Name: Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj mikroskopię wielofotonową do długotrwałego obrazowania płuc myszy z rozdzielczością pojedynczych komórek. Ta metoda pozwala badać interakcje między komórkami nowotworowymi a stromą podczas przerzutów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute's Cancer Center grant grant, P30CA013330, R01CA172451 dla JWP i Integrated Imaging Program. Technologia ta została opracowana w Centrum Biofotoniki Gruss-Lipper oraz w Programie Zintegrowanego Obrazowania w Albert Einstein College of Medicine. Wyrażamy uznanie dla wsparcia tych Centrów w tej pracy. Autorzy dziękują Mike'owi Rottenkolberowi, Ricardo Ibagonowi i Anthony'emu Leggiadro z warsztatu mechanicznego Einsteina za ich umiejętne i terminowe wykonanie, laboratorium Matthew Krummela za hojne podzielenie się rysunkami projektów okien, Kevinowi Elicieriemu i Jeremy'emu Bredfeldtowi za ich wiedzę w zakresie mikroskopii i rekomendacje dotyczące wzmacniaczy oraz Allison Harney i Bojanie Gligorijevic za pouczające dyskusje.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie optyczne in vivo o wysokiej rozdzielczości w połączeniu ze znakowanymi fluorescencyjnie znacznikami funkcjonalnymi, takimi jak białka i przeciwciała, znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat kaskady przerzutów. Umożliwiło to bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację parametrów jednokomórkowych i subkomórkowych w komórkach nowotworowych, komórkach gospodarza i ich mikrośrodowisku. To obrazowanie w obrębie guza pierwotnego doprowadziło na przykład do odkrycia dyskretnych mikrośrodowisk, które sprzyjaj...

Obrazowanie optyczne o wysokiej rozdzielczości okazało się kluczowe dla zrozumienia wielu procesów biologicznych, umożliwiając pomiar i ilościowe określenie parametrów jednokomórkowych i subkomórkowych. W badaniach nad rakiem obrazowanie przyżyciowe komórek guza i zrębu doprowadziło do odkrycia wielu interakcji mikrośrodowiskowych 6-11, które są obecne tylko u nienaruszonego zwierzęcia.
Odkrycia dotyczące mikrośrodowisk związanych z wewnątrznaczyniowością i rozprzestrzenianiem się komórek nowotworowych w raku piersi za pomocą obrazowania optycznego in vivo o rozdzielczości pojedynczej komórki doprowadziły nawet do powstania nowych markerów rokowania i odpowiedzi na leczenie u pacjentek z rakiem piersi w wieku 12-16 lat. Najlepszymi dostępnymi technologiami obrazowania do oglądania w głąb nienaruszonych narządów wewnętrznych są metody kliniczne (MRI, PET, CT), które oferują doskonały widok całego narządu i mogą ujawnić patologie jeszcze przed wystąpieniem objawów klinicznych. Nie są jednak w stanie ujawnić najwcześniejszych etapów przerzutów i mechanizmów komórkowych napędzających postęp nowotworu ze względu na brak rozdzielczości pojedynczej komórki. Zanim przerzuty do płuc staną się widoczne w tych modalnościach, są one dobrze ugruntowane i rozprzestrzeniają się. Biorąc pod uwagę szacunki, że 90% rozsianych komórek nowotworowych, które docierają do płuc, albo nie przeżywa 17, albo początkowo pozostaje uśpionych 18, oraz obserwację, że przybywają znacznie wcześniej niż wcześniej oczekiwano 19, obrazowanie najwcześniejszych etapów przybycia i przeżycia staje się kluczowe dla zrozumienia procesu wysiewu przerzutów i nawrotu wzrostu guza w odległych miejscach.
Przeprowadzenie tych obserwacji w płucach okazało się jednak niezwykle trudne; zdecydowana większość badań obrazowych wykorzystywała preparaty ex vivo lub eksplantacyjne 20-23, które dają wgląd w płuca tylko w pojedynczych punktach czasowych. Chociaż preparaty te dostarczają użytecznych informacji, nie dają pełnego zrozumienia interakcji, związków przyczynowo-skutkowych oraz dynamiki zachodzących między różnymi składnikami mikrośrodowiska. Brak prawidłowego układu krążenia (i towarzyszące mu zachwianie homeostazy) oraz odłączenie od reszty układu odpornościowego organizmu skłania do walidacji wniosków, jakie preparaty te generują w nienaruszonej tkance in vivo.
