Name: Model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery krew-siatkówka i testowania potencjalnych leków, takich jak lipoksyna A4, przy użyciu tkanek świni. Ta metoda umożliwia badanie wczesnych zdarzeń w chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) jest doceniany za autentyczną pomoc w dostarczaniu gałek ocznych świni.

Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, gdzie miało to zastosowanie.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę stabilizacyjną z 75% zmodyfikowanym roztworem soli Dulbecco (DMEM), 25% zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS). Dobrze wymieszać, podaszkę i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i sterylizować w autoklawie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed eksperymentem ogrzać PBS do temperatury 37 °C (5 ml na studzienkę).</li>
	<li>Przygotuj 10%, 20% i 30% sacharozy w PBS. Przefiltruj wszystkie roztwory pojedynczo na oddzielnych filtrach 0,22 μm do sterylizacji. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować podstawowy roztwór histaminy w PBS do stężenia 90 mM. Wysterylizuj roztwór, filtrując przez filtr 0,22 μM. Podzielić roztwór na porcje i zachować go w temperaturze -80 °C. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Zrób świeży 4% paraformaldehyd (PFA) w PBS przed eksperymentem. Umieść go na lodzie. 
	Ostrzeżenie: PFA należy przechowywać w dygestoriach i nosić odpowiedni sprzęt ochronny.</li>
	<li>Rozmrozić pożywkę stabilizacyjną (20 ml na siatkówkę). Dodać penicylinę-streptomycynę do końcowego stężenia 100 j./ml. Ogrzać część pożywki (15 ml na siatkówkę) do temperatury 37 °C w inkubatorze przed eksperymentem. Resztę podłoża pozostaw na lodzie.</li>
	<li>Umieść HBSS (10 ml na siatkówkę) na lodzie.</li>
</ol>
2. Kultura organotypowa siatkówki
<ol>
	<li>Przenieść próbki do okapu do hodowli tkankowych. Otwórz muszlę oczną, nacinając wokół soczewki. Za pomocą szczoteczki delikatnie usuń ciało szkliste bez ciągnięcia za siatkówkę. Delikatnie odłącz siatkówkę od krawędzi cięcia za pomocą szczoteczki, aby odsłonić tarczę nerwu wzrokowego. Poostrz nerw wzrokowy brzytwą i uwolnij siatkówkę.</li>
	<li>Przenieś siatkówkę na szalkę Petriego i ostrożnie przepłucz siatkówkę za pomocą zimnego HBSS. Umieścić próbkę w HBSS na lodzie. Wypreparuj tyle siatkówk, ile potrzeba, powtarzając krok 2.1 i ten krok.</li>
	<li>Przetnij siatkówkę na pół symetrycznie za pomocą brzytwy. Delikatnie przenieść próbki na płytkę 6-dołkową z 3 ml pożywki stabilizacyjnej na studzienkę. Pozostawić do zrównoważenia przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z atmosferą zawierającą 5% CO2 .</li>
	<li>Podczas inkubacji na etapie 2.3 przygotować następujące odczynniki: Rozcieńczyć podstawowy roztwór histaminy do pożądanego stężenia (450 μM) w ciepłym podłożu. LXA4 (przechowywany w argonie) rozpuścić w pożywce do końcowego stężenia 250 ng/ml. 
	UWAGA: Podczas pomiaru wpływu LXA4, jedna połowa z pojedynczej siatkówki jest używana do samej histaminy, podczas gdy druga połowa jest używana do histaminy z LXA4.</li>
	<li>Ostrożnie zassać pożywkę stabilizacyjną i dodać przygotowaną pożywkę do każdej studzienki (3 ml na studzienkę). Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
	<li>Próbki należy przepłukać raz w ciepłym, sterylnym PBS.</li>
</ol>
3. Przygotuj próbki do barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Odessać PBS z płytek. Dodać 4% PFA (3 ml na studzienkę) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szybko zassać PFA. Przepłukać próbki jeden raz za pomocą PBS. Przenieść próbki do 10% sacharozy (5 ml na studzienkę) i inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść próbki do 30% sacharozy (5 ml na studzienkę) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Wymieszać jedną część dostępnej w handlu pożywki do zamrażania z dwiema częściami 20% sacharozy, aby uzyskać roboczą pożywkę do zamrażania. Pozostawić w temperaturze 4 °C na noc lub dłużej, aż pęcherzyki powietrza znikną.</li>
	<li>Przenieść próbki do roboczego pożywki zamrażającej i pozostawić do zrównoważenia przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przytnij każdą siatkówkę na prostokąty (około 3 mm na 5 mm).</li>
	<li>Ostrożnie przenieść próbki do roboczego podłoża do zamrażania znajdującego się w cylindrycznym pojemniku (promień około 1 cm x 2 cm wysokość) wykonanym z folii aluminiowej. Upewnij się, że plastry siatkówki są pionowe (zorientowane tak, aby zapewnić przekrój siatkówki po przekrojeniu) i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowuj bloki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Pokrój każdy blok na kriostacie na plastry o grubości 14 μm i zamontuj je na szkiełkach podstawowych. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Jednokrotnie przemyć skrawki 5% buforem fosforanowo-sacharozowym (SPB, 5% sacharozy w PBS, pH 7,4). Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując skrawki w buforze blokującym (5% SPB z 10% normalną surowicą kozią i 0,5% Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować skrawki (na szkiełkach) z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym (GFAP lub MAP2, rozcieńczonym w stosunku 1:500 w buforze blokującym) przez 1 godzinę. Odsysać roztwór. Umyć trzy razy w 5% SPB. Aby zabarwić endogenne IgG, pomiń ten krok.</li>
	<li>Inkubować skrawki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (IgG przeciwko myszy/przeciwko królikowi cyjaniny3/FITC, rozcieńczone w stosunku 1:800 w buforze blokującym) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dokładnie umyj sekcje trzykrotnie 5% SPB. Przygotować próbki do mikroskopii, umieszczając je w podłożu montażowym zawierającym DAPI i przykrywając szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	<li>Za pomocą laserowego mikroskopu konfokalnego rejestruj obrazy przez obiektyw 20X przy identycznych parametrach, takich jak intensywność lasera, wartość wzmocnienia, czas przebywania itp. w różnych grupach. Ustaw długości fal wzbudzenia/emisji dla kanału niebieskiego (do wykrywania DAPI) na 408/447 nm, dla kanału czerwonego (do wykrywania cyjaniny3) na 561/785 nm, a dla kanału zielonego (do wykrywania FITC) na 488/525 nm.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Określ ilościowo procent nieszczelnych naczyń krwionośnych zgodnie z następującymi kryteriami12: Uwzględnij tylko naczynia krwionośne z jądrami komórek śródbłonka w płaszczyźnie przekroju w liczeniu; rozważ nieszczelne naczynie krwionośne, jeśli wykazuje gradient barwienia immunologicznego otaczającego naczynie.</li>
	<li>Aby określić poziom wyrażenia, wybierz obszary zainteresowania i zmierz średnią wartość szarości za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	<li>Aby zmierzyć szerokość procesu, wybierz obszar sekcji, w którym procesy są odrębne (na przykład zewnętrzna warstwa jądrowa, ONL). Następnie wybierz pole optyczne, w którym takie procesy są widoczne i ciągłe. Ustaw podziałkę zgodnie z ustawieniem mikroskopowym, narysuj linię w poprzek procesu i wykonaj pomiar.</li>
	<li>Aby przeanalizować ciągłość procesu, wybierz obszary zainteresowania, zastosuj filtr zwany wariancją, który uwydatnia krawędzie obrazu, zastępując każdy piksel jego wariancją sąsiedztwa, automatycznie dostosuj kontrast i jasność, policz linie i znormalizuj liczbę według obszaru.</li>
	<li>Obliczanie istotności statystycznych za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001. Wykreśl wynik jako średnią ± SEM.</li>
</ol>

