obrazowania intravitalnego w nienaruszonym płucu z wykorzystaniem okna obrazującego stabilizowanego próżniowo. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroskopii wielofotonowej do długoterminowego obrazowania pojedynczych komórek w nienaruszonej tkance płuca w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością, przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazującego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad nowotworami dotyczące interakcji między stromą a komórkami nowotworowymi podczas przerzutowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad nowotworami
Wstęp
- Długotrwałe obrazowanie żywych tkanek jest kluczowe dla zrozumienia oddziaływań komórkowych.
- Mikroskopia wielofotonowa umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.
- Technika ta pozwala na wizualizację nienaruszonego płuca z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Zrozumienie przerzutowania jest niezbędne dla opracowania terapii przeciwnowotworowych.
Cel badania
- W celu wizualizacji oddziaływań między komórkami zrębu a komórkami nowotworowymi.
- W celu lepszego zrozumienia wczesnych etapów przerzutowania.
- W celu przedstawienia metody długoterminowego obrazowania tkanki płuc.
Zastosowane metody
- Mikroskopia wielofotonowa do obrazowania.
- Zastosowanie stabilizowanego próżniowo okna obrazującego.
- Przygotowanie modelu mysiego do obrazowania.
- Zastosowanie środków znieczulających i maści do oczu w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja nienaruszonego płuca przez okres do 12 godzin.
- Uzyskanie obrazów pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości.
- Wnioski dotyczące oddziaływań komórkowych podczas przerzutowania.
- Wykazanie skuteczności metody w obrazowaniu na żywo.
Wnioski
- Metoda ta stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rakiem.
- Obrazowanie długoterminowe może ujawnić kluczowe procesy biologiczne.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej technice w celu uzyskania wglądu w mechanizmy terapeutyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Długoterminowe obrazowanie intravitalne nienaruszonego płuca umożliwia bezpośrednią obserwację wczesnych zdarzeń przerzutowych z rozdzielczością pojedynczych komórek, co wypełnia krytyczną lukę w przedklinicznych badaniach nad rakiem. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wizualizację oddziaływań między guzem a zrębem oraz dynamiki naczyniowej w kontekście fizjologicznie istotnym. Takie spostrzeżenia poprawiają walidację celów terapeutycznych oraz pewność prognostyczną w procesach odkrywania leków w onkologii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację interakcji komórek nowotworowych ze składnikami zrębu w czasie rzeczywistym podczas inicjacji przerzutowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celów poprzez bezpośrednią obserwację fenotypów komórkowych w nienaruszonym tkance.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację kluczowych molekularnych czynników napędzających wczesne zasiewanie przerzutów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty oddziaływań międzykomórkowych, dynamiki błon oraz perfuzji do benchmarkingu testów.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalne warunki obrazowania przez 12 godzin, umożliwiając spójną ocenę efektu działania związków.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych dla przepływów pracy w badaniach wysokoprzepustowych (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie istotności fizjologicznej podczas obserwacji podłużnych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Uzasadnia kryteria przejścia do kolejnych etapów dzięki wizualizacji zdarzeń subkomórkowych, takich jak mitoza i integralność naczyniowa.
- Korelacja z biomarkerami: Umożliwia powiązanie fenotypów obrazowych z potencjalnymi translacyjnymi biomarkerami potencjału metastatycznego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć — od testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną — dostarczając dynamicznych, ilościowych danych na temat procesów metastatycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie interakcji między komórkami zrębu a komórkami nowotworu, które determinują wczesne przetrwanie i wzrost.
- Przesiewanie: Zapewnia ustandaryzowane warunki gotowe do analizy, z ilościowymi odczytami naczyniowymi i komórkowymi do przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia uśrednianie czasowe i rekonstrukcję 3D w celu wyodrębnienia stabilnych sygnałów naczyniowych oraz dynamiki subkomórkowej do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność systemu istotnego dla przebiegu choroby od etapu odkrywania po fazy przedkliniczne, wspierając obserwacje zgodne z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do obrazowania intravitalnego, którą można zastosować w projektach onkologicznych wymagających modeli przerzutów do płuc.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach przerzutowania dzięki bezpośredniej, długoterminowej wizualizacji oddziaływań komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki oknu stabilizowanemu próżniowo oraz kontroli parametrów środowiskowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych, prognostycznych informacji na temat potencjału przerzutowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie obserwowanych efektów przeciwprzerzutowych w nienaruszonej tkance.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii intravitalnej, mikroskopii wielofotonowej oraz przetwarzaniu obrazów w celu rekonstrukcji naczyniowej.
- Zależny od specjalistycznej aparatury, w tym okna obrazowania stabilizowanego próżniowo, komory środowiskowej oraz obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej (high-NA).
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie chirurgii, obrazowania i analizy w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzaniu jej na inne modele nowotworowe lub tła genetyczne.
- Ograniczony techniczną złożonością chirurgii klatki piersiowej oraz potrzebą precyzyjnego dostępu naczyniowego i stabilizacji płuc.