Wiele grup przeprowadziło obrazowanie śródżyciowe nienaruszonego płuca 2,4,5,24-33, przy czym Wearn i German jako pierwsi chirurgicznie odsłonili warstwę opłucnową 24, a Terry jako pierwsi wykorzystali wszczepialne okno obrazowania 25.
Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w płucach jest znacznie utrudnione przez ciągły ruch płuc i opracowano kilka technik, aby przezwyciężyć to ograniczenie. Wagner i Filley (27) badali naturalny ruch płuc psów i zaprojektowali swój protokół chirurgiczny, aby zlokalizować wszczepione okno w stosunkowo nieruchomym obszarze, podczas gdy Wagner wykorzystał podciśnienie w swoim przygotowaniu chirurgicznym do unieruchomienia tkanki 28. Od tego czasu do obrazowania płuc stosuje się różne techniki, w tym: zaciskanie oskrzeli, sekwencyjny bezdech i obrazowanie bramkowane, akwizycja nadpróbkowana, klejenie płata płuc i próżnia 34. Każda z nich ma swoje zalety i wady i żadna technika nie okazała się lepsza od innych 34. Na przykład zaciskanie oskrzeli i sekwencyjny bezdech zmieniają normalną wymianę gazów w płucach i mogą powodować niedodmę. Obrazowanie bramkowane i akwizycja z nadpróbkowaniem nie mają tych wad, ale wymagają szybkiego lub specjalistycznego sprzętu do obrazowania, który nie jest powszechnie dostępny. Wreszcie, zarówno klejenie płuc, jak i technika próżniowa pozwalają uniknąć obu wyżej wymienionych wad, ale mogą wykazywać obrażenia wywołane siłą ścinającą, jeśli nie zostanie zachowana ostrożność. W ostatnich latach okno próżniowe zostało zminiaturyzowane i przystosowane do stosowania u myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej 4,5,33 i uzyskano doskonałe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości 2. Tabela 1 podsumowuje tę bogatą historię i podkreśla te prace, które opisują nowatorskie postępy w stosowaniu okien obrazowania płuc w trybie przyżyciowym.
Ten protokół opisuje użycie rozszerzonej poklatkowej wielofotonowej mikroskopii przyżyciowej do obrazowania przerzutów w żywym, nienaruszonym płucu z najwyższą możliwą rozdzielczością subkomórkową. Obrazy są pozyskiwane przez okres do 12 godzin za pomocą mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w obiektyw o dużej aperturze numerycznej i detektory z wieloma lampami fotopowielaczy (PMT). Transgeniczne modele myszy są wykorzystywane do fluorescencyjnego znakowania natywnych makrofagów wraz z fluorescencyjnym dekstranem o wysokiej masie cząsteczkowej i transfekowanymi komórkami nowotworowymi z białkiem fluorescencyjnym (w celu znakowania odpowiednio naczyń krwionośnych i komórek nowotworowych). Chociaż ten wybór komórek znakowanych fluorescencyjnie umożliwia wizualizację interakcji i dynamiki komórek nowotworowych-śródbłonka-makrofagów, protokół ten będzie działał dla każdego szczepu myszy fluorescencyjnej lub niefluorescencyjnej. Po nabyciu szczątkowy ruch dryfu (jeśli występuje) jest eliminowany za pomocą wtyczki Fiji 35,36 i niestandardowych makr, które uśredniają czas kanału naczyniowego, aby wyeliminować spowodowane przez nieznakowane krążące krwinki.