<ol><li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3(2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-neural+barrier%3A+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li>
<li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+brain+and+retina%3A+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li>
<li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-retinal+barrier%3A+structure+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).</li>
<li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li>
<li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782(2013).</li>
<li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+image+analysis%3A+concepts%2C+applications+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li>
<li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li>
<li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta%281-42%29+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimer%27s+Dis%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li>
<li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise%3A+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li>
<li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Induces+Alzheimer%27s+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).</li>
<li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvdeef%2C+A+%22Blood-Brain+Barrier+in+Drug+Discovery%3A+Optimizing+Brain+Exposure+of+CNS+Drugs+and+Minimizing+Brain+Side+Effects+for+Peripheral+Drugs%22">Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs</a>. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell%2Fastrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li>
<li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li>
<li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability%3A+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li>
<li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li>
<li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Psychiatry+Neurol%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Sci%22%5BJournal%5D)">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li>
<li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurgery+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li>
<li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta%2C+the+retina%2C+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055(2010).</li>
<li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li>
<li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+topical+indomethacin%2C+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li>
<li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym raporcie przedstawiamy potężny model ex vivo ostrej dysfunkcji BRB siatkówki z wykorzystaniem siatkówki świń. Ten model systemu nie wymaga specjalnych przyrządów i można go łatwo dostosować do większości warunków laboratoryjnych. Jednak, aby uzyskać pomyślny wynik, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kroków. Po pobraniu gałek ocznych ze źródła należy je przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie i jak najszybciej przetworzyć. Gdy analizowany jest efekt leczenia, należy użyć dwóch połówek te...

