Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo
6 października 2016
Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.
Ogólnym celem tej metody jest przeprowadzenie długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem; Na przykład, jakie interakcje zapewniają zrąb a komórkami nowotworowymi na najwcześniejszych etapach przerzutów. Główną zaletą tej techniki jest to, że żywe, nienaruszone płuco można teoretycznie wizualizować w rozdzielczości pojedynczej komórki przez okres do 12 godzin.
Zacznij od przywiązania szwu 2-0 o długości trzech cali do cewnika dotchawiczego, ćwierć cala nad tuleją, z podwójnym węzłem. Następnie nałóż maść na oczy znieczulonej myszy i użyj kremu do depilacji, aby usunąć sierść z lewej strony zwierzęcia od linii środkowej klatki piersiowej do jednej czwartej pleców i od pachy do tuż pod klatką piersiową. Usuń nadmiar balsamu i wysterylizuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.
Następnie zaintubuj zwierzę. I zawiąż szew 2-0 wokół pyska, pod przednimi zębami. Przenieś zwierzę na obszar operacyjny, uważając, aby nie przesunąć cewników i włącz respirator.
Podłączyć respirator do cewnika dotchawiczego. Następnie przyklej cewnik do pyska, a lewą kończynę przednią do cewnika. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u stóp, użyj ostrych nożyczek, aby usunąć jeden centymetr kwadratowy skóry powyżej lewej ściany klatki piersiowej.
Podnieś poduszeczkę tłuszczową sutka i kauteryzuj odsłonięte naczynia krwionośne. Następnie wytnij poduszeczkę tłuszczową i usuń warstwę mięśniową w dół do klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć żyły pachowej u podstawy kończyny przedniej. Użyj kleszczy, aby podnieść szóste żebro.
Następnie, trzymając ostre nożyczki pod płytkim kątem pięciu stopni, odetnij żebro w pobliżu krawędzi otworu w skórze. Usuń cztery kolejne żebra, aby poszerzyć otwór w ścianie klatki piersiowej, odsłaniając cały płat płucny. Następnie ostrożnie przenieś mysz na stolik do obrazowania mikroskopowego.
Przy wyłączonym odkurzaczu napełnij wewnętrzną komorę okna próżniowego PBS. Odwróć mysz i umieść odsłonięte płuco nad okienkiem szkiełka nakrywkowego do obrazowania próżniowego. Powoli włącz odkurzacz.
Umieść uprząż krępującą wykonaną z bibuły złożonej na pół dwa razy na klatce piersiowej myszy i przyklej uprząż do płyty scenicznej. Następnie przymocuj pulsoksymetr do łapy zwierzęcia. Następnie umieść komorę środowiskową na scenie i włącz ogrzewanie, aby utrzymać mysz w fizjologicznej temperaturze.
Gdy zwierzę znajdzie się na swoim miejscu, zbliż soczewkę obiektywu o aperturze numerycznej 25 na 95 do szkiełka nakrywkowego. W trybie epifluorescencji view kanał fitzy i ustaw ostrość na tkance płucnej. Następnie załaduj sterylną strzykawkę ze 100 mikrolitrami zawiesiny komórek nowotworowych, wyjmij strzykawkę PBS z cewnika żyły ogonowej i podłącz strzykawkę z komórkami nowotworowymi.
Powoli wstrzyknij komórki nowotworowe do żyły ogonowej. Następnie ponownie podłącz strzykawkę PBS do cewnika do żyły ogonowej i zlokalizuj komórki nowotworowe w tkance płucnej za pomocą okularu mikroskopu. Teraz zastrzykaj strzykawkę PBS strzykawką wypełnioną 100 mikrolitrami dekstranu rodaminy i powoli wstrzyknij dekstran myszy przez cewnik ogonowy.
Po podaniu dekstranu należy przeprowadzić sterylne płukanie PBS o pojemności 50 mikrolitrów. Następnie uzyskaj obrazy w każdej z wcześniej zlokalizowanych lokalizacji komórek nowotworowych, aby uwidocznić przepływ i integralność układu krwionośnego. Dwadzieścia cztery godziny po wstrzyknięciu można uwidocznić pojedyncze komórki nowotworowe wchodzące w interakcję z makrofagami i monocytami w obrębie układu krwionośnego.
Stabilność obrazowania jest taka, że można uzyskać sekwencyjne stosy Z pola i wygenerować trójwymiarową rekonstrukcję. Tutaj pokazano mozaikę pól obrazowania pięć na pięć, obejmującą pole widzenia 890 mikronów, przez 200 i pięć minut, na głębokości 15 mikronów pod powierzchnią płuca pojedynczej zmiany przerzutowej, 12 dni po wstrzyknięciu. Pomimo dużego pola widzenia, wysoka rozdzielczość leżących pod spodem ramek, tworzących mozaikę, umożliwia uchwycenie zdarzeń subkomórkowych, takich jak mitoza pojedynczej komórki, o czym świadczy separacja chromosomów.
Wstrzyknięcie donaczyniowe o dużej masie cząsteczkowej, znakowanego fluorescencyjnie dekstranu, powoduje znakowanie światła naczynia; Chociaż nieoznakowane krążące erytrocyty i leukocyty mogą zamykać dekstran. W małych naczyniach włosowatych płuc ta okluzja powoduje migotanie sygnału dekstranu i utratę definicji w granicach naczyniowych. Wysoka stabilność przestrzenna, zapewniona przez ten protokół, pozwala na uśrednianie kanału krwionośnego w czasie bez rozmycia, przywracając w ten sposób tymczasowe okluzje.