Chociaż ten protokół skupia się na obrazowaniu przerzutów, techniki te mają zastosowanie do wielu innych procesów biologicznych, które można obserwować za pomocą obrazowania pojedynczych komórek w płucach w wysokiej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>Niklowany mosiężny regulator podciśnienia 1/8 NPT żeński, z manometrem, 0 - 20" Hg Vacuum</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>Regulator podciśnienia</td></tr><tr><td>Mosiężny adapter do węża z zadziorami do węża 1/4 "ID X 1/8" NPTF Rura męska</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Adapter węża regulatora podciśnienia</td></tr><tr><td>Kolby filtrujące marki Pyrex z rurką; Szyjka obrabiana do korka gumowego nr 4; Pojemność: 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>Kolba próżniowa</td></tr><tr><td>Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe Grubość #1,5, 0,16 - 0,19 mm Średnica 10 mm&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Szkiełka nakrywkowe Jednorazowe</td></tr><tr><td>cewniki dożylne Exel Safelet; 22 g x 1 cal.&nbsp;</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>Cewnik dotchawiczy</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Czarne plecione jedwabne szwy, ETHICON LIGAPAK Szpula dozująca Rozmiar 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Sznurek</td></tr><tr><td>Super Glue w płynie, przezroczysty, 0.14 uncji</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Klej cyjano-akrylowy</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian tetrametylorodaminy&ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD</td></tr><tr><td>Laboratoryjne przezroczyste rurki PVC Tygon, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Grubość ścianki, 25 stóp długości</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>Cienkie rurki i Rurka do</td></tr><tr><td>rurek polietylenowych odpornych na pękanie Luer, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Grubość ścianki, Biała, 50 ft. Długość&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>Grube rurki</td></tr><tr><td>Balsam depillacyjny</td><td></td> <td>Nair-Micro</td><td></td></tr> <tr><td>Rurki medyczne 95 Twardość LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Rurka do cewnika do żył ogonowych</td></tr><tr><td>30 G x 1 cal. Igła BD PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305128</td><td>Igły do cewnika do żył ogonowych</td></tr><tr><td>Puritan Niesterylne waciki z końcówką bawełnianą&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta rura z zadziorem z poliwęglanu, redukcyjna prosta do rury 3/32" x 1/16" ID</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Łączniki między rurkami</td></tr><tr><td>Jednootworowe gumowe korki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-135F</td><td>Korek do termosu</td></tr><tr><td>SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-100, 100 i mikro; l</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>Końcówka do pipet</td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>008897</td><td>Maść okulistyczna</td></tr><tr><td>Gemini Aparat</td><td>Harvard</td><td>726067</td><td>Długopis do kauteryzacji</td></tr><tr><td>Graefe Micro kleszcze preparacyjne; Ząbkowane; Niewielka krzywa; 0.8 mm Szerokość końcówki; Długość 4 "</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Kleszcze</td></tr><tr><td>Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjne 4 "proste ostre/ostre 24 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>Ostre nożyczki</td></tr><tr><td>do mikro preparacji 4" proste /</td><td>Roboz Chirurgiczne</td><td>RS-5980</td><td>nożyczki</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>uprząż</td></tr><tr><td>PhysioSuite System</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Vitals Monitor</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka z tuberkuliną Końcówka poślizgowa</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki</td> z<td>cyjanu akrylanu</td><td>LOC1647358</td><td>Klej nakrywkowy</td></tr><tr><td>Wazelina Fisher</td><td>Scientific</td><td>19-086291</td> Adapter <td>bariery wodnej</td></tr><tr><td>Luer Cannulla 1,5 - 2,2 mm</td><td>Aparat Harvard</td><td>734118</td><td>Złącze cewnika</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT pulsoksymetr</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Pulsoksymetr</td></tr><tr><td>Isoethesia (izofluran)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Zawór kulowy PVC, wciskany do podłączenia, 1/4 cala</td><td>Grainger</td><td>Zawór próżniowy 3CGJ7</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator dla małych zwierząt</td><td>Aparat Harvard</td><td>683</td><td>Alternatywa jest dostępna w Kent Scientific: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Zredukowana surowica</td><td>Medium ThermoFisher Scientific</td><td>31985062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J</td><td>Myszy Jackson Laboratory</td><td>026051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Alternatywa