Coraz więcej dowodów potwierdza istnienie bariery siatkówkowej krwi (BRB)1-5 i jej podobieństwo do bariery krew-mózg (BBB)6,7. Naruszenie bariery krew-mózg jest ściśle powiązane przyczynowo lub jako marker diagnostyczny z przewlekłymi chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera (AD)8,9 i ostrymi stanami, takimi jak majaczenie10. Mechanistyczny wgląd w te patologie i odkrycia potencjalnych celów leków są na ogół utrudnione przez ograniczoną dostępność i złożoność sieciową mózgu. Stworzono alternatywy, takie jak obrazowanie in vivo 11, hodowla organotypowa mózgu12, pierwotne hodowle komórkowe13,14 i systemy kohodowli15. Jednak większość z tych modeli wymaga specjalnych instrumentów, długich okresów eksperymentalnych lub wielu markerów do identyfikacji komórek. Funkcjonalne i strukturalne podobieństwa między BBB i BRB, a także korelacja między dysfunkcjami tych dwóch substancji zostały dowiedzione16-19. Ponadto łatwiejszy dostęp, dobrze zdefiniowane typy komórek i warstwowa struktura pozwoliły dobrze scharakteryzowanej siatkówce stać się oknem na mózg. Tożsamość strukturalna i funkcjonalna BBB i BRB wymaga jeszcze szczegółowego porównania. Jednak patologie siatkówki, zwłaszcza naruszenie BRB, są również ściśle związane z postępem różnych chorób, w tym cukrzycy18-19 i AD21,22. W związku z tym interesujące jest ustanowienie systemu dysfunkcji BRB nie tylko w celu nakreślenia mechanizmu, ale także w celu zbadania potencjalnych leków. W niniejszym raporcie opracowano i przedstawiono protokół umożliwiający dysfunkcję BRB z wykorzystaniem prostego ostrego posiewu siatkówki.
Zwiększona przepuszczalność BBB i zmiany patologiczne podobne do AD zostały stwierdzone w organotypowej hodowli mózgu inkubowanej z histaminą, prozapalnym mediatorem12. Dlatego w prezentowanym systemie histaminę zastosowano do hodowli siatkówki ex vivo w celu wywołania dysfunkcji BRB. Przetestowano siatkówki kilku gatunków, takich jak Mus musculus i Bos Taurus. Ze względu na ich komercyjną dostępność i podobieństwo do tkanki ludzkiej, do dostarczenia przedstawionych tutaj danych wykorzystano świeże gałki oczne świń. Po inkubacji z histaminą i/lub innymi lekami, siatkówki poddano obróbce w celu oceny przez barwienie immunologiczne kilku białek12, takich jak immunoglobulina G (IgG), jeden z głównych składników krwi; kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), dobrze znany marker aktywacji gleju; oraz białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2), specyficzne dla neuronów białko cytoszkieletu niezbędne do składania mikrotubul. Ponadto warstwowa budowa siatkówki pozwala na szczegółową analizę procesów zachodzących w komórkach Müllera i komórkach zwojowych, takich jak zmiany ich szerokości i ciągłości. W związku z tym dostępnych jest kilka dodatkowych parametrów umożliwiających ocenę konsekwencji naruszenia BRB na wczesnym etapie, a także ocenę skutków odwrócenia potencjalnych metod leczenia.
W tym protokole, potencjalne efekty odwrócenia badań przesiewowych leków są oceniane z trzech perspektyw: wycieku naczyń krwionośnych (BV), aktywacji komórek glejowych i uszkodzenia komórek nerwowych. Stosuje się kilka metod kwantyfikacji, na przykład poziom ekspresji pokazany przez intensywność barwienia immunologicznego, pomiar szerokości procesu i ciągłość procesów neuronalnych pokazany przez filtr wzmacniający. Aby lepiej zilustrować metodę i pomóc w interpretacji wyników, do celów demonstracyjnych wybrano lipoksynę A4 (LXA4), związek endogennie syntetyzowany w odpowiedzi na uszkodzenie zapalne i łagodzenie dysfunkcji śródbłonka23.