Pozostałe kanały sygnałowe można następnie nałożyć na układ naczyniowy, aby zapewnić wyraźny widok granic naczynia. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby uważać, aby nie przeciąć żadnych dużych naczyń krwionośnych bez ich uprzedniego kauteryzacji i w ogóle nie dotykać tkanki płucnej.
Po tej procedurze można uwidocznić najwcześniejsze etapy rozsiewu i proliferacji komórek nowotworowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać obrazowanie przyżyciowe w nienaruszonym płucu za pomocą okna obrazowania stabilizowanego podciśnieniem. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroskopii wielofotonowej do długoterminowego obrazowania pojedynczych komórek w nienaruszonej tkance płuca w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością, przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazującego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad nowotworami dotyczące interakcji między stromą a komórkami nowotworowymi podczas przerzutowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad nowotworami
Wstęp
- Długotrwałe obrazowanie żywych tkanek jest kluczowe dla zrozumienia oddziaływań komórkowych.
- Mikroskopia wielofotonowa umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.
- Technika ta pozwala na wizualizację nienaruszonego płuca z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Zrozumienie przerzutowania jest niezbędne dla opracowania terapii przeciwnowotworowych.
Cel badania
- W celu wizualizacji oddziaływań między komórkami zrębu a komórkami nowotworowymi.
- W celu lepszego zrozumienia wczesnych etapów przerzutowania.
- W celu przedstawienia metody długoterminowego obrazowania tkanki płuc.
Zastosowane metody
- Mikroskopia wielofotonowa do obrazowania.
- Zastosowanie stabilizowanego próżniowo okna obrazującego.
- Przygotowanie modelu mysiego do obrazowania.
- Zastosowanie środków znieczulających i maści do oczu w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja nienaruszonego płuca przez okres do 12 godzin.
- Uzyskanie obrazów pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości.
- Wnioski dotyczące oddziaływań komórkowych podczas przerzutowania.
- Wykazanie skuteczności metody w obrazowaniu na żywo.
Wnioski
- Metoda ta stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rakiem.
- Obrazowanie długoterminowe może ujawnić kluczowe procesy biologiczne.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej technice w celu uzyskania wglądu w mechanizmy terapeutyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Długoterminowe obrazowanie intravitalne nienaruszonego płuca umożliwia bezpośrednią obserwację wczesnych zdarzeń przerzutowych z rozdzielczością pojedynczych komórek, co wypełnia krytyczną lukę w przedklinicznych badaniach nad rakiem. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wizualizację oddziaływań między guzem a zrębem oraz dynamiki naczyniowej w kontekście fizjologicznie istotnym. Takie spostrzeżenia poprawiają walidację celów terapeutycznych oraz pewność prognostyczną w procesach odkrywania leków w onkologii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację interakcji komórek nowotworowych ze składnikami zrębu w czasie rzeczywistym podczas inicjacji przerzutowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celów poprzez bezpośrednią obserwację fenotypów komórkowych w nienaruszonym tkance.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację kluczowych molekularnych czynników napędzających wczesne zasiewanie przerzutów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty oddziaływań międzykomórkowych, dynamiki błon oraz perfuzji do benchmarkingu testów.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalne warunki obrazowania przez 12 godzin, umożliwiając spójną ocenę efektu działania związków.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych dla przepływów pracy w badaniach wysokoprzepustowych (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie istotności fizjologicznej podczas obserwacji podłużnych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Uzasadnia kryteria przejścia do kolejnych etapów dzięki wizualizacji zdarzeń subkomórkowych, takich jak mitoza i integralność naczyniowa.
- Korelacja z biomarkerami: Umożliwia powiązanie fenotypów obrazowych z potencjalnymi translacyjnymi biomarkerami potencjału metastatycznego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć — od testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną — dostarczając dynamicznych, ilościowych danych na temat procesów metastatycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie interakcji między komórkami zrębu a komórkami nowotworu, które determinują wczesne przetrwanie i wzrost.
- Przesiewanie: Zapewnia ustandaryzowane warunki gotowe do analizy, z ilościowymi odczytami naczyniowymi i komórkowymi do przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia uśrednianie czasowe i rekonstrukcję 3D w celu wyodrębnienia stabilnych sygnałów naczyniowych oraz dynamiki subkomórkowej do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność systemu istotnego dla przebiegu choroby od etapu odkrywania po fazy przedkliniczne, wspierając obserwacje zgodne z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do obrazowania intravitalnego, którą można zastosować w projektach onkologicznych wymagających modeli przerzutów do płuc.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach przerzutowania dzięki bezpośredniej, długoterminowej wizualizacji oddziaływań komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki oknu stabilizowanemu próżniowo oraz kontroli parametrów środowiskowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych, prognostycznych informacji na temat potencjału przerzutowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie obserwowanych efektów przeciwprzerzutowych w nienaruszonej tkance.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii intravitalnej, mikroskopii wielofotonowej oraz przetwarzaniu obrazów w celu rekonstrukcji naczyniowej.
- Zależny od specjalistycznej aparatury, w tym okna obrazowania stabilizowanego próżniowo, komory środowiskowej oraz obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej (high-NA).
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie chirurgii, obrazowania i analizy w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzaniu jej na inne modele nowotworowe lub tła genetyczne.
- Ograniczony techniczną złożonością chirurgii klatki piersiowej oraz potrzebą precyzyjnego dostępu naczyniowego i stabilizacji płuc.