dla niestandardowego zakresu</td></tr><tr><td>Obudowa środowiskowa</td><td>Precyzyjna komora z tworzywa sztucznego</td><td>dla FV1000</td><td>Alternatywa dla niestandardowej obudowy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy miernik mocy</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxIITOP</td><td></td></tr><tr><td>Głowica miernika mocy lasera</td><td>Koherentny</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Koniczyna Fluorescencyjny wektor białkowy</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 Siarczan Selektywny antybiotyk</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Fluorescencyjno-aktywowany sorter komórek&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td></td></tr><tr><td>40 &mikro; m Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Płytka dołkowa</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Naczynie</td><td>hodowlane Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynie hodowlane</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Mysz</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wyciera</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Przerzuty do miejsc wtórnych, takich jak płuca, wątroba i kości, to traumatyczne zdarzenie ze śmiertelnością około 90% 1. Spośród tych miejsc płuca są najtrudniejsze do oceny za pomocą przyżyciowego obrazowania optycznego ze względu na ich zamknięte położenie w ciele, delikatną naturę i istotną rolę w utrzymaniu prawidłowej fizjologii. Podczas gdy metody kliniczne (pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i tomografia komputerowa (CT)) są w stanie zapewnić nieinwazyjne obrazy tej tkanki, brakuje im rozdzielczości niezbędnej do wizualizacji najwcześniejszych zdarzeń zasiewu, z pojedynczym pikselem składającym się z prawie tysiąca komórek. Obecne modele przerzutowego wysiewu płuc postulują, że zdarzenia tuż po przybyciu komórki nowotworowej są deterministyczne dla przeżycia i późniejszego wzrostu. Oznacza to, że narzędzia do obrazowania przyżyciowego w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczej komórki 2 są niezbędne do zdefiniowania fenotypów komórek zasiewających i przetestowania tych modeli. Podczas gdy obrazowanie optyczne płuc w wysokiej rozdzielczości zostało przeprowadzone przy użyciu różnych preparatów ex vivo, eksperymenty te są zazwyczaj testami pojedynczych punktów czasowych i są podatne na artefakty i możliwe błędne wnioski z powodu dramatycznie zmienionego środowiska (temperatura, profuzja, cytokiny itp.) wynikającego z usunięcia z jamy klatki piersiowej i układu krążenia 3. Ostatnie prace wykazały, że poklatkowe przyżyciowe obrazowanie optyczne nienaruszonego płuca jest możliwe przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania 2,4,5, jednak typowe czasy obrazowania zostały ograniczone do około 6 godzin. W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania długoterminowego przyżyciowego obrazowania poklatkowego płuc z wykorzystaniem takiego okna przez okres 12 godzin. Sekwencje obrazów poklatkowych uzyskane tą metodą umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie interakcji komórka-komórka, dynamiki błony i perfuzji naczyniowej w płucach. Dalej opisujemy technikę przetwarzania obrazu, która daje bezprecedensowo wyraźny obraz mikrokrążenia płuc.

Aby zademonstrować typ wyników, jakie można osiągnąć za pomocą tej metody, wstrzyknęliśmy komórki guza E0771-LG oznakowane białkiem fluorescencyjnym Clover do żyły ogonowej myszy MacBlue 44 w różnych odstępach czasu przed operacją. Po operacji dożylnie wstrzyknięto dekstran znakowany rodaminą 155 kD w celu oznakowania naczyń krwionośnych, a następnie przeprowadzono obrazowanie poklatkowe.
Podczas obrazowania myszy 24 ...

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ogólnym celem tej metody jest długoterminowe obrazowanie pojedynczych komórek w nienaruszonym płucach z wysoką rozdzielczością przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazującego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad rakiem, takie jak rodzaje oddziaływań zachodzących między zwouleniem a komórkami nowotworowymi podczas najwcześniejszych etapów przerzutowania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość teoretycznej wizualizacji żywego, nienaruszonego płuca z rozdzielczością pojedynczych komórek przez okres do 12 godzin.Zacznij od przywiązania 7,6 cm długiego szwu 2-0 do cewnika tchawiczego, 6,35 mm powyżej tulei, za pomocą podwójnego węzła. Następnie nałóż maść do oczu znieczulonej myszy i użyj kremu depilacyjnego, aby usunąć sierść z lewej strony zwierzęcia, od linii środkowej klatki piersiowej do jednej czwartej pleców oraz od pachy do obszaru tuż pod klatką piersiową. Usuń nadmiar preparatu i wysterylizuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.Następnie wykonaj intubację zwierzęcia. Obwiąż pysk szwem 2-0, pod przednimi zębami. Przenieś zwierzę do obszaru chirurgicznego, uważając, aby nie przesunąć cewników, i