<table><tbody><tr><td>Technologie DMEM</td><td>Life&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażanie pożywki&nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Przeciwciało</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Przeciwciało</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC sprzężony z osłem anty-króliczym IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 sprzężony z osiołkiem anty-mysi IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>medium montażowe zawierające DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td>Laserowy mikroskop konfokalny <td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td></td> Mikroskop <td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Niskokosztowy, łatwy w użyciu i potężny system modelowy został stworzony do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby poprawić naruszenie bariery siatkówkowej krwi. Wykazano, że czynnik zapalny, histamina, narusza integralność naczyń w hodowanej siatkówce poprzez dodatnie barwienie IgG poza naczyniami krwionośnymi. Wpływ samej histaminy i leków kandydujących do potencjalnych terapii, takich jak lipoksyna A4, ocenia się za pomocą trzech parametrów: nieszczelności naczyń krwionośnych poprzez barwienie immunologiczne IgG, aktywacji komórek Müllera poprzez barwienie GFAP oraz zmiany w dendrytach neuronalnych poprzez barwienie MAP2. Co więcej, warstwowa organizacja siatkówki pozwala na szczegółową analizę procesów zachodzących w komórkach Müllera i komórkach zwojowych, takich jak zmiany szerokości i ciągłości. Chociaż przedstawione dane dotyczą hodowli siatkówki świń, system ma zastosowanie do wielu gatunków. W związku z tym model stanowi wiarygodne narzędzie do badania wczesnych skutków naruszenia integralności naczyń siatkówki na różne typy komórek, a także do oceny potencjalnych kandydatów na leki do leczenia.

Przedstawiamy niskokosztowy, wydajny czasowo i łatwy w obsłudze system do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby chronić przed naruszeniem BRB wywołanym przez histaminę. W siatkówce kontrolnej IgG pozostaje w obrębie naczyń (Rysunek 1A), natomiast po ekspozycji na histaminę wycieka z naczyń krwionośnych (Rysunek 1B), co potwierdza pomyślne utworzenie modelu.
LXA4 wybrano w celu zademo...

Stworzono tani, łatwy w użyciu i potężny system do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby złagodzić naruszenie bariery siatkówki krwi wywołane przez histaminę. Nieszczelność naczyń krwionośnych, aktywacja komórek Müllera i ciągłość procesów neuronalnych są wykorzystywane do oceny odpowiedzi na uszkodzenie i jej odwrócenia za pomocą potencjalnego leku, lipoksy A4.

Model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Ogólnym celem tego modelu siatkówki ex vivo jest przesiewanie leków łagodzących przerwanie bariery krew-nerw. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak przebieg wczesnych zdarzeń oraz sposoby przesiewania leków, które mogą pomóc w leczeniu tych pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest jej niski koszt, łatwość użycia, szybkość oraz elastyczność.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ uzyskanie wiarygodnych i powtarzalnych danych zależy od umiejętności technicznych niezbędnych do przygotowania wysokiej jakości próbek. W niniejszym protokole wykorzystuje się siatkówki świni pozyskane z komercyjnego źródła. Po odebraniu z dostawcy gałki oczne muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub w lodzie i przetworzone tak szybko, jak to możliwe.Rozpocznij sekcję w komorze do hodowli tkanek, wykonując nacięcie wokół soczewki w celu otwarcia torebki oka. Następnie, używając pędzelka, ostrożnie usuń ciałko szkliste, uważając, aby nie pociągać za siatkówkę. Za pomocą pędzelka delikatnie oddziel siatkówkę od krawędzi nacięcia, aby odsłonić tarczę optyczną.Przetnij nerw wzrokowy żyletką i uwolnij siatkówkę. Przenieś siatkówkę do szalki Petriego i ostrożnie przepłucz ją raz, używając zimnego HBSS. Umieść próbkę w HBSS na lodzie.Następnie za pomocą żyletki należy symetrycznie przeciąć siatkówkę na pół. W przypadku konieczności zastosowania zabiegów, jedną połowę siatkówki poddaje się działaniu preparatu, podczas gdy druga połowa tej samej siatkówki musi zostać przetworzona w celu ustalenia poziomu bazowego i skorygowania różnic osobniczych u zwierząt. Próbki należy delikatnie przenieść do płytki sześciodołkowej zawierającej 3 mL medium stabilizującego w każdym dołku.Równoważyć siatkówki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z atmosferą zawierającą 5% carbon dioxide. Po inkubacji ostrożnie odessać medium stabilizujące i dodać do każdej studni trzy mililitry medium zawierającego histaminę oraz LXA4. Inkubować próbki przez kolejną godzinę.Po wypłukaniu ciepłym sterylnym PBS, do każdej studni należy dodać trzy mililitry 4% PFA i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie czasu inkubacji szybko odessać PFA i raz wypłukać próbki buforem PBS. Do studni dodać 10% sacharozy i inkubować od dwóch do czterech godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie należy zastąpić 10%sucrose roztworem 30%sucrose i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Potem wymieszać jedną część komercyjnego medium do mrożenia z dwiema częściami 20%sucrose, aby przygotować robocze medium do mrożenia. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc lub dłużej, aż do czasu zniknięcia pęcherzyków powietrza.Następnego dnia zastąp 30% sucrose roboczym medium do mrożenia i pozostaw je do wyrównania temperatury przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wyrównaniu temperatury przytnij każdą siatkówkę do prostokątów o wymiarach trzech na pięć milimetrów, a następnie zamroź plastry siatkówki, umieszczając je w medium do mrożenia znajdującym się w cylindrze z folii aluminiowej. Upewnij się, że plastry siatkówki są ustawione pionowo, aby po sekcjonowaniu uzyskać przekrój poprzeczny siatkówki, i zamroź je w ciekłym azocie.Każdy blok należy pociąć w kriotomie na plastry o grubości 14 mikronów, a następnie przenieść skrawki na szkiełka przedmiotowe. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia. Barwienie immunocytochemiczne należy rozpocząć od przemycia skrawków 5% buforem fosforanowo-sacharozowym (SPB).Następnie należy zablokować nieswoiste miejsca wiązania, inkubując skrawki w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. W kolejnym kroku inkubuje się skrawki z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym przez jedną godzinę. Po upływie godziny należy odessać roztwór i przemyć skrawki trzykrotnie w 5% SPB.Następnie inkubować przekroje z odpowiadającymi im przeciwciałami wtórnymi przez jedną godzinę, chroniąc je przed światłem. Po trzykrotnym przemyciu przekrojów w 5% SPB, przygotować próbki do mikroskopii, montując je w medium zawierającym DAPI i przykrywając szkiełkami podstawowymi. Na koniec wykonać zdjęcia przy użyciu mikroskopu konfokalnego.Aby zmierzyć szerokość wypustek, należy użyć narzędzia lupy, aby wybrać obszar przekroju, w którym wypustki są obecne, np. zewnętrzną warstwę jądrową. Następnie należy wybrać pole widzenia, w którym takie wypustki są widoczne i ciągłe. Kliknij narzędzie analizy (analyze tool) w menu głównym, a następnie wybierz opcję ustawienia skali (set scale) w podmenu, aby ustawić pasek skali zgodnie z ustawieniami mikroskopu.Wybierz funkcję linii w menu głównym i narysuj linię w poprzek procesu. Kliknij analyze w menu głównym, a następnie click measure w podmenu, aby przeprowadzić pomiar. Aby przeanalizować ciągłość procesu, wróć do menu głównego i użyj funkcji wielokąta, aby zaznaczyć warstwę splotową wewnętrzną jako obszar zainteresowania.Zmierz pole powierzchni, klikając analyze, a następnie measure. Kliknij process, filter, a potem variants, aby uwydatnić krawędzie na obrazie poprzez zastąpienie każdego piksela wariantem z jego sąsiedztwa. Następnie automatycznie dostosuj kontrast i jasność, klikając image, adjust, brightness and contrast, a następnie auto w podmenu.Następnie należy policzyć linie. Na tych obrazach immunoreaktywność IGG jest widoczna na czerwono. W grupach kontrolnych IGG jest ograniczone do naczyń krwionośnych.W grupie histaminowej IgG jest wykrywane poza naczyniami krwionośnymi, gdzie tworzy chmury wycieku zaznaczone przerywanymi okręgami. W grupach traktowanych LXA4 IgG jest ponownie ograniczone do wnętrza naczyń krwionośnych. Dalsza aplikacja LXA4 przywraca funkcję naczyń upośledzoną przez histaminę.Ten histogram przedstawia procent nieszczelnych naczyń krwionośnych w badanych grupach. Na tych obrazach zaprezentowano immunobarwienie na GFAP, które barwi komórki Müllera. Pozytywne barwienie występuje w wypustkach komórek Müllera, w całej siatkówce oraz wokół naczyń krwionośnych.Przedstawiono szerokość wypustek komórek Mullera dla wszystkich grup. Traktowanie samą histaminą lub LXA4 zmniejszyło szerokość wypustek. Jednak w przypadku jednoczesnego zastosowania obu odczynników, szerokość wypustek została przywrócona.Na tych obrazach przedstawiono immunobarwienie dla MAP2. Obserwuje się dodatnie barwienie wypustek oraz ciał komórkowych komórek zwojowych. Przedstawiono gęstość ciągłych, MAP2-dodatnich wypustek komórek zwojowych we wszystkich grupach.Leczenie histaminą zmniejsza ciągłość wypustek dendrytycznych, podczas gdy LXA4 nie wykazuje istotnych efektów. Po opanowaniu techniki eksperyment ten można przeprowadzić w ciągu trzech do pięciu dni, jeśli jest wykonywany prawidłowo, poświęcając pięć minut na sekcję każdej siatkówki oraz sześć minut na podanie preparatu, a następnie wykonując krojenie na skrawki, immunobarwienie i analizę. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest stosowanie świeżej tkanki oraz odpowiednich kontroli.Po zastosowaniu tej procedury można wprowadzić inne metody, takie jak obrazowanie na żywo, aby śledzić w czasie rzeczywistym zmiany poziomu wapnia oraz właściwości mitochondriów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać ten model ex vivo ostrej hodowli siatkówki do wywołania dysfunkcji BRB, oceny uszkodzeń oraz przesiewowania potencjalnych leków. Bardzo dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