włącz respirator.Podłącz respirator do cewnika tchawiczego. Następnie przymocuj taśmą cewnik do pyska oraz lewą przednią kończynę do cewnika. Po potwierdzeniu braku reakcji na ucisk palca, za pomocą ostrych nożyczek usuń jeden centymetr kwadratowy skóry nad lewą ścianą klatki piersiowej.Unieś podskórną tkankę tłuszczową gruczołu mlekowego i przypal wszystkie odsłonięte naczynia krwionośne. Następnie wypreparuj tkankę tłuszczową i usuń warstwę mięśniową aż do klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć żyły pachowej u podstawy przedniej kończyny. Użyj pęsety, aby unieść szóste żebro.Następnie, trzymając ostre nożyczki pod płytkim kątem pięciu stopni, przetnij żebro w pobliżu krawędzi otworu w skórze. Usuń cztery kolejne żebra, aby poszerzyć otwór w klatce piersiowej i odsłonić cały płat płuca. Następnie ostrożnie przenieś mysz na stół obrazujący mikroskopu.Przy wyłączonej próżni należy napełnić wewnętrzną komorę okna próżniowego roztworem PBS. Odwrócić mysz i umieścić odsłonięte płuco nad okienkiem z szkiełka nakrywowego do obrazowania próżniowego. Powoli włączyć próżnię.Załóż szelek stabilizujący, wykonany z papieru chłonnego złożonego na pół, dwa razy na klatce piersiowej myszy i przyklej go taśmą do płyty stolika. Następnie przymocuj pulsoksymetr do łapy zwierzęcia. Potem umieść komorę środowiskową na stoliku i włącz ogrzewanie, aby utrzymać mysz w temperaturze fizjologicznej.Gdy zwierzę znajdzie się w odpowiedniej pozycji, zbliż obiektyw z aperturą numeryczną 25 by 95 do szkiełka nakrywki. W trybie epifluorescencji wyświetl kanał fitzy i ustaw ostrość na tkankę płucną. Następnie napełnij sterylną strzykawkę 100 µL zawiesiny komórek nowotworowych, odłącz strzykawkę z PBS z cewnika żyły ogonowej i podłącz strzykawkę z komórkami nowotworowymi.Powoli wstrzyknij komórki nowotworowe do żyły ogonowej. Następnie podłącz strzykawkę z PBS do cewnika żyły ogonowej i zlokalizuj komórki nowotworowe w tkance płuc za pomocą okularu mikroskopu. Teraz zastąp strzykawkę z PBS strzykawką zawierającą 100 µL dekstranu z rodamyną i powoli wstrzyknij dekstran myszy poprzez cewnik ogonowy.Po podaniu dekstranu przeprowadź przemycie 50 µL sterylnego PBS. Następnie wykonaj obrazy w każdym z wcześniej zlokalizowanych miejsc występowania komórek nowotworowych, aby zwizualizować przepływ i integralność naczyń krwionośnych. Dwadzieścia cztery godziny po wstrzyknięciu można zaobserwować pojedyncze komórki nowotworowe wchodzące w interakcje z makrofagami i monocytami w obrębie naczyń.Stabilność obrazowania jest na tyle wysoka, że możliwe jest pozyskiwanie sekwencyjnych stosów Z (Z-stacks) danego pola i generowanie rekonstrukcji trójwymiarowej. Tutaj przedstawiono mozaikę pól obrazowania o rozmiarze pięć na pięć, obejmującą pole widzenia o szerokości 890 micron, zarejestrowaną w ciągu 205 minut, na głębokości 15 micron poniżej powierzchni płuca pojedynczego ogniska przerzutowego, 12 dni po wtryśnięciu. Pomimo dużego pola widzenia, wysoka rozdzielczość klatek tworzących mozaikę umożliwia uchwycenie zdarzeń podkomórkowych, takich jak mitoza pojedynczej komórki, o czym świadczy rozdzielenie chromosomów.Dożylne wstrzyknięcie wysokocząsteczkowego dekstranu znakowanego fluorescencyjnie prowadzi do oznakowania światła naczyń krwionośnych; jednak nieoznakowane krążące erytrocyty i leukocyty mogą blokować dekstran. W małych naczyniach włosowatych płuc blokada ta powoduje migotanie sygnału dekstranu oraz utratę ostrości granic naczyniowych. Wysoka stabilność przestrzenna, zapewniona przez ten protokół, umożliwia uśrednianie czasowe kanału krwi bez rozmycia, co pozwala na przywrócenie miejscowych blokad.Pozostałe kanały sygnałowe można następnie nałożyć na obraz naczyń krwionośnych, aby uzyskać wyraźny widok granic naczyń. Po opanowaniu tej techniki, procedura ta może zająć około godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu ostrożności, by nie przeciąć żadnych dużych naczyń krwionośnych przed ich koagulacją oraz aby całkowicie unikać dotykania tkanki płucnej.Po zastosowaniu tej procedury można zwizualizować najwcześniejsze etapy dysseminacji i proliferacji komórek nowotworowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania obrazowania intravitalnego w nienaruszonym płucu z wykorzystaniem okna obrazującego stabilizowanego próżniowo. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

long-term-high-resolution-intravital-microscopy-lung-with-vacuum

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

W tym filmie opisujemy obrazowanie trzustki myszy w trybie przyżyciowym przez ustabilizowane okno do długoterminowej wizualizacji dynamiki komórkowej.

Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj mikroskopię wielofotonową do długotrwałego obrazowania płuc myszy z rozdzielczością pojedynczych komórek. Ta metoda pozwala badać interakcje między komórkami nowotworowymi a stromą podczas przerzutów.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Przeglądaj więcej filmów