an-acute-retinal-model-for-evaluating-blood-retinal-barrier-breach

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tworzenie eksperymentalnych odwarstwień siatkówki o powtarzalnej i trwałej wysokości odwarstwienia, bez krwotoku podsiatkówkowego, jest ważne dla badania patofizjologii utraty komórek fotoreceptorowych w chorobie siatkówki i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Tutaj szczegółowo opisujemy taką metodę.

Model odwarstwienia siatkówki u gryzoni przez podsiatkówkowe wstrzyknięcie hialuronianu sodu

Ten artykuł opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe u myszy. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne siatkówki spowodowane podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym służy do modelowania ludzkich patologii charakteryzujących się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki, umożliwiając naukowcom zbadanie potencjalnych mechanizmów komórkowych i metod leczenia chorób układu...

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Ten protokół ilustruje test transcytozy komórek śródbłonka in vitro jako model do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka poprzez pomiar zdolności ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki do transportu peroksydazy chrzanowej przez komórki w procesach transportu transkomórkowego, w których pośredniczą kaweole.

Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

Opracowaliśmy kilka protokołów do wywoływania uszkodzeń siatkówki lub degeneracji siatkówki u kijanek Xenopus laevis. Modele te dają możliwość badania mechanizmów regeneracji siatkówki.

Generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach Xenopus

Test ochronny został opracowany do monitorowania odporności układu krwionośnego siatkówki na śmierć z powodu urazów związanych z cukrzycą/retinopatią cukrzycową, takich jak stres oksydacyjny i cytokiny.

Test do wykrywania ochrony naczyń krwionośnych siatkówki przed śmiercią związaną z cukrzycą u myszy

Ten protokół modeluje uszkodzenie niedokrwienia siatkówki i reperfuzji w oku myszy poprzez wywołanie niedokrwienia siatkówki poprzez kaniulację przedniej komory i podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego, a następnie normalizację ciśnienia wewnątrzgałkowego w celu zainicjowania reperfuzji.

Indukcja uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki w modelu oka myszy

Opracowano system optyczny służący do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z wykorzystaniem erytrocytów znakowanych FITC oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrążenia za pomocą fosforymetrii wspomaganej laserem. Metoda ta może być wykorzystana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy naczyń, prędkości przepływu krwi oraz napięcia tlenowego.

Wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Poznaj model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery krew-siatkówka i testowania potencjalnych leków, takich jak lipoksyna A4, przy użyciu tkanek świni. Ta metoda umożliwia badanie wczesnych zdarzeń w chorobach neurodegeneracyjnych.

Model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia

Przeglądaj więcej